Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabricage van Zero Mode Waveguides voor hoge concentratie single molecule microscopie

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

ERRATUM NOTICE

Summary

Hier wordt een nanosfeerlithografiemethode beschreven voor parallelle fabricage van zero-mode golfgeleiders, die arrays van nanoapertures zijn in een met metaal beklede glazen microscopie coverslip voor beeldvorming met één molecuul bij nano- tot micromolarconcentraties van fluoroforen. De methode maakt gebruik van colloïdale kristal zelfassemblage om een waveguide sjabloon te maken.

Abstract

In fluorescentie-enzymologie met één molecuul beperkt achtergrondfluorescentie van gelabelde substraten in oplossing vaak de fluorofoorconcentratie tot pico- tot nanomolar-bereiken, verschillende ordes van grootte minder dan veel fysiologische ligandconcentraties. Optische nanostructuren genaamd zero mode waveguides (ZMW's), die 100−200 nm in diameteropeningen zijn vervaardigd in een dun geleidend metaal zoals aluminium of goud, maken beeldvorming van individuele moleculen bij micromolarconcentraties van fluoroforen mogelijk door zichtbare licht excitatie te beperken tot zeptoliter effectieve volumes. De behoefte aan dure en gespecialiseerde nanofabrication-apparatuur heeft echter het wijdverbreide gebruik van ZMW's uitgesloten. Meestal worden nanostructuren zoals ZMW's verkregen door direct te schrijven met behulp van elektronenstraallithografie, die sequentieel en traag is. Hier, colloïdaal, of nanosfeer, wordt lithografie gebruikt als een alternatieve strategie om maskers op nanometerschaal te maken voor het fabriceren van golfgeleiders. Dit verslag beschrijft de aanpak in detail, met praktische overwegingen voor elke fase. De methode maakt het mogelijk om duizenden aluminium of gouden ZMW's parallel te maken, met uiteindelijke golfgeleiderdiameters en diepten van 100−200 nm. Alleen gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en een thermische verdamper voor metaaldepositie zijn vereist. Door ZMW's toegankelijker te maken voor de biochemische gemeenschap, kan deze methode de studie van moleculaire processen bij cellulaire concentraties en snelheden vergemakkelijken.

Introduction

Single-molecule technieken zoals single molecule fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET) of single molecule fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) zijn krachtige tools voor moleculaire biofysica, waardoor de studie van dynamische bewegingen, conformaties en interacties van individuele biomoleculen in processen zoals transcriptie1,2,3, vertaling4,5,6, en vele anderen7. Voor smFRET is totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie een veel voorkomende methode omdat veel tethered moleculen in de loop van de tijd kunnen worden gevolgd en de evanescente golf die door TIR wordt gegenereerd, beperkt is tot een gebied van 100−200 nm naast de coverslip8. Echter, zelfs met deze beperking op excitatie volume, fluoroforen van belang moeten nog steeds worden verdund tot pM of nM bereiken om enkele molecuul signalen boven achtergrond fluorecence9te detecteren . Aangezien de Michaelis-Menten-constanten van cellulaire enzymen zich meestal in het μM-mM-bereik10bevinden, zijn biochemische reacties in studies met één molecuul meestal veel langzamer dan die in de cel. Eiwitsynthese vindt bijvoorbeeld plaats bij 15−20 aminozuren per seconde in E. coli11,12, terwijl de meeste prokaryotische ribosomen in smFRET-experimenten zich vertalen bij 0,1−1 aminozuur per seconde13. In de eiwitsynthese toonden kristalstructuren en smFRET op vastgelopen ribosomen aan dat transfer-RNA 's (tRNAs) fluctueren tussen 'hybride' en 'klassieke' toestanden vóór de tRNA-mRNA translocatie stap14,15. Wanneer echter fysiologische concentraties van de translocatie GTPase-factor, EF-G, aanwezig waren, werd in smFRET6een andere conformatie waargenomen, intermediair tussen de hybride en klassieke toestanden. Het bestuderen van dynamische moleculaire processen met snelheden en concentraties vergelijkbaar met die in de cel is belangrijk, maar blijft een technische uitdaging.

Een strategie om de fluorescerende substraatconcentratie te verhogen is het gebruik van op metaal gebaseerde, sub-zichtbare golflengteopeningen, zero mode waveguides (ZMWs) genoemd, om beperkte excitatievelden te genereren die selectief biomoleculen genereren die zijn gelokaliseerd in de openingen16 (Figuur 1). De openingen hebben doorgaans een diameter van 100−200 nm en een diepte van 100−150 nm17. Boven een cutoff golflengte gerelateerd aan de grootte en vorm van de putten (λc ≈ 2,3 keer de diameter voor cirkelvormige golfgeleiders met water als het diëlektrische medium18), zijn geen voortplantingsmodi toegestaan in de golfgeleider, vandaar de term zero mode waveguides. Echter, een oscillerend elektromagnetisch veld, een evanescente golf genoemd, exponentieel rottend in intensiteit nog steeds tunnels een korte afstand in de golfgeleider18,19. Hoewel vergelijkbaar met TIR evanescente golven, ZMW evanescent golven hebben een kortere verval constante, wat resulteert in 10−30 nm effectieve excitatie regio binnen de waveguide. Bij micromolarconcentraties van fluorescerend gelabelde liganden zijn slechts één of enkele moleculen tegelijkertijd aanwezig in het excitatiegebied. Deze beperking van het excitatievolume en de daaruit voortvloeiende vermindering van achtergrondfluorescentie maakt fluorescentiebeeldvorming van afzonderlijke moleculen in biologisch relevante concentraties mogelijk. Dit is toegepast op vele systemen20, met inbegrip van FCS-metingen van enkelvoudige eiwitdiffusie21, fretmetingen met één molecuul van ligand-eiwit22 met lage affiniteit en eiwit-eiwitinteracties23, en spectro-elektrochemische metingen van enkelvoudige moleculaire omzetgebeurtenissen24.

