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Bioengineering

Fabrication de guides d’ondes en mode zéro pour la microscopie à molécule unique à haute concentration

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

ERRATUM NOTICE

Summary

Décrit ici est une méthode de lithographie de nanosphère pour la fabrication parallèle de guides d’ondes en mode zéro, qui sont des réseaux de nanoapertures dans une lame de couverture de microscopie en verre revêtu de métal pour l’imagerie à molécule unique à des concentrations nano- à micromolaires de fluorophores. La méthode tire parti de l’auto-assemblage de cristaux colloïdaux pour créer un modèle de guide d’ondes.

Abstract

En enzymologie de fluorescence à molécule unique, la fluorescence de fond à partir de substrats marqués en solution limite souvent la concentration de fluorophores à des plages pico- à nanomolaires, plusieurs ordres de grandeur inférieures à de nombreuses concentrations physiologiques de ligands. Les nanostructures optiques appelées guides d’ondes en mode zéro (ZMW), qui ont des ouvertures de 100−200 nm de diamètre fabriquées dans un métal conducteur mince tel que l’aluminium ou l’or, permettent l’imagerie de molécules individuelles à des concentrations micromolaires de fluorophores en limitant l’excitation de la lumière visible à des volumes efficaces zéptolitres. Cependant, le besoin d’équipements de nanofabrication coûteux et spécialisés a empêché l’utilisation généralisée des ZMW. En règle générale, les nanostructures telles que les ZMW sont obtenues par écriture directe à l’aide de la lithographie par faisceau d’électrons, qui est séquentielle et lente. Ici, colloïdale, ou nanosphère, la lithographie est utilisée comme une stratégie alternative pour créer des masques à l’échelle nanométrique pour la fabrication de guides d’ondes. Ce rapport décrit l’approche en détail, avec des considérations pratiques pour chaque phase. La méthode permet de faire des milliers de ZMW en aluminium ou en or en parallèle, avec des diamètres et des profondeurs de guide d’ondes finaux de 100−200 nm. Seuls l’équipement de laboratoire commun et un évaporateur thermique pour le dépôt de métaux sont requis. En rendant les ZMW plus accessibles à la communauté biochimique, cette méthode peut faciliter l’étude des processus moléculaires aux concentrations et aux taux cellulaires.

Introduction

Les techniques monomoléculaires telles que le transfert d’énergie de résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) ou la spectroscopie de corrélation de fluorescence à molécule unique (FCS) sont des outils puissants pour la biophysique moléculaire, permettant l’étude des mouvements dynamiques, des conformations et des interactions de biomolécules individuelles dans des processus tels que la transcription1,2,3,la traduction4,5,6,et bien d’autres7. Pour smFRET, la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) est une méthode courante car de nombreuses molécules attachées peuvent être suivies au fil du temps, et l’onde évanescente générée par TIR est limitée à une région de 100−200 nm adjacente à la la lamelle de couverture8. Cependant, même avec cette restriction sur le volume d’excitation, les fluorophores d’intérêt doivent encore être dilués dans des plages pM ou nM afin de détecter des signaux à molécule unique au-dessus de la fluorécence de fond9. Étant donné que les constantes de Michaelis-Menten des enzymes cellulaires se situent généralement dans la plage μM à mM10,les réactions biochimiques dans les études à molécule unique sont généralement beaucoup plus lentes que celles dans la cellule. Par exemple, la synthèse des protéines se produit à 15−20 acides aminés par seconde chez E. coli11,12, tandis que la plupart des ribosomes procaryotes dans les expériences smFRET se traduisent à 0,1−1 acide aminé par seconde13. Dans la synthèse des protéines, les structures cristallines et le smFRET sur les ribosomes bloqués ont montré que les ARN de transfert (ARNt) fluctuent entre les états « hybrides » et « classiques » avant l’étape de translocation ARNt-ARNm14,15. Cependant, lorsque des concentrations physiologiques du facteur GTPase de translocation, EF-G, étaient présentes, une conformation différente, intermédiaire entre les états hybride et classique, a été observée dans smFRET6. L’étude des processus moléculaires dynamiques à des taux et des concentrations similaires à ceux de la cellule est importante, mais reste un défi technique.

Une stratégie pour augmenter la concentration du substrat fluorescent est l’utilisation d’ouvertures de longueur d’onde sous-visibles à base de métal, appelées guides d’ondes à mode zéro (ZMW), pour générer des champs d’excitation confinés qui excitent sélectivement des biomolécules localisées dans les ouvertures16 (Figure 1). Les ouvertures sont généralement de 100−200 nm de diamètre et de 100−150 nm de profondeur17. Au-dessus d’une longueur d’onde de coupure liée à la taille et à la forme des puits (λc ≈ 2,3 fois le diamètre pour les guides d’ondes circulaires avec de l’eau comme milieu diélectrique18),aucun mode de propagation n’est autorisé dans le guide d’ondes, d’où le terme de guides d’ondes en mode zéro. Cependant, un champ électromagnétique oscillant, appelé onde évanescente, en décroissance exponentielle en intensité creuse encore des tunnels à une courte distance dans le guide d’ondes18,19. Bien que similaires aux ondes évanescentes TIR, les ondes évanescentes ZMW ont une constante de désintégration plus courte, ce qui entraîne une région d’excitation efficace de 10−30 nm dans le guide d’ondes. Aux concentrations micromolaires de ligands marqués par fluorescence, seulement une ou quelques molécules sont simultanément présentes dans la région d’excitation. Cette restriction du volume d’excitation et la réduction conséquente de la fluorescence de fond permettent l’imagerie par fluorescence de molécules uniques à des concentrations biologiquement pertinentes. Ceci a été appliqué à de nombreux systèmes20,notamment les mesures FCS de diffusion monoprotéique21,les mesures FRET à molécule unique des interactions ligand-protéine22 à faible affinité et protéine23,et les mesures spectro-électrochimiques des événements de renouvellement moléculaire unique24.