ZMW's zijn geproduceerd door een metaallaag rechtstreeks te patroonen met behulp van ionenbundelfrezen25,26 of elektronenstraallithografie (EBL), gevolgd door plasma-etsen16,27. Deze maskerloze lithografiemethoden creëren golfgeleiders in serie en vereisen meestal toegang tot gespecialiseerde nanofabrication-faciliteiten, waardoor wijdverspreide acceptatie van ZMW-technologie wordt voorkomen. Een andere methode, ultraviolet nanoimprint lithografie lift-off28, gebruikt een kwarts diavorm om een omgekeerde ZMW-sjabloon op een resist-film te drukken als een stempel. Hoewel deze methode meer gestroomlijnd is, vereist het nog steeds EBL voor de vervaardiging van de kwartsvorm. Dit artikel presenteert het protocol voor een eenvoudige en goedkope gesjabloonde fabricagemethode die geen EBL- of ionenbundelfrezen vereist en is gebaseerd op het dicht verpakken van nanobolletjes om een lithografisch masker te vormen.

Nanosfeer of "natuurlijke" lithografie, die voor het eerst werd voorgesteld in 1982 door Deckman en Dunsmuir29,30, maakt gebruik van de zelfassemblage van monodisperse colloïdale deeltjes, variërend van tientallen nanometers tot tientallen micrometers31, om sjablonen te maken voor oppervlaktepatronen via etsen en / of afzetting van materialen. De tweedimensionale (2D) of driedimensionale (3D) uitgebreide periodieke arrays van colloïdale deeltjes, aangeduid als colloïdale kristallen, worden gekenmerkt door een heldere iridescence van verstrooiing en diffractie32. Hoewel minder veel gebruikt dan elektronenbundel of fotolithografie, is deze maskeringsmethodologie eenvoudig, goedkoop en gemakkelijk verkleind om functiegroottes onder 100 nm te creëren.

Het sturen van de zelfassemblage van colloïdale deeltjes bepaalt het succes van het gebruik van colloïdale kristallen als maskers voor oppervlaktepatronen. Als de grootte en vorm van deeltjes homogeen zijn, kunnen colloïdale deeltjes gemakkelijk zelf worden geassembleerd met zeshoekige verpakking, aangedreven door entropische uitputting33. Waterverdamping na druppelcoating is een effectieve route om de colloïdale deeltjes te sedimenteren, hoewel andere methoden dipcoating34, spincoating35, elektroforetische depositie36en consolidatie op een lucht-waterinterface37omvatten . Het onderstaande protocol is gebaseerd op de verdampingssedimentatiemethode, die het eenvoudigst te implementeren was. De driehoekige interstices tussen dicht opeengepakte polystyreenparels vormen openingen om een offermetaal te vergulden en palen te vormen (figuur 2 en aanvullende figuur 1). Kort gloeien van de kralen voor deze stap past de vorm en diameter van deze palen aan. De kralen worden verwijderd, een laatste metalen laag wordt rond de palen afgezet en vervolgens worden de palen verwijderd. Nadat de twee metaaldepositiestappen op het colloïdale nanomasker, verwijdering van de tussenliggende palen en oppervlaktechemiemodificatie voor passivering en tethering, zijn ZMW-arrays klaar voor gebruik voor beeldvorming met één molecuul. Uitgebreidere karakterisering van de optische eigenschappen van ZMW na fabricage is te vinden in een begeleidend artikel38. Naast een thermische verdamper voor dampafzetting van de metalen, zijn er geen gespecialiseerde gereedschappen nodig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Alle stappen kunnen worden voltooid in de algemene labruimte.

1. Glasafdekkingenlipreiniging

  1. Om een schoon oppervlak voor verdampingsdepositie van colloïdale deeltjes te bieden, plaatst u 24 x 30 mm optische borosilicaatglasafdekkingslips (0,16−0,19 mm dikte) in de gegroefde inzetstukken van een koplinglas vlekpot voor reiniging.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de afdeklips rechtop staan en goed gescheiden zijn, zodat alle oppervlakken duidelijk zichtbaar zijn tijdens het reinigingsproces.
  2. Giet voldoende aceton in de kleurpot om de afdeklipjes te bedekken, plaats de hoes erop en soniceer gedurende 10 minuten bij 40 °C.
  3. Giet de aceton uit en spoel de afdeklipjes af door de kleurpot te vullen met gedestilleerd H2O en het water eruit te gieten. Herhaal dit nog 2 keer.
  4. Herhaal de aceton sonicatie (stap 1.2 en 1.3) nogmaals.
  5. Giet voldoende KOH van 200 mM in de pot om de afdeklips te bedekken en soniceer, afgedekt, gedurende 20 minuten bij 40 °C.
    OPMERKING: De KOH etst het glas lichtjes.
  6. Spoel de afdeklips 6 keer af met gedestilleerde H2O.
  7. Voeg ethanol toe om de deksels te bedekken, voeg het deksel toe en soniceer gedurende 10 minuten bij 40 °C.
  8. Spoel de afdeklips 3 keer af met gedestilleerde H2O.
  9. Pak elke afdeklip aan de rand op met een zachte tang en droog de afdeklips met N2-gas. Raak alleen de randen van de afdeklip aan. Plaats elk van de gedroogde, gereinigde afdeklipjes in een individuele schone petrischaal.

2. Verdampingsdepositie van polystyreenparels

  1. Om het colloïdale kristalmasker voor de ZMW-array te maken, centrifugeert u 50 μL met een diameter van 1 μm, niet-gefunctionaliseerde polystyreenparels (2,5% w/v in water) bij 15.000 x g, 25 °C gedurende 5 min.
    OPMERKING: Voordat u de kralen pijpt, moet de voorraadoplossing kort worden gekroond voor het geval de kralen zich op de bodem van de fles hebben gevestigd.
  2. Gooi het supernatant weg en laat zo min mogelijk water over.
    OPMERKING: Restwater kan de verdampingseigenschappen van de ethanolresuspensieveranderen 39, dus het verwijderen van een kleine hoeveelheid kralen om al het water te verwijderen is acceptabel.
  3. Resuspend de kralen van stap 2.2 in 50 μL van 1:400 TritonX-100:ethanol oplosmiddel. Pipetteer meerdere keren op en neer om de kralen grondig te mengen met het oplosmiddel.
    OPMERKING: TritonX-100:ethanol oplosmiddel moet na gebruik worden verzegeld met paraffinefolie en eenmaal per maand vers worden bereid. De kralen hebben de neiging om zich te hechten aan de zijkanten van een plastic vat, zoals een microcentrifugebuis, dus pipet langs de zijkanten om ervoor te zorgen dat alle kralen worden geresuspendeerd.
  4. Om een vochtigheidskamer voor afzetting op te zetten, plaatst u 6 Petrischalen, elk met één afdeklip, op een bank in een lijn met deksels die iets op een kier staan. Verplaats in elke schaal de afdeklip naar het open gebied, zodat de afdeklips worden blootgesteld aan de omgeving wanneer de luchtvochtigheid in de volgende stap wordt verhoogd.
  5. Plaats een hygrometer en een kleine elektrische ventilator gecentreerd achter de Petrischalen.
  6. Noteer de relatieve aanvangsvochtigheid (RH) in het lab. Vul een bekerglas van 200 ml met 150−200 ml ~75 °C water en plaats het achter de ventilator.
  7. Zet de ventilator aan en bedek de Petrischalen, ventilator, beker en hygrometer met een omgedraaide, transparante plastic opslagcontainer (66 cm x 46 cm x 38 cm).
  8. Laat de RV in de kamer stijgen tot 70−75%, wat meestal 5−10 min duurt.
    OPMERKING: Als de rv van het omgevingslaboratorium laag is (minder dan ~ 50%), laat de kamer dan een hogere RV bereiken, maar niet hoger dan 80%, om vochtverlies tijdens depositie te compenseren (zie hieronder).
  9. Wanneer de RH 70−75% bereikt, registreert u de RH en tilt u de plastic opslagcontainer iets op om snel deksels op de Petrischalen te plaatsen, wat over bevochtiging van de afdeklips voorkomt.
    OPMERKING: De temperatuur in de kamer zal iets warmer zijn dan de kamertemperatuur, meestal 25−26 °C, als gevolg van bevochtiging. Als er vocht zichtbaar is op de afdeklips, dan zijn de glasoppervlakken te nat. Een commercieel handschoenenkastje kan dit deel van het protocol vereenvoudigen.
  10. Laat de RV in de kamer blijven stijgen tot 85%. Noteer op dat moment de RV in de vochtigheidskamer en pipet 5 μL van de kraalsuspensie in het midden van elke afdeklip.
  11. Sluit de kamer en Petrischalen na elke afzetting om vochtverlies te minimaliseren. Streef ernaar om alle 6 deposities binnen 2 minuten af te ronden.
  12. Noteer de RV in de kamer na de verklaring.
    OPMERKING: De RV na depositie zal helpen meten hoe snel de vochtigheid verloren is gegaan tijdens de depositie, wat afhankelijk is van de omstandigheden in het omgevingslaboratorium. Voor een typische succesvolle run begint de kamer bij 85% RV voorafgaand aan de depositie en eindigt bij 70−75% RV na de depositie.
  13. Laat de kraaldruppels zich verspreiden en droog gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Als de colloïdale kristallen veel gaten of meerlagige gebieden hebben, was de kamer waarschijnlijk te vochtig of droog, respectievelijk. Pas de relatieve vochtigheid aan om de Petrischalen te sluiten en de afzettingen te starten (zie de resultatensectie voor verdere bespreking van optimalisatie).

3. Kraalgloeien voor het verminderen van de poriegrootte in het colloïdale kristalsjabloon

  1. Om een uniform temperatuuroppervlak te bieden voor het gloeien van de polystyreenparels, die de interparelinterstices versmaadt en de hoeken van de interstices rondt, plaatst u een vlakke, gefreesde aluminium plaat bovenop een standaard keramische kookplaat.
  2. Stel de temperatuur van de kookplaat in op 107 °C, de glasovergangstemperatuur van polystyreen40.
    OPMERKING: Om een stabiele en nauwkeurige temperatuur te verkrijgen, werd een thermokoppelsonde vastgehouden in een gat van 2−3 mm breed en 4−5 mm diep in de aluminium plaat.
  3. Plaats een afdeklip met de kraalsjabloon op de hete aluminium plaat en gloei gedurende 20 s (zie het discussiegedeelte voor uitleg over de smelttijd).
  4. Verwijder na het verwarmen de afdeklip van de aluminium plaat en plaats deze onmiddellijk op een ander aluminium oppervlak op kamertemperatuur om het te koelen.
    OPMERKING: Het is handig om de afdeklips iets over de rand van de plaat te laten hangen of ondiepe kanalen (zie de bijbehorende video) in de plaat te laten frezen om het ophalen van de afdeklips te vergemakkelijken.