Les ZMW ont été produits en modelant directement une couche métallique à l’aide du fraisage par faisceau d’ions25,26 ou de la lithographie par faisceau d’électrons (EBL) suivie d’une gravure au plasma16,27. Ces méthodes de lithographie sans masque créent des guides d’ondes en série et nécessitent généralement l’accès à des installations de nanofabrication spécialisées, empêchant l’adoption généralisée de la technologie ZMW. Une autre méthode, la lithographie par nanoimpression ultraviolettelift-off 28, utilise un moule à lame de quartz pour presser un gabarit ZMW inverse sur un film de résistance comme un tampon. Bien que cette méthode soit plus rationalisée, elle nécessite toujours EBL pour la fabrication du moule à quartz. Cet article présente le protocole d’une méthode de fabrication par modèle simple et peu coûteuse qui ne nécessite pas d’EBL ou de fraisage par faisceau d’ions et est basée sur un emballage rapproché de nanosphères pour former un masque lithographique.

La nanosphère ou lithographie « naturelle », qui a été proposée pour la première fois en 1982 par Deckman et Dunsmuir29,30,utilise l’auto-assemblage de particules colloïdales monodisperses, allant de dizaines de nanomètres à des dizaines de micromètres31,pour créer des gabarits de motif de surface via la gravure et / ou le dépôt de matériaux. Les réseaux périodiques étendus bidimensionnels (2D) ou tridimensionnels (3D) de particules colloïdales, appelés cristaux colloïdaux, sont caractérisés par une iridescence brillante de diffusion et de diffraction32. Bien que moins largement utilisée que le faisceau d’électrons ou la photolithographie, cette méthodologie de masquage est simple, peu coûteuse et facilement réduite pour créer des tailles d’entités inférieures à 100 nm.

Diriger l’auto-assemblage de particules colloïdales détermine le succès de l’utilisation de cristaux colloïdaux comme masques pour le modelage de surface. Si la taille et la forme des particules sont homogènes, les particules colloïdales peuvent être facilement auto-assemblées avec un emballage hexagonal, entraîné par épuisement entropique33. L’évaporation de l’eau après dépôt est une voie efficace pour sédimenter les particules colloïdales, bien que d’autres méthodes comprennent le trempage-revêtement34,le spin-coating35,le dépôt électrophorétique36,et la consolidation à une interface air-eau37. Le protocole présenté ci-dessous est basé sur la méthode de sédimentation par évaporation, qui était la plus simple à mettre en œuvre. Les interstices triangulaires entre les billes de polystyrène serrées forment des ouvertures dans lesquelles plaquer un métal sacrificiel, formant des poteaux(figure 2 et figure supplémentaire 1). Un bref recuit des perles avant cette étape ajuste la forme et le diamètre de ces poteaux. Les perles sont enlevées, une dernière couche métallique est déposée autour des poteaux, puis les poteaux sont enlevés. Après les deux étapes de dépôt de métaux sur le nanomasque colloïdal, l’élimination des poteaux intermédiaires et la modification de la chimie de surface pour la passivation et l’attache, les réseaux ZMW sont prêts à être utilisés pour l’imagerie à molécule unique. Une caractérisation plus approfondie des propriétés optiques ZMW après fabrication peut être trouvée dans un article d’accompagnement38. Outre un évaporateur thermique pour le dépôt en phase vapeur des métaux, aucun outil spécialisé n’est nécessaire.

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Protocol

REMARQUE: Toutes les étapes peuvent être effectuées dans l’espace de laboratoire général.

1. Nettoyage des lamaux de couverture en verre

  1. Pour fournir une surface propre pour le dépôt par évaporation de particules colloïdales, placez des lamelle de verre borosilicate optique de 24 x 30 mm (épaisseur de 0,16 à 0,19 mm) dans les inserts rainurés d’un bocal de coloration en verre coplin pour le nettoyage.
    REMARQUE: Assurez-vous que les lamures de couverture sont verticales et bien séparées afin que toutes les surfaces soient clairement exposées pendant le processus de nettoyage.
  2. Verser suffisamment d’acétone dans le bocal de coloration pour couvrir les lamaux, placer le couvercle et soniquer pendant 10 min à 40 °C.
  3. Versez l’acétone et rincez les lamaux de couverture en remplissant le pot de coloration avec duH2O distillé et en versant l’eau. Répétez 2 fois de plus.
  4. Répétez la sonication de l’acétone (étapes 1.2 et 1.3) une fois de plus.
  5. Verser suffisamment de KOH de 200 mM dans le bocal pour couvrir les lamelle et soniquer, recouvert, pendant 20 min à 40 °C.
    REMARQUE: Le KOH grave légèrement le verre.
  6. Rincer les lamaux d’encré avec duH2O distillé 6 fois.
  7. Ajouter de l’éthanol pour couvrir les lamaux, ajouter le couvercle et soniquer pendant 10 min à 40 °C.
  8. Rincer les lamaux avec duH2O distillé 3 fois.
  9. Ramassez chaque lamelle au bord à l’aide de pinces douces et séchez les lamelle avec du gazN2. Ne touchez que les bords de la lamelle. Placez chacune des lamelle séchée et nettoyée dans une boîte de Pétri propre.