4. Nanofabrication van aluminium nul wijze waveguides gebruikend het colloïdale kristalmalplaatje

  1. Met behulp van thermische of elektronenstraal verdampingsdepositie, deponeer 300 nm koper bij 2 Å/s over de colloïdale kristal sjabloon om palen te genereren in de interstices tussen de kralen.
  2. Verwijder overtollig metaal bovenop de kralen door het oppervlak voorzichtig met tape in te drukken. Schil de tape langzaam om het metaal eraf te trekken.
    OPMERKING: Na het trekken van de tape kunnen enkele kleine stukjes reflecterend overtollig metaal achterblijven en deze kunnen vaak worden verwijderd door een stroom N2-gas. Als er na het trekken van de tape aanzienlijke stukken reflecterend overtollig metaal achterblijven, probeer dan de sjablonen 2 uur in tolueen te weken om de polystyreenparels gedeeltelijk op te lossen. Was de afdeklips met gedestilleerd water, droog met N2en herhaal de tapetrek. De extra soak mag de kralen niet volledig oplossen, omdat de kralen de palen helpen beschermen tegen beschadiging tijdens het trekken van de tape.
  3. Om de polystyreen kralen op te lossen, plaatst u de kraal sjablonen in tolueen en weekt u 's nachts.
    LET OP: Tolueendampen kunnen giftig zijn. Werk met tolueen onder een goed geventileerde capuchon en draag persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, veiligheidsbrillen en een laboratoriumjas. Tolueen moet worden bewaard in geventileerde kasten die zijn aangewezen voor ontvlambare vloeistoffen.
  4. Spoel de sjablonen na de tolueenincubering eenmaal met chloroform en twee keer met ethanol. Hanteer op dit punt de afdeklips zorgvuldig, omdat de delicate metalen palen van 200−300 nm nu worden blootgesteld. Droog de sjablonen met N2 en verwijder restpolymeer en verontreinigingen in een zuurstofplasmareiniger gedurende 30 minuten.
    LET OP: Chloroform dampen kunnen giftig zijn. Werk met chloroform onder een goed geventileerde capuchon en draag persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, veiligheidsbrillen en een laboratoriumjas. Chloroform moet worden bewaard in geventileerde kasten uit de buurt van andere ontvlambare oplosmiddelen.
  5. Met behulp van thermische of elektronenstraalverdampingsdepositie 3 nm van een titanium adhesielaag bij 1 Å/s, gevolgd door 100−150 nm aluminium bij 4 Å/s rond en bovenop de koperen palen.
    OPMERKING: Men kan dikkere bekleding gebruiken om diepere geleiders en een betere demping van achtergrondfluorescentie te verkrijgen, maar dit vermindert ook de opbrengst na het blootstellen en oplossen van de palen in de volgende stap (zie het discussiegedeelte).
  6. Om de metalen palen op te lossen, weekt u de afdeklips in koperen etchant (op basis van citroenzuur; Tabel met materialen) gedurende 2 uur.
    LET OP: Metaal etchant kan brandwonden veroorzaken. Werk met etsers onder een goed geventileerde kap en draag beschermende uitrusting. Was de handen grondig na het hanteren. Metaal etchant moet worden opgeslagen in geventileerde kasten die zijn aangewezen voor corrosieve vloeistoffen.
  7. Spoel de afdekplaten af met gedestilleerd water, droog met N2en polijst het oppervlak van de metalen bekleding voorzichtig met lenspapier om eventuele palen bloot te leggen die nog bedekt zijn met bekleding. Plaats de afdeklips nog 2 uur terug in koperen ets, spoel ze vervolgens opnieuw af met gedestilleerd water en droog ze af met N2.
    OPMERKING: ZMW-dia's moeten worden bewaard in overdekte, schone petrischalen om ze vrij van verontreinigingen te houden.

5. Nanofabrication van gouden nul wijze waveguides gebruikend het colloïdale kristalmalplaatje

OPMERKING: De methode voor het fabriceren van gouden ZMW's (Aanvullende figuur 1), die het protocol voor het fabriceren van aluminium ZMW's weerspiegelt, wordt in deze sectie gegeven.

  1. Met behulp van thermische of elektronenstraalverdampingsdepositie 3 nm van een titanium adhesielaag bij 1 Å/s, gevolgd door 300 nm aluminium bij 4 Å/s.
  2. Verwijder overtollig metaal bovenop de kralen door het oppervlak voorzichtig met tape in te drukken. Schil de tape langzaam om het metaal eraf te trekken.
  3. Om de polystyreen kralen op te lossen, plaatst u de kraal sjablonen in tolueen en weekt u 's nachts.
  4. Spoel de sjablonen na de tolueenincubering eenmaal met chloroform en twee keer met ethanol. Droog de sjablonen met N2 en verwijder resterende polymeerverontreinigingen in een zuurstofplasmareiniger gedurende 30 minuten.
  5. Met behulp van thermische of elektronenstraal verdampingsdepositie, afzetting 100−150 nm goud bij 5 Å/s rond en bovenop de aluminium palen.
  6. Om de metalen palen op te lossen, weekt u de afdeklips in aluminium etchant (op basis van fosforzuur; Tabel met materialen) gedurende 1 uur.
  7. Spoel de afdekplaten af met gedestilleerd water, droog met N2en polijst het oppervlak van de metalen bekleding voorzichtig met lenspapier om eventuele palen bloot te leggen die nog bedekt zijn met bekleding. Plaats de afdeklips 1 uur terug in aluminium etchant, spoel ze vervolgens opnieuw af met gedestilleerd water en droog ze af met N2.
    OPMERKING: ZMW-dia's moeten worden bewaard in overdekte, schone petrischalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De zelfassemblage van de colloïdale deeltjes van polystyreen via verdampingssedimentatie (stappen 2.1−2.13) kan een reeks resultaten opleveren, omdat het controle van de verdampingssnelheid van oplosmiddelen vereist. Omdat de afzettingen echter snel zijn (10−15 min per ronde), kan de procedure snel worden geoptimaliseerd voor verschillende omgevingslabomstandigheden. Figuur 3A toont een goed gevormd colloïdaal sjabloon na afzetting en verdamping. Macroscopisch is het gebied van kralen cirkelvormig, met randen gedefinieerd door een ondoorzichtige, meerlagige ring van kralen. De doorschijnende, maar niet witte gebieden in de afbeelding zijn de gewenste monolaaggebieden. Figuur 3B toont een colloïdaal sjabloon dat was verpakt in een te vochtige omgeving (80% RV toen Petrischalen werden gesloten). Deze sjablonen hebben meestal geen schone cirkelvormige grens en hebben meerlagige ranken die zich naar buiten uitstrekken. De depositie is acceptabel en kan in volgende fasen worden gebruikt, maar de gaten in het rooster verminderen het aantal bruikbare ZMW-arraygebieden voor beeldvorming met één molecuul. Figuur 3C toont een colloïdaal sjabloon dat was verpakt in een te droge omgeving (65% RV toen Petrischalen werden gesloten). Deze sjablonen zijn meestal kleiner in diameter in vergelijking met de ideale, goed gespreide sjablonen. De depositie kan worden gebruikt, maar de meerlagige, witte gebieden, die naar binnen strepen, verminderen het gebied dat kan worden gebruikt voor beeldvorming. We raden dus af om meer dan 6 afzettingen tegelijk uit te voeren, omdat afzettingen tegen het einde van het proces bij een lagere luchtvochtigheid zullen plaatsvinden wanneer de kamer wordt geopend en gesloten. Figuur 3D toont het regenboogpatroon dat wordt geproduceerd door diffractie van gereflecteerd licht van het polystyreenkristal. Dit patroon kan worden gebruikt om succes en kwaliteit van kristal verpakking met het oog te bevestigen. Figuur 3E,F toont atomaire krachtmicroscopie (AFM) afbeeldingen van goed verpakte colloïdale sjablonen. De defecten tussen korrels ontstaan door vastlopen tijdens de verdampingsbezinking41, en verschillende korrels zijn te zien met een 10x-doelstelling. Zo kan het onderzoeken van de colloïdafzettingen met een lichtmicroscoop met laag vermogen ook worden gebruikt om de verpakking te beoordelen.

Na depositie van koper op de gegloeide colloïdale sjablonen (stap 4.1), moet het regenboogdiffractiepatroon nog steeds zichtbaar zijn en worden versterkt door de reflecterende metalen coating van de bovenkanten van de kralen (figuur 4A, B). De sjablonen verliezen het reflecterende regenboogdiffractiepatroon na de Schotse tapetrek (stap 4.2) die overtollig koper verwijdert (figuur 4C). Figuur 4D,E toont AFM-afbeeldingen van een typisch veld koperen palen na metaaldepositie. De defecten tussen de colloïdale kristalkorrels in figuur 3E zijn zichtbaar in de koperen postafbeeldingen als grotere gebieden van koper. Analyse van AFM-beelden toont aan dat bij een koperdepositiedikte van 300 nm de uiteindelijke koperen palen gemiddeld 255 nm (figuur 4F) hoog en 121 nm in diameter (figuur 4G) zijn.

Depositie van de aluminium bekleding (stap 4.5) waar de kralen zich en bovenop de koperen palen waren, en daaropvolgende ontbinding van de palen (stappen 4.6 en 4.7) resulteren in de aluminium ZMW's in figuur 5A−C. Defecten tussen de colloïdale kristalkorrels zijn zichtbaar als grotere openingen (figuur 5B). De gemiddelde afstand tussen de ZMW-centra in figuur 5C is 559 nm, consistent met de afstand die wordt ingesteld door de zeshoekige dichte verpakkingsgeometrie van de 1 μm kralen ( Het gebruik van Equation 1 polystyreensjablonen die gedurende 20 s zijn gegloeid, resulteert in golfgeleiders met een gemiddelde diameter van 118 nm(figuur 5D,E),consistent met de postdiameters en voldoende klein om de voortplanting van zichtbaar licht af te snijden. Een hoogteprofiel van een golfgeleider uit figuur 5D laat ook zien dat deze ~120 nm diep is.

Single molecule FRET werd uitgevoerd in de ZMWs om te testen op functionaliteit (Figuur 6A). Een typisch veld van ZMW's voor beeldvorming wordt weergegeven in figuur 6B, die >3000 golfgeleiders bevat in een gezichtsveld van 40 x 80 μm. De ZMW 's werden voor het eerst ge passiveerd met behulp van eerder beschreven protocollen42,43. Kortom, de aluminium ZMW's werden ge passiveerd met poly (vinylfosfonzuur) om de aluminium bekleding te coaten, gevolgd door methoxy-geëindigde polyethyleenglycol (PEG) gedoofd met biotine-geëindigde PEG om de glazen bodems van de ZMWs te coaten. Gouden ZMW's kunnen worden ge passiveerd met thiol-gederivatiseerde PEG om de gouden bekleding te coaten, gevolgd door een vergelijkbare PEG-behandeling voor de glasbodems. De kamers van de stroom, ~20 μL volume, werden toen geconstrueerd voor enig molecule beeldvorming44. Single molecule FRET imaging van de DNA duplexen werd uitgevoerd zoals eerder beschreven38. Kortom, 100 pM−1 nM cyanine-3/cyanine-5 (Cy3/Cy5), biotinylated DNA duplexen (33 basispaarlengte) werden gedurende 10 minuten geïncubeerd in stroomkanalen gefunctionaliseerd met streptavidine (5 min incubatie, 0,5 mg/ml oplossing). De concentratie van gelabelde macromoleculen kan worden getitreerd om ~ 20% belasting van de golfgeleiders met één molecuul te bereiken, wat leidt tot <5% golfgeleiders geladen met meer dan één molecuul, gebaseerd op Poisson gedistribueerde belasting (de meeste golfgeleiders, ~ 75%, zullen geen moleculen hebben)45. Ongebonden DNA werd weggespoeld met nucleasevrije duplexbuffer gevolgd door verlichtingsbuffer (0,3% [w/v] glucose, 300 μg/ml glucoseoxidase, 120 μg/ml catalase en 1,5 ml Trolox [6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chromaan-2-carboxylzuur]). Niet-biotinylated Cy5-gelabelde DNA-duplexen (33 basispaarlengte) waren aanwezig in de verlichtingsbuffer op 0, 50, 100 en 500 nM als achtergrondfluoroforen in oplossing. Single molecule FRET sporen van de geïmmobiliseerde Cy3/Cy5 duplex DNA moleculen werden geregistreerd met een op maat gemaakte TIRF microscoop aangepast aan epi-fluorescentie omstandigheden. Films werden opgenomen met een 1.48 numeriek diafragma (NA) 100x olie-onderdompelingsdoelstelling met afwisselend 532 nm en 640 nm excitatie (100 ms belichting) en een dual view spectral splitter om Cy3- en Cy5-emissie tegelijkertijd op te nemen op een elektronenvermenigvuldigingsapparaat (EMCCD) camera. Fret-sporen met één molecuul in het Cy5-kanaal waren detecteerbaar bij alle concentraties van ambient Cy5 getest (Figuur 6C−F). Ter vergelijking: enkelvoudige moleculen zouden alleen detecteerbaar zijn in TIRF-verlichting met pM tot lage nM-oplossingfluorofoorconcentraties46.