2. Dépôt par évaporation de billes de polystyrène

  1. Pour créer le masque à cristaux colloïdaux pour le réseau ZMW, centrifuger 50 μL de 1 μm de diamètre, des billes de polystyrène non fonctionnalisées (2,5 % p/v dans l’eau) à 15 000 x g,25 °C pendant 5 min.
    REMARQUE: Avant de pipetter les perles, la solution mère doit être brièvement vortexée au cas où les perles se seraient déposées au fond de la bouteille.
  2. Jetez le surnageant, en laissant le moins d’eau possible.
    REMARQUE: L’eau résiduelle peut modifier les propriétés d’évaporation de la remise en suspension de l’éthanol39,de sorte que l’élimination d’une petite quantité de billes afin d’éliminer toute l’eau est acceptable.
  3. Ressusciter les billes de l’étape 2.2 dans 50 μL de 1:400 TritonX-100:éthanol solvant. Pipetter de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger les perles avec le solvant.
    REMARQUE: TritonX-100: solvant éthanol doit être scellé avec un film de paraffine après utilisation et préparé frais une fois par mois. Les perles ont tendance à adhérer aux côtés d’un récipient en plastique, comme un tube à microcentrifugation, donc pipetter le long des côtés pour s’assurer que toutes les perles sont remises en suspension.
  4. Pour mettre en place une chambre d’humidité pour le dépôt, placez 6 boîtes de Pétri, chacune avec une lamelle de couverture, sur un banc dans une ligne avec des couvercles laissés légèrement entrouvertes. Dans chaque plat, déplacez la lamelle vers la région ouverte afin que les lamelle soient exposées à l’environnement lorsque l’humidité augmente à l’étape suivante.
  5. Placez un hygromètre et un petit ventilateur électrique centré derrière les boîtes de Pétri.
  6. Consigner l’humidité relative (HR) de départ en laboratoire. Remplissez un bécher de 200 mL avec 150−200 mL d’eau d’environ 75 °C et placez-le derrière le ventilateur.
  7. Allumez le ventilateur et couvrez les boîtes de Pétri, le ventilateur, le bécher et l’hygromètre d’un récipient de stockage en plastique transparent renversé (66 cm x 46 cm x 38 cm).
  8. Laissez l’HR dans la chambre s’élever à 70−75%, ce qui prend généralement 5−10 min.
    REMARQUE: Si l’HR ambiante en laboratoire est faible (inférieure à ~ 50%), laissez la chambre atteindre une HR plus élevée, mais pas plus élevée que 80%, pour compenser la perte d’humidité pendant le dépôt (voir ci-dessous).
  9. Lorsque l’HR atteint 70 à 75%, enregistrez l’HR et soulevez légèrement le récipient de stockage en plastique pour placer rapidement des couvercles sur les boîtes de Petri, ce qui empêche le mouillage trop humide des lamdes.
    REMARQUE: La température dans la chambre sera légèrement plus chaude que la température ambiante, généralement de 25−26 °C, à la suite de l’humidification. Si de l’humidité est visible sur les lamelle, les surfaces vitrées sont trop humides. Une boîte à gants commerciale pourrait simplifier cette partie du protocole.
  10. Que l’HR dans la chambre continue de monter à 85%. À ce stade, enregistrez l’HR dans la chambre d’humidité et pipettez 5 μL de la suspension de perles au centre de chaque lamelle.
  11. Fermez la chambre et les boîtes de Pétri après chaque dépôt pour minimiser la perte d’humidité. Visez à terminer les 6 dépôts dans un délai de 2 min.
  12. Enregistrer l’HR dans la chambre après la déposition.
    REMARQUE: L’HR après le dépôt aidera à évaluer à quelle vitesse l’humidité a été perdue pendant le dépôt, ce qui dépend des conditions ambiantes de laboratoire. Pour une course typiquement réussie, la chambre commencera à 85% HR avant le dépôt et se terminera à 70−75% HR après le dépôt.
  13. Laissez les gouttelettes de perles se propager et sécher pendant 5 min.
    REMARQUE: Si les cristaux colloïdaux ont de nombreux trous ou régions multicouches, alors la chambre était probablement trop humide ou sèche, respectivement. Ajuster l’humidité relative à laquelle fermer les boîtes de Pétri et commencer les dépôts (voir la section des résultats pour plus de détails sur l’optimisation).

3. Recuit de perles pour réduire la taille des pores dans le modèle de cristal colloïdal

  1. Pour fournir une surface de température uniforme pour le recuit des billes de polystyrène, qui rétrécit les inter-perles et arrondit les coins des interstices, placez une plaque d’aluminium plate et fraisée sur une plaque chauffante en céramique standard.
  2. Réglez la température de la plaque chauffante à 107 °C, la température de transition vitreuse du polystyrèneà 40.
    REMARQUE: Pour obtenir une température stable et précise, une sonde de thermocouple a été maintenue dans un trou de 2−3 mm de large et de 4−5 mm de profondeur dans la plaque d’aluminium.
  3. Placez une lamelle contenant le gabarit de perle sur la plaque d’aluminium chaud et recuit pendant 20 s (voir la section de discussion pour une explication du temps de fusion).
  4. Après le chauffage, retirez la lamelle de couverture de la plaque d’aluminium et placez-la rapidement sur une autre surface en aluminium à température ambiante pour la refroidir.
    REMARQUE: Il est utile d’avoir les lamelle de couverture suspendues légèrement sur le bord de la plaque ou de fraiser des canaux peu profonds (voir la vidéo d’accompagnement) dans la plaque pour faciliter le ramassage des lamaux de couverture.

4. Nanofabrication de guides d’ondes en aluminium à mode zéro à l’aide du gabarit de cristal colloïdal

  1. En utilisant un dépôt par évaporation thermique ou par faisceau d’électrons, déposez 300 nm de cuivre à 2 Å/s sur le gabarit de cristal colloïdal pour générer des poteaux dans les interstices entre les billes.
  2. Retirez l’excès de métal sur le dessus des perles en appuyant doucement sur la surface avec du ruban adhésif. Décollez lentement le ruban adhésif pour retirer le métal.
    REMARQUE: Quelques petites taches d’excès de métal réfléchissant peuvent rester après la traction du ruban, et celles-ci peuvent souvent être éliminées par un flux de gaz N2. S’il reste d’importantes taches d’excès de métal réfléchissant après la traction du ruban, essayez de tremper les gabarits dans du toluène pendant 2 h pour dissoudre partiellement les billes de polystyrène. Lavez les lamaux avec de l’eau distillée, séchez avecN2,et répétez la traction du ruban adhésif. Le trempage supplémentaire ne doit pas dissoudre complètement les perles, car les perles aident à protéger les poteaux des dommages pendant la traction du ruban adhésif.
  3. Pour dissoudre les billes de polystyrène, placez les modèles de perles dans du toluène et faites tremper pendant la nuit.
    ATTENTION : Les fumées de toluène peuvent être toxiques. Travaillez avec du toluène sous une cagoule bien ventilée et portez de l’équipement de protection individuelle, y compris des gants, des lunettes de sécurité et un sarrau de laboratoire. Le toluène doit être entreposé dans des armoires ventilées désignées pour les liquides inflammables.
  4. Après l’incubation du toluène, rincer les gabarits une fois avec du chloroforme et deux fois avec de l’éthanol. Manipulez soigneusement les lamaux de couverture à ce stade, car les délicats poteaux métalliques de 200−300 nm de haut sont maintenant exposés. Séchez les gabarits avec duN2 et éliminez les polymères résiduels et les contaminants dans un nettoyant à plasma d’oxygène pendant 30 min.
    ATTENTION : Les fumées de chloroforme peuvent être toxiques. Travaillez avec du chloroforme sous une hotte bien ventilée et portez de l’équipement de protection individuelle, y compris des gants, des lunettes de sécurité et un sarrau de laboratoire. Le chloroforme doit être conservé dans des armoires ventilées à l’écart des autres solvants inflammables.
  5. En utilisant un dépôt par évaporation thermique ou par faisceau d’électrons, déposez 3 nm d’une couche d’adhérence en titane à 1 Å/s suivie de 100−150 nm d’aluminium à 4 Å/s autour et au-dessus des poteaux en cuivre.
    REMARQUE: On peut utiliser un revêtement plus épais pour obtenir des guides plus profonds et une meilleure atténuation de la fluorescence de fond, mais cela diminue également le rendement après avoir exposé et dissous les poteaux à l’étape suivante (voir la section de discussion).
  6. Pour dissoudre les poteaux métalliques, tremper les lamaux de couverture dans l’etchant de cuivre (à base d’acide citrique; Table des matériaux) pendant 2 h.
    ATTENTION: L’antchant des métaux peut causer des brûlures de la peau. Travaillez avec des personnes-vêtements sous une hotte bien ventilée et portez un équipement de protection. Lavez-vous soigneusement les mains après la manipulation. L’etchant pour le métal doit être entreposé dans des armoires ventilées désignées pour les liquides corrosifs.
  7. Rincez les lamaux avec de l’eau distillée, séchez avecN2et polissez doucement la surface du revêtement métallique avec du papier à lentilles pour exposer tous les poteaux qui sont encore recouverts de revêtement. Replacez les lamaux de couverture dans un échant en cuivre pendant encore 2 h, puis rincez à nouveau à l’eau distillée et séchez avecN2.
    REMARQUE: Les lames ZMW doivent être stockées dans des boîtes de Pétri couvertes et propres pour les garder exemptes de contaminants.

5. Nanofabrication de guides d’ondes en mode zéro or à l’aide du modèle de cristal colloïdal

REMARQUE : La méthode de fabrication des ZMW en or(figure supplémentaire 1),qui reflète le protocole de fabrication des ZMW en aluminium, est fournie dans cette section.

  1. À l’aide d’un dépôt par évaporation par faisceau thermique ou par faisceau d’électrons, déposer 3 nm d’une couche d’adhérence en titane à 1 Å/s suivie de 300 nm d’aluminium à 4 Å/s.
  2. Retirez l’excès de métal sur le dessus des perles en appuyant doucement sur la surface avec du ruban adhésif. Décollez lentement le ruban adhésif pour retirer le métal.
  3. Pour dissoudre les billes de polystyrène, placez les modèles de perles dans du toluène et faites tremper pendant la nuit.
  4. Après l’incubation du toluène, rincer les gabarits une fois avec du chloroforme et deux fois avec de l’éthanol. Séchez les gabarits avec duN2 et éliminez les contaminants polymères résiduels dans un nettoyant à plasma d’oxygène pendant 30 min.
  5. En utilisant un dépôt par évaporation par faisceau thermique ou par faisceau d’électrons, déposez 100−150 nm d’or à 5 Å/s autour et au-dessus des poteaux en aluminium.
  6. Pour dissoudre les poteaux métalliques, trempez les lamaux de couverture dans de l’aluminium etchant (à base d’acide phosphorique; Table des matériaux) pendant 1 h.
  7. Rincez les lamaux avec de l’eau distillée, séchez avecN2et polissez doucement la surface du revêtement métallique avec du papier à lentilles pour exposer tous les poteaux qui sont encore recouverts de revêtement. Replacez les lamaux de couverture en aluminium pendant 1 h, puis rincez à nouveau à l’eau distillée et séchez avecN2.
    REMARQUE: Les lames ZMW doivent être stockées dans des boîtes de Pétri couvertes et propres.

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Representative Results

L’auto-assemblage des particules colloïdales de polystyrène par sédimentation par évaporation (étapes 2.1 à 2.13) peut produire une gamme de résultats puisqu’il nécessite un contrôle du taux d’évaporation du solvant. Cependant, comme les dépôts sont rapides (10 à 15 min par tour), la procédure peut être rapidement optimisée pour différentes conditions ambiantes de laboratoire. La figure 3A montre un gabarit colloïdal bien formé après dépôt et évaporation. Macroscopiquement, la région des perles est circulaire, avec des bordures définies par un anneau opaque et multicouche de perles. Les régions translucides, mais pas blanches de l’image, sont les zones monocouches souhaitées. La figure 3B montre un gabarit colloïdal qui a été emballé dans un environnement trop humide (80 % d’HR lorsque les boîtes de Pétri étaient fermées). Ces modèles ont tendance à ne pas avoir de limite circulaire propre et ont des vrilles multicouches s’étendant vers l’extérieur. Le dépôt est acceptable et peut être utilisé dans les phases suivantes, mais les trous dans le réseau réduisent le nombre de zones de réseau ZMW utilisables pour l’imagerie à molécule unique. La figure 3C montre un gabarit colloïdal qui a été emballé dans un environnement trop sec (65 % d’HR lorsque les boîtes de Pétri ont été fermées). Ces modèles sont généralement plus petits en diamètre par rapport aux modèles idéaux et bien répartis. Le dépôt peut être utilisé, mais les régions blanches multicouches, qui s’étriquent vers l’intérieur, réduisent la surface utilisable pour l’imagerie. Ainsi, nous ne recommandons pas d’effectuer plus de 6 dépôts à la fois puisque les dépôts vers la fin du processus se prodiront à une humidité plus faible lorsque la chambre est ouverte et fermée. La figure 3D montre le motif arc-en-ciel produit par diffraction de la lumière réfléchie à partir du cristal de polystyrène. Ce modèle peut être utilisé pour confirmer le succès et la qualité de l’emballage en cristal à l’œil nu. La figure 3E,F montre des images de microscopie à force atomique (AFM) de modèles colloïdaux bien emballés. Les défauts entre les grains proviennent du blocage lors de la sédimentation par évaporation41,et des grains distincts peuvent être vus avec un objectif 10x. Ainsi, l’examen des dépôts colloïdaux avec un microscope optique de faible puissance peut également être utilisé pour évaluer l’emballage.