Figure 1
Figuur 1: Schematische nulmodusgolfgeleiders. Diagram van ZMW-array met uitgebreid doorsnedediagram van één ZMW aan de rechterkant. Enkele fluorescerend gelabelde enzymen van belang (bruin ribosoom met rode cirkel om fluorescerende kleurstof weer te geven) chemisch geïmmobiliseerd (via het mRNA in dit voorbeeld) naar de glazen bodem van de ZMWs (meestal gefunctionaliseerd met biotinylated-PEG) kunnen worden afgebeeld met een typische lasergebaseerde epifluorescentiemicroscopie-opstelling. Het excitatielampje van 532 nm (groene pijlen) wordt gereflecteerd op de glas-metaalgrens vanwege de kleine grootte van de opening (100−200 nm diameter), maar een niet-voortplantende evanescente golf die exponentieel in intensiteit vervalt, is aanwezig binnen de ZMW. Dit resulteert in een effectieve verlichtingsdiepte van 10−30 nm (groene arcering in diafragma). Individuele fluorescerende liganden (blauwe tRNAs met groene cirkels als fluorescerende tags) bij nM- tot μM-concentraties worden toegevoegd. Een individuele ligand die zich verspreidt in het diafragma en interageert met het enzym wordt afgebeeld zonder onbetaalbare achtergrondfluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schematische van colloïdale templating methode ontwikkeld om aluminium ZMW arrays te fabriceren. Polystyreenparels met een diameter van 1 μm worden afgezet en zelf geassembleerd op een gereinigde glazen afdeklip, zoals beschreven in punt 2 van het protocol. Kralen worden vervolgens gegloeid om de poriegrootte te verminderen (sectie 3), gevolgd door koperafzetting en kraaloplossing in tolueen. Aluminium wordt afgezet rond en bovenop de koperen palen, die vervolgens selectief worden weggeëtst om een zeshoekige reeks nanoapertures achter te laten (sectie 4). Voor de laatste drie stappen zijn dwarsdoorsnedeaanzichten rechts van de planaanzichten voorzien om de breedtes en hoogtes van de koperen palen en aluminium ZMW's weer te geven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve resultaten van verdampingsdepositie van colloïden. (A) Voorbeeld van optimale colloïdendepositie. (B) Voorbeeld van een aanvaardbare colloïdendepositie waarbij de omstandigheden vochtiger waren (80% RV) dan ideaal. Gaten in de kristalmonolaag zijn zichtbaar. (C) Voorbeeld van een aanvaardbare colloïdendepositie waarbij de omstandigheden droger (65% RV) waren dan optimaal. De monolaaggebieden zijn enigszins doorschijnend, terwijl meerlagige gebieden wit en ondoorzichtig zijn (omtrek en strepen naar binnen). (D) Een colloïdaal kristal verlicht met wit licht om de regenboogdiffractie van de kristallen te benadrukken. (E) AFM-afbeelding (tapsonde AFM in de lucht) van een monolaag van zeshoekig verpakte polystyreenparels uit een succesvolle colloïddepositie (schaalbalk = 10 μm). (F) Uitgebreide AFM afbeelding van verpakte kralen (schaalbalk = 2 μm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Macroscopische en microscopische afbeeldingen van ZMW-sjablonen na koperdepositie. (A) Afbeelding van dia's na fysieke verdamping van koper bovenop de kraalsjablonen. (B) Regenboog diffractie patroon van kraal sjablonen na koper depositie. (C) Afbeelding van een sjabloon (rechts) na een tape pull om overtollig koper en de tape (links) te verwijderen. (D) AFM-afbeelding van koperen palen na tapetrekken en volledige ontbinding van de polystyreenparels (schaalbalk = 5 μm). (E) Hogere vergroting AFM-afbeelding van paneel D (schaalbalk = 2 μm). (F) Histogram van de hoogte van de koperen paal (gedefinieerd als maximale hoogtemeting binnen elke paal), n = 534. (G) Histogram van de koperen post Feret diameters, n = 201. Feretdiameter is de maximale afstand tussen twee parallelle lijnen die raken aan de paalgrens (gekwantificeerd in Afbeelding J47). Om deeltjes voor analyse te identificeren, werd een drempel halverwege tussen de bovenkant van de bekleding en het onderste glasoppervlak gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Macroscopische en microscopische afbeeldingen van aluminium ZMW's. (A) Afbeelding van dia's na fysische verdampingsdepositie van 150 nm aluminium rond en bovenop de koperen palen. (B) AFM-beeld van aluminium ZMW's na ontbinding (schaalbalk = 5 μm). (C) Hogere vergrotingsafbeelding van paneel B (schaalbalk = 0,2 μm). (D) Typisch diepteprofiel van een individuele ZMW uit paneel C. Profiel ontleend aan de groene lijn getekend in paneel C. (E) Histogram van ZMW Feret diameters, n = 240. Feretdiameters werden gemeten zoals in figuur 4. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Fret-beeldvorming met één molecuul in ZMW's. (A) Schematische (niet op schaal) van fret-beeldvorming met één molecuul van Cy3, Cy5-gelabelde DNA-duplexen in ZMW's met Cy5-gelabelde duplexen op de achtergrond. (B) Voorbeeldveld van ZMW's onder witlichtverlichting (schaalbalk = 10 μm). (C−F) Fret-opnamen met één molecuul van DNA-duplexen geïmmobiliseerd in de ZMW's in aanwezigheid van 0 (C), 50 (D), 100 (E)en 500 nM (F) Cy5-gelabelde duplexen in oplossing. Voor elke concentratie toont het bovenpaneel de Cy3 (groen) en Cy5 (rood) fluorescentie-intensiteit onder 532 nm laserverlichting (FRET-beeldvorming), het middelste paneel toont de Cy5 fluorescentie-intensiteit onder 640 nm laserverlichting (directe acceptor excitatie), en het laagste paneel toont de FRET-efficiëntie ( Equation 2 ) berekend op basis van de ruwe Cy3 ( ID) en Cy5 (IA) fluorescentieintensiteiten. Tijdens beeldvorming wisselde de excitatiegolflengte af tussen 532 en 640 nm om de 100 ms. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Schematische van colloïdale templating methode ontwikkeld om goud ZMW array fabriceren. Protocol voor het fabriceren van gouden ZMW-array is analoog aan het protocol om aluminium ZMW-array te fabriceren (Figuur 2). In plaats van koper op de polystyreen kralen te deponeren, wordt aluminium afgezet. Na het oplossen van de kralen in tolueen wordt goud afgezet in plaats van aluminium bovenop de palen. Aluminium palen worden vervolgens selectief geëtst om een gouden ZMW-array achter te laten. Voor de laatste drie stappen worden dwarsdoorsnedeaanzichten rechts van de planaanzichten verstrekt om de breedtes en hoogten van de aluminium palen en gouden ZMW's weer te geven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Eindige elementmodellering van elektromagnetische veldvoortplanting in ZMWs. (A−D) Doorsneden van de grootte van de tijdgemiddelde Poynting-vector (W/m2) door een golfgeleider gemaakt van een ongeanneald sjabloon (A,C) en een gegloeid sjabloon (B,D). Lineair gepolariseerde elektromagnetische vlakgolven (1 W verdeeld over het gebied van de dia) op de golflengten vermeld in de figuur (400 nm of 1.000 nm) werden geprojecteerd op het onderste oppervlak, en de laagste (fundamentele) modus, die het laagste golfnummer heeft, werd berekend met behulp van modelleringssoftware (Tabel van materialen) met de eindige elementenmethode voor het oplossen van Maxwells vergelijkingen en geschikte randvoorwaarden. De grenzen van de golfgeleiders werden verondersteld perfecte elektrische geleiders te zijn, die goed worden benaderd door aluminium of gouden muren. De doorsnede van de ongeannealde golfgeleidersjabloon werd bepaald door de zeshoekige verpakking van cirkels met een diameter van 1 μm en de driepuntige uiteinden van de resulterende driehoekige vorm werden geknipt tot ~ 60 nm breedte om een realistisch fysiek diafragma te modelleren. De doorsnede van de gegloeide sjablonen werd benaderd als een cirkel met een diameter van 130 nm. Beide golfgeleiders hadden een diepte van 130 nm, vergelijkbaar met de bekledingsdiepte na fabricage. (E,F) Naast excitatiegolflengten van 400 nm en 1.000 nm, werden de modellen opgelost bij 100 excitatiegolflengten gelijkmatig verdeeld tussen 400 nm en 1.000 nm, en de effectieve modusindex (gedefinieerd als Equation 3 , waarbij kz het golfnummer in de golfgeleider is, die wordt verlaagd als gevolg van beperking in het dwarsvlak, en k is het excitatielichtgolfnummer in vacuüm) werd uitgezet tegen excitatie. Voor kortere golflengten worden hogere modi opgewekt en neemt de index van de effectieve modus toe (de index van de maximale effectieve modus is 1, wat het beperkende geval is waarin de elektromagnetische vlakgolf onbegrensd in de transversale dimensie reist). De effectieve cutoff golflengten van de golfgeleiders werden geschat als de golflengte waarbij de effectieve modus index daalt tot 0. Merk op dat de cirkelvormige geleider λcutoff = 221 nm van eindige elementenmodellering (F) consistent is met de theoretische voorspelling van de cutoff golflengte van een cirkelvormige golfgeleider (λcutoff,analytical = 1,7d = 221 nm, waarbij d de golfgeleiderdiameter is). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Representatieve resultaten van Au ZMW fabricage. (A) Macroscopisch beeld van gouden ZMW-arrays. (B−D) AFM-afbeeldingen van aluminium palen van een kralensjabloon die niet is gegloeid (B),een sjabloon die is gegloeid bij 107 °C voor 20 s (C)en een sjabloon dat is gegloeid bij 107 °C gedurende 25 s (D). (E) AFM-beeld van gouden ZMW's na ontbinding van aluminium palen. (F) Hogere vergroting AFM afbeelding van paneel E. (G) Typisch diepteprofiel van een gouden ZMW. Profiel genomen van de groene lijn getekend in paneel F (schaalbalk = 1 μm in B, C, Den F; 5 μm in E). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voor de colloïdale zelfassemblage (protocolsectie 2) versnelt het gebruik van ethanol in plaats van water als suspensie-oplosmiddel het verdampingsproces, zodat sjablonen in 2−3 min na depositie klaar zijn in plaats van 1−2 uur zoals in eerdere methoden48,49. Het hier gepresenteerde verdampingssedimentatieprotocol is ook eenvoudiger dan eerdere sedimentatieprotocollen die het regelen van de oppervlaktekanteling, temperatuur en luchtvolume boven de suspensie49,50,51vereisen . De deeltjesvolumefractie die in dit protocol wordt gebruikt, is 2,4%, hoger dan de 0,2−0,5% die werd gebruikt in eerdere sedimentatiemethoden48, die colloïden in water-glycerolmengsels resuspendeerden voor veel langere bezinkingstijdschalen. De kwaliteit van de afzettingen is echter robuust voor veranderingen in de deeltjesvolumefractie, waarbij eerdere studies hebben vastgesteld dat deze kan variëren tussen 2−10%49,50,51. De korrelgrootten van de colloïdale kristallen verkregen bij een succesvolle afzetting uit dit protocol zijn 20−30 μm breed, groter dan korrels van eerdere sedimentatiemethoden (meestal enkele honderden nanometers doorsnede)48,49. Macroscopisch gezien zijn de gebieden met een diameter van ongeveer 2 cm colloïdale monolaag ook vergelijkbaar met de 1 cm gebieden die door eerdere methoden zijn geproduceerd49. De grote grootte van de colloïdale kristalsjablonen die in deze methode worden geproduceerd, maakt het ook mogelijk om 3−5 gescheiden stroomkamers44,elk ongeveer 3−4 mm breed, op elke ZMW-dia te maken. Zo kunnen op elke dia meerdere onafhankelijke experimenten met één molecuul worden uitgevoerd.