Après dépôt de cuivre sur les gabarits colloïdaux recuits (étape 4.1), le motif de diffraction arc-en-ciel doit encore être visible et rehaussé par le revêtement métallique réfléchissant des sommets des billes(figure 4A,B). Les gabarits perdent le motif de diffraction arc-en-ciel réfléchissant après la traction du ruban scotch (étape 4.2) qui élimine l’excès de cuivre(Figure 4C). La figure 4D,E montre des images AFM d’un champ typique de poteaux de cuivre après dépôt de métal. Les défauts entre les grains cristallins colloïdaux de la figure 3E sont visibles dans les images de poteau de cuivre sous forme de régions plus grandes de cuivre. L’analyse des images de l’AFM montre que, pour une épaisseur de dépôt de cuivre de 300 nm, les poteaux de cuivre éventuels mesurent en moyenne 255 nm(figure 4F)de hauteur et 121 nm de diamètre(figure 4G).

Le dépôt du revêtement en aluminium (étape 4.5) où se trouvaient les billes et au-dessus des poteaux en cuivre, et la dissolution subséquente des poteaux (étapes 4.6 et 4.7) donnent les ZMW en aluminium illustrés à la figure 5A−C. Les défauts entre les grains de cristal colloïdal sont visibles sous forme d’ouvertures plus grandes(figure 5B). La distance moyenne entre les centres ZMW de la figure 5C est de 559 nm, ce qui correspond à l’espacement défini par la géométrie hexagonale d’emballage rapproché des billes de 1 μm Equation 1 (L’utilisation de modèles en polystyrène recuits pendant 20 s donne des guides d’ondes de 118 nm de diamètre(figure 5D,E),compatibles avec les diamètres des poteaux et suffisamment petits pour couper la propagation de la lumière visible. Un profil de hauteur d’un guide d’ondes de la figure 5D montre également qu’il a une profondeur d’environ 120 nm.

Le FRET à molécule unique a été réalisé dans les ZMW pour tester la fonctionnalité(Figure 6A). Un champ typique de ZMW pour l’imagerie est illustré à la figure 6B, qui contient des guides d’ondes >3000 dans un champ de vision de 40 x 80 μm. Les ZMW ont d’abord été passivés à l’aide des protocoles décrits précédemment42,43. En bref, les ZMW en aluminium ont été passivés avec du poly(acide vinylphosphonique) pour recouvrir le revêtement en aluminium, suivis du polyéthylène glycol (PEG) terminé par méthoxy dopé avec du PEG terminé par la biotine pour recouvrir les fonds de verre des ZMW. Les ZMW d’or peuvent être passivés avec du PEG dérivatisé au thiol pour recouvrir le revêtement en or suivi d’un traitement peg similaire pour les fonds de verre. Des chambres d’écoulement, d’environ 20 μL de volume, ont ensuite été construites pour l’imagerie à molécule unique44. L’imagerie FRET à molécule unique des duplex d’ADN a été réalisée comme décrit précédemment38. En bref, 100 pM−1 nM de cyanine-3/cyanine-5 (Cy3/Cy5), des duplex d’ADN biotinylé (longueur de 33 paires de bases) ont été incubés pendant 10 min dans des canaux d’écoulement fonctionnalisés avec de la streptavidine (incubation de 5 min, solution de 0,5 mg/mL). La concentration de macromolécules étiquetées peut être titrée pour atteindre ~ 20% de charge des guides d’ondes avec une molécule, conduisant à <5% de guides d’ondes chargés de plus d’une molécule, basé sur la charge distribuée de Poisson (la plupart des guides d’ondes, ~ 75%, n’auront pas de molécules)45. L’ADN non lié a été emporté par un tampon duplex sans nucléase suivi d’un tampon d’éclairage (0,3 % [p/v] de glucose, 300 μg/mL de glucose oxydase, 120 μg/mL de catalase et 1,5 mM de Trolox [acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthyl-chromane-2-carboxylique]). Des duplex d’ADN non-biotinylés marqués par Cy5 (longueur de 33 paires de bases) étaient présents dans le tampon d’éclairage à 0, 50, 100 et 500 nM sous forme de fluorophores de fond en solution. Des traces de FRET à molécule unique des molécules d’ADN duplex Cy3/Cy5 immobilisées ont été enregistrées avec un microscope TIRF construit sur mesure ajusté aux conditions d’épifluorescence. Les films ont été enregistrés avec un objectif d’immersion dans l’huile 100x à ouverture numérique (NA) de 1,48 avec excitation alternée de 532 nm et 640 nm (exposition de 100 ms) et un séparateur spectral à double vue pour enregistrer simultanément l’émission Cy3 et Cy5 sur une caméra EMCCD (electron-multiplying charge-coupled device). Les traces de FRET à molécule unique avec des agents de blanchiment à une seule étape dans le canal Cy5 étaient détectables à toutes les concentrations de Cy5 ambiante testées(figure 6C−F). En comparaison, les molécules uniques ne seraient détectables que dans l’éclairage TIRF avec pM à de faibles concentrations de fluorophores en solution de nM46.