Het gloeien van de colloïdale kraalsjablonen (protocolsectie 3) na zelfassemblage is een eenvoudige, maar cruciale stap om de achtergrondfluorescentie met de ZMW's voldoende te verminderen. Zoals aanvullende figuur 2 laat zien, is de effectieve cutoff golflengte voor een golfgeleider met de driehoekige doorsnede van een ongeanneald sjabloon 894 nm. Ter vergelijking, de effectieve cutoff golflengte voor een cirkelvormige golfgeleider met een diameter van 130 nm van een gegloeid sjabloon is 221 nm, zoals zowel analytisch bepaald (1,7 keer de diameter van de gids18) als numeriek. Het gebruik van kleinere kralen voor depositie zou ook de grootte van de sjabloonporiën kunnen verminderen, maar de golfgeleiders zouden dan dichter bij 200 nm worden verdeeld, wat rond de diffractiegrens van zichtbaar licht ligt. Bovendien zouden de golfgeleiders driehoekig blijven in dwarsdoorsnede, wat leidt tot niet-symmetrische vermogensvoortplanting door de golfgeleider (Aanvullende figuur 2A−D). Een nadeel van de gloeistap is dat variabiliteit in smelttijd fluctuaties in de diameter van de golfgeleider kan introduceren, dus nauwkeurige timing helpt om variatie tussen batches te minimaliseren. De interstices beginnen te sluiten bij het gloeien langer dan 25 s, en postdiameters nemen niet erg af tussen 20−25 s (Aanvullende figuur 3B−D). Een snelle test voor interstice sluiting is om te controleren of gegloeide sjablonen nog steeds een regenboog diffractie patroon produceren wanneer verlicht met licht en bekeken onder een hoek. Zo niet, dan zijn de meeste interstices waarschijnlijk gesloten. De relatie tussen de gloeitijd en de typische poriediameters is eerder gepresenteerd38.