Figure 1
Figure 1 : Schéma des guides d’ondes en mode zéro. Diagramme du tableau ZMW avec diagramme en coupe étendue d’un seul ZMW sur la droite. Des enzymes d’intérêt marquées par fluorescence uniques (ribosome brun avec cercle rouge pour représenter le colorant fluorescent) chimiquement immobilisées (via l’ARNm dans cet exemple) au fond de verre des ZMW (généralement fonctionnalisés avec du PEG biotinylé) peuvent être imitées avec une configuration typique de microscopie à épifluorescence à base de laser. La lumière d’excitation de 532 nm (flèches vertes) est réfléchie à la limite verre-métal en raison de la petite taille de l’ouverture (diamètre de 100−200 nm), mais une onde évanescente ne se propageant pas et dont l’intensité diminue de façon exponentielle est présente dans le ZMW. Il en résulte une profondeur d’éclairage effective de 10−30 nm (ombrage vert dans l’ouverture). Des ligands fluorescents individuels (ARNt bleus avec des cercles verts comme étiquettes fluorescentes) aux concentrations nM à μM sont ajoutés. Un ligand individuel qui diffuse dans l’ouverture et interagit avec l’enzyme est cétissé sans fluorescence de fond prohibitive. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma de la méthode de modélisation colloïdale mise au point pour fabriquer des réseaux ZMW en aluminium. Les billes de polystyrène, d’un diamètre de 1 μm, sont déposées et auto-assemblées sur une lamelle de verre nettoyée, tel que décrit à la section 2 du protocole. Les billes sont ensuite recuites pour réduire la taille des pores (section 3), suivies du dépôt de cuivre et de la dissolution des perles dans le toluène. L’aluminium est déposé autour et au-dessus des poteaux en cuivre, qui sont ensuite gravés sélectivement pour laisser derrière eux un réseau hexagonal de nanoapertures (section 4). Pour les trois dernières étapes, des vues en coupe transversale sont fournies à droite des vues en plan pour montrer les largeurs et les hauteurs des poteaux en cuivre et des ZMW en aluminium. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Résultats représentatifs des dépôts par évaporation de colloïdes. A) Exemple de dépôt colloïdal optimal. B) Exemple de dépôt colloïdal acceptable dans lequel les conditions étaient plus humides (80 % d’HR) qu’idéales. Des trous dans la monocouche de cristal sont apparents. (C) Exemple de dépôt colloïdal acceptable dans lequel les conditions étaient plus sèches (65 % d’HR) qu’optimales. Les régions monocouches sont légèrement translucides tandis que les zones multicouches sont blanches et opaques (périmètre et stries vers l’intérieur). (D) Un cristal colloïdal éclairé par une lumière blanche pour mettre en évidence la diffraction arc-en-ciel des cristaux. (E) Image AFM (tapping probe AFM in air) d’une monocouche de billes de polystyrène emballées hexagonalement provenant d’un dépôt colloïdal réussi (barre d’échelle = 10 μm). (F) Image AFM élargie de billes emballées (barre d’échelle = 2 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Images macroscopiques et microscopiques de gabarits ZMW après dépôt de cuivre. (A) Image des lames après évaporation physique du cuivre sur le dessus des modèles de perles. (B) Motif de diffraction arc-en-ciel à partir de modèles de perles après dépôt de cuivre. (C) Image d’un gabarit (à droite) après une traction de ruban pour enlever l’excès de cuivre et le ruban (à gauche). (D) Image AFM des poteaux en cuivre après tirage du ruban adhésif et dissolution complète des billes de polystyrène (barre d’échelle = 5 μm). (E) Image AFM à grossissement plus élevé du panneau D (barre d’échelle = 2 μm). (F) Histogramme des hauteurs des poteau en cuivre (définies comme mesure de la hauteur maximale à l’intérieur de chaque poteau), n = 534. (G) Histogramme des diamètres post-feret en cuivre, n = 201. Le diamètre du feret est la distance maximale entre deux lignes parallèles tangentes à la frontière du poteau (quantifiée dans l’ImageJ47). Pour identifier les particules à analyser, un seuil à mi-chemin entre le haut du revêtement et la surface inférieure en verre a été utilisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Images macroscopiques et microscopiques de ZMW en aluminium. (A) Image des lames après dépôt physique par évaporation de 150 nm d’aluminium autour et au-dessus des poteaux en cuivre. (B) Image AFM des ZMW en aluminium après la dissolution (barre d’échelle = 5 μm). (C) Image à grossissement plus élevé du panneau B (barre d’échelle = 0,2 μm). (D) Profil de profondeur typique d’un ZMW individuel à partir du panneau C. Profil tiré de la ligne verte tracée dans le panneau C. (E) Histogramme des diamètres ZMW du feret, n = 240. Les diamètres du feret ont été mesurés comme à la figure 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Imagerie FRET à molécule unique dans les ZMW. (A) Schéma (pas à l’échelle) de l’imagerie FRET à molécule unique de Cy3, duplex d’ADN marqués cy5 dans ZMW avec des duplex marqués Cy5 en arrière-plan. (B) Exemple de champ de ZMW sous lumière blanche (barre d’échelle = 10 μm). (C−F) Enregistrements FRET à molécule unique de duplex d’ADN immobilisés dans les ZMW en présence de duplex marqués 0 (C),50 (D),100 (E)et 500 nM (F) marqués par Cy5 en solution. Pour chaque concentration, le panneau supérieur montre l’intensité de fluorescence Cy3 (vert) et Cy5 (rouge) sous l’éclairage laser de 532 nm (imagerie FRET), le panneau central montre l’intensité de fluorescence Cy5 sous l’éclairage laser de 640 nm (excitation de l’accepteur direct), et le panneau le plus bas montre l’efficacité de la FRETTE ( Equation 2 ) calculée à partir des intensités de fluorescence brutes Cy3 ( ID) et Cy5 (IA). Pendant l’imagerie, la longueur d’onde d’excitation alternait entre 532 et 640 nm toutes les 100 ms. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Schéma de la méthode de modélisation colloïdale mise au point pour fabriquer un réseau ZMW en or. Le protocole de fabrication d’un réseau ZMW en or est analogue au protocole de fabrication d’un réseau ZMW en aluminium (Figure 2). Au lieu de déposer du cuivre sur les billes de polystyrène, l’aluminium est déposé. Après avoir dissous les perles dans du toluène, de l’or est déposé à la place de l’aluminium sur le dessus des poteaux. Les poteaux en aluminium sont ensuite gravés sélectivement pour laisser derrière eux un réseau ZMW en or. Pour les trois dernières étapes, des vues en coupe transversale sont fournies à droite des vues en plan pour montrer les largeurs et les hauteurs des poteaux en aluminium et des ZMW dorés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2: Modélisation par éléments finis de la propagation du champ électromagnétique dans ZMWs. (A−D) Coupes transversales de l’ampleur du vecteur de Poynting moyenné dans le temps(W/m2)à travers un guide d’ondes constitué d’un gabarit non annexe (A,C) et d’un gabarit recuit (B,D). Des ondes planes électromagnétiques polarisées linéairement (1 W répartis sur la surface de la lame) aux longueurs d’onde énumérées dans la figure (400 nm ou 1 000 nm) ont été projetées sur la surface inférieure, et le mode le plus bas (fondamental), qui a le nombre d’ondes le plus bas, a été calculé à l’aide d’un logiciel de modélisation(Table des matériaux)avec la méthode des éléments finis pour résoudre les équations de Maxwell et les conditions aux limites appropriées. Les limites des guides d’ondes ont été supposées être des conducteurs électriques parfaits, ce qui est bien approché par des murs en aluminium ou en or. La section transversale du gabarit de guide d’ondes non annexe a été déterminée par l’emballage hexagonal de cercles de 1 μm de diamètre, et les extrémités à trois branches de la forme triangulaire résultante ont été coupées à une largeur d’environ 60 nm pour modéliser une ouverture physique réaliste. La section transversale des gabarits recuits a été approchée sous la forme d’un cercle de 130 nm de diamètre. Les deux guides d’ondes avaient une profondeur de 130 nm, similaire à la profondeur du revêtement après la fabrication. (E,F) En plus des longueurs d’onde d’excitation de 400 nm et 1 000 nm, les modèles ont été résolus à 100 longueurs d’onde d’excitation uniformément espacées entre 400 nm et 1 000 nm, et l’indice de mode effectif (défini comme Equation 3 , où kz est le nombre d’ondes dans le guide d’ondes, qui est diminué en raison de la restriction dans le plan transversal, et k est le nombre d’ondes de la lumière d’excitation dans le vide) a été tracé par rapport à la longueur d’onde d’excitation pour les guides d’ondes triangulaires (E) et circulaires (F). Pour les longueurs d’onde plus courtes, les modes supérieurs sont excités et l’indice du mode effectif augmente (l’indice du mode effectif maximal est 1, qui est le cas limite où l’onde plane électromagnétique se déplace sans bornes dans la dimension transversale). Les longueurs d’onde de coupure effectives des guides d’ondes ont été estimées comme la longueur d’onde à laquelle l’indice du mode effectif tombe à 0. Notez que le guide circulaire λcutoff = 221 nm de la modélisation par éléments finis (F) est cohérent avec la prédiction théorique de la longueur d’onde de coupure d’un guide d’ondes circulaire (λcutoff,analytical = 1,7d = 221 nm, où d est le diamètre du guide d’ondes). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Résultats représentatifs de la fabrication d’Au ZMW. (A) Image macroscopique de réseaux ZMW en or. (B−D) Images AFM de poteaux en aluminium à partir d’un gabarit de perles qui n’a pas été recuit (B),d’un gabarit recuit à 107 °C pendant 20 s (C)et d’un gabarit recuit à 107 °C pendant 25 s (D). (E) Image AFM des ZMW en or après dissolution des poteaux en aluminium. (F) Image AFM à grossissement plus élevé du panneau E.(G) Profil de profondeur typique d’un ZMW en or. Profil tiré de la ligne verte tracée dans le panneau F (barre d’échelle = 1 μm en B, C, Det F; 5 μm en E). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Pour l’auto-assemblage colloïdal (protocole section 2), l’utilisation d’éthanol plutôt que d’eau comme solvant de suspension accélère le processus d’évaporation de sorte que les gabarits soient prêts en 2−3 min après dépôt plutôt qu’en 1−2 h comme dans les méthodes précédentes48,49. Le protocole de sédimentation par évaporation présenté ici est également plus simple que les protocoles de sédimentation précédents qui nécessitent de contrôler l’inclinaison de la surface, la température et le volume d’air au-dessus de la suspension49,50,51. La fraction volumique des particules utilisée dans ce protocole est de 2,4%, supérieure aux 0,2−0,5% utilisés dans les méthodes de sédimentation précédentes48, qui ressuscitaient les colloïdes dans des mélanges eau-glycérol pendant des échelles de temps de décantation beaucoup plus longues. Cependant, la qualité des dépôts est robuste aux variations de la fraction volumique des particules, des études antérieures ayant constaté qu’elle pouvait varier entre 2 et 10%49,50,51. Les granulométries des cristaux colloïdaux obtenus lors d’un dépôt réussi à partir de ce protocole sont de 20−30 μm de diamètre, plus grandes que les grains des méthodes de sédimentation précédentes (généralement plusieurs centaines de nanomètres de diamètre)48,49. Macroscopiquement, les zones d’environ 2 cm de diamètre de la monocouche colloïdale sont également comparables aux zones de 1 cm produites par les méthodes précédentes49. La grande taille des gabarits de cristaux colloïdaux produits dans cette méthode permet également de faire 3−5 chambres d’écoulement séparées44,chacune d’environ 3−4 mm de large, sur chaque lame ZMW. Ainsi, plusieurs expériences indépendantes sur une seule molécule peuvent être effectuées sur chaque lame.

Recuit les modèles de perles colloïdales (section de protocole 3) après l’auto-assemblage est une étape simple, mais cruciale pour réduire suffisamment la fluorescence de fond avec les ZMWs. Comme le montre la figure supplémentaire 2, la longueur d’onde de coupure effective pour un guide d’ondes avec la section triangulaire d’un gabarit non annexe est de 894 nm. En comparaison, la longueur d’onde de coupure effective pour un guide d’ondes circulaire de 130 nm de diamètre à partir d’un gabarit recuit est de 221 nm, déterminée à la fois analytiquement (1,7 fois le diamètre du guide18)et numériquement. L’utilisation de billes plus petites pour le dépôt pourrait également réduire la taille des pores de gabarit, mais les guides d’ondes seraient alors espacés de plus de 200 nm, ce qui est autour de la limite de diffraction de la lumière visible. De plus, les guides d’ondes resteraient de section triangulaire, ce qui conduit à une propagation de puissance non symétrique à travers le guide d’ondes(figure supplémentaire 2A−D). L’un des inconvénients de l’étape de recuit est que la variabilité du temps de fusion peut introduire des fluctuations du diamètre du guide d’ondes, de sorte qu’un timing précis aide à minimiser la variation entre les lots. Les interstices commencent à se fermer à des temps de recuit supérieurs à 25 s, et les diamètres des poteau ne diminuent pas beaucoup entre 20 et 25 s(figure supplémentaire 3B−D). Un test rapide pour la fermeture d’interstice consiste à vérifier si les gabarits recuits produisent toujours un motif de diffraction arc-en-ciel lorsqu’ils sont éclairés par la lumière et vus sous un angle. Si ce n’est pas le cas, la majorité des interstices ont probablement été fermés. La relation entre le temps de recuit et les diamètres typiques des pores a été présentée plus tôt38.

Après avoir atteint la taille de pore souhaitée lors de l’étape de recuit, du cuivre est déposé (étape 4.1) sur les gabarits pour créer une ombre du masque. Il est important d’utiliser le dépôt en ligne de visée, le métal s’approchant du gabarit de la manière la plus perpendiculaire possible. Ainsi, l’augmentation de la distance entre l’échantillon et la source de métal ainsi que la garantie que la plaque qui maintient les gabarits ne tourne pas, comme cela se fait automatiquement dans certaines machines de dépôt en phase vapeur, aidera à minimiser le dépôt latéral de métal sur le substrat de polystyrène. Cependant, un certain dépôt latéral est inévitable, ce qui réduit la taille du trou interstitiel et donc la section transversale de poteau car plus de métal est déposé52. Il en résulte des poteaux métalliques pyramidaux plutôt que des structures en forme de prisme52.

Étant donné que les poteaux en cuivre sont probablement pyramidaux plutôt que en forme de prisme, le dépôt d’aluminium (étape 4.5) au-dessus des poteaux couvre également certains des côtés inclinés, bloquant l’accessibilité de l’etchant de cuivre pour certains des poteaux. Ainsi, l’étape de polissage du papier de lentille (étape 4.7 ou 5.7) a été ajoutée après le premier trempage dans l’etchant pour perturber mécaniquement les poteaux en cuivre encore recouverts d’aluminium. Le dépôt de plus de cuivre pour créer des poteaux plus hauts rend également les poteaux plus sensibles aux perturbations mécaniques pendant le polissage du papier de l’objectif. Cependant, plus de 500 nm de cuivre ne devraient pas être déposés puisque le but du dépôt est de projeter le trou interstitiel à la ligne médiane de 500 nm des billes de 1 μm.

Une autre difficulté potentielle est l’enlèvement involontaire du revêtement en aluminium pendant le polissage du papier de l’objectif (étape 4.7 ou 5.7). Il a été constaté que la perte de revêtement en aluminium pendant le polissage est devenue plus fréquente après l’ajout de l’étape de recuit, probablement en raison de l’augmentation des résidus de polystyrène, qui peut interférer avec l’adhérence de l’aluminium au verre (section 3 du protocole). Toutefois, le trempage du toluène pendant la nuit (étape 4.3 ou 5.3) après la traction de la bande a résolu ce problème. Dans l’image AFM de la figure 4E,certains anneaux résiduels de polystyrène peuvent être vus entre les poteaux, mais le revêtement en aluminium a tout de même résisté à plusieurs buffs à l’étape 4.7. Si la perte du revêtement en aluminium reste un problème après le trempage du toluène pendant la nuit, un lavage RCA-1 (nettoyage standard-1), un lavage au piranha ou un nettoyage au plasma à l’oxygène supplémentaire peut être ajouté à l’étape 4.4 ou 5.4. Ces étapes de lavage peuvent également être ajoutées après l’étape de gravure finale (étape 4.7 ou 5.7) et avant la passivation afin de nettoyer davantage les ZMW.

Les performances des ZMW dans les expériences FRET à molécule unique étaient similaires à celles des ZMW fabriqués avec de l’EBL. Dans une étude précédente53 écrémant une seule molécule FRET sur de l’ADN simple brin marqué par Cy3 avec la protéine de chargeuse d’hélicase d’ADN marqué Cy5 en solution (le même arrangement donneur-accepteur que celui de la figure 6A),les événements FRET étaient clairement discernables à 100 nM Cy5 de fond, étaient moins clairs (signal de trace d’accepteur inférieur au bruit) à 1 μM, et non discernables à 10 μM. Nous notons qu’une étude précédente avec des ZMW commerciaux a rapporté des signaux d’accepteur FRET à molécule unique à des concentrations de fond aussi élevées que 1 mM54,supérieures à celles que nous et d’autres études précédentes42,53 avec des ZMW fabriqués en interne ont atteint. Une discussion plus approfondie de la performance signal-à-arrière-plan parmi les ZMW est donnée dans Jamiolkowski et al.38. L’interaction non spécifique de l’échantillon fluorescent avec les surfaces ZMW53 est un défi commun limitant l’accès à des concentrations plus élevées, surtout si l’espèce fluorescente diffusante en solution est une grande macromoléccule. Les études avec ZMWs sur des systèmes biochimiques complexes tels que la traduction ont généralement limité les concentrations de substrat fluorescent libre à 100−250 nM55,56,57,58. Quelle que soit l’application prévue des ZMW, l’optimisation des méthodes de passivation pour différents systèmes sera probablement nécessaire pour maintenir un signal acceptable au bruit à des concentrations élevées.

Dans l’ensemble, la méthode présentée ici ne nécessite aucune compétence ou équipement spécialisé, permet la fabrication parallèle de nombreux modèles à la fois et peut être adaptée pour fabriquer des ZMW dans différents métaux. Dans ce travail, le cuivre et l’aluminium ont été remplacés par de l’aluminium et de l’or, respectivement, pour fabriquer des ZMW en or(figure supplémentaire 3). Ceci est avantageux pour les laboratoires qui utilisent des méthodes de passivation de l’or plutôt que de l’aluminium. En outre, il a été démontré que les ZMW d’or augmentent les émissions de fluorophores qui absorbent dans la région rouge du spectre visible, tandis que les ZMW d’aluminium augmentent les émissions de fluorophores qui absorbent dans la région verte59. À l’avenir, l’intensité du signal fluorescent des ZMW fabriqués avec cette méthode pourrait être améliorée par gravure dans le verre sous le revêtement métallique ZMW en utilisant HF16,26,60. Cela éloigne les biomolécules immobilisées des parois métalliques, ce qui peut éteindre les fluorophores61. De plus, il y a un maximum d’intensité d’éclairage d’excitation sous l’entrée de l’ouverture, et cela a été exploité précédemment pour améliorer l’émission d’une seule molécule26,60.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions R01GM080376, R35GM118139 et NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 à Y.E.G., et par une bourse nrsa pré-doctorale NIAID F30AI114187 à R.M.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.

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References

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Bioingénierie numéro 159 guides d’ondes en mode zéro nano-ouverture fluorescence à molécule unique lithographie nanosphère cristal colloïdal auto-assemblage

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

Fabrication de guides d’ondes en mode zéro pour la microscopie à molécule unique à haute concentration
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Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M.,… More

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).

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