Na het bereiken van de gewenste poriegrootte tijdens de gloeistap, wordt koper afgezet (stap 4.1) op de sjablonen om een schaduw van het masker te creëren. Het is belangrijk om lijn van gezichtsdepositie te gebruiken, waarbij het metaal de sjabloon zo loodrecht mogelijk benadert. Het vergroten van de afstand tussen het monster en de metaalbron en ervoor zorgen dat de plaat die de sjablonen vasthoudt niet draait, zoals automatisch wordt gedaan in sommige dampdepositiemachines, zal helpen bij het minimaliseren van laterale depositie van metaal op het polystyreensubstraat. Enige zijdelingse afzetting is echter onvermijdelijk, wat de grootte van het interstitiële gat en dus de postdoorsnede vermindert naarmate er meer metaal wordt afgezet52. Dit resulteert in piramidale metalen palen in plaats van prisma-achtige structuren52.

Omdat de koperen palen waarschijnlijk piramidaal zijn in plaats van prismavormig, bedekt aluminium depositie (stap 4.5) bovenop de palen ook een deel van de schuine zijden, waardoor de toegankelijkheid van de koperen ets voor sommige palen wordt geblokkeerd. Zo werd de stap voor het polijsten van lenspapier (stap 4.7 of 5.7) toegevoegd na de eerste inweken in etchant om eventuele koperen palen die nog steeds bedekt zijn met aluminium mechanisch te verstoren. Het storten van meer koper om hogere palen te maken, maakt de palen ook gevoeliger voor mechanische verstoring tijdens het polijsten van lenspapier. Meer dan 500 nm koper mag echter niet worden afgezet, omdat het doel van depositie is om het interstitiële gat te projecteren op de 500 nm middellijn van de 1 μm kralen.

Een andere mogelijke moeilijkheid is het onbedoeld verwijderen van aluminium bekleding tijdens het polijsten van lenspapier (stap 4.7 of 5.7). Het bleek dat verlies van aluminium bekleding tijdens het polijsten vaker voorkwam nadat de gloeistap was toegevoegd, waarschijnlijk als gevolg van verhoogde polystyreenresten, die de aluminiumafhechting aan glas kunnen verstoren (protocolsectie 3). De nachtelijke tolueenweek (stap 4.3 of 5.3) nadat de tapetrek dit probleem had opgelost, is echter verdwenen. In de AFM-afbeelding in figuur 4Ezijn enkele restringen van polystyreen tussen de palen te zien, maar de aluminium bekleding weerstond in stap 4.7 nog steeds meerdere buffs. Als het verlies van de aluminium bekleding een probleem blijft na het 's nachts weken, kan een RCA-1 (standaard clean-1) wasbeurt, piranhawas of verdere zuurstofplasmareiniging worden toegevoegd aan stap 4.4 of 5.4. Deze wasstappen kunnen ook worden toegevoegd na de laatste etsstap (stap 4.7 of 5.7) en vóór passivering om de ZMW's verder te reinigen.

De prestaties van de ZMW's in FRET-experimenten met één molecuul waren vergelijkbaar met die van ZMW's vervaardigd met EBL. In een eerdere studie53 uitvoeren van single molecule FRET op Cy3 gelabeld enkelstrengs DNA met Cy5 gelabeld DNA helicase loader eiwit in oplossing (dezelfde donor-acceptor regeling als die in figuur 6A), FRET gebeurtenissen waren duidelijk waarneembaar op 100 nM Cy5 achtergrond, waren minder duidelijk (lagere acceptor trace signaal naar ruis) bij 1 μM, en niet waarneembaar bij 10 μM. We merken op dat een eerdere studie met commerciële ZMW's single molecule FRET acceptor signalen meldde bij achtergrondconcentraties tot 1 mM54, hoger dan wij en andere eerdere studies42,53 met in-house gefabriceerde ZMW's hebben bereikt. Verdere bespreking van de signaal-naar-achtergrondprestaties onder ZMW's wordt gegeven in Jamiolkowski et al.38. Niet-specifieke interactie van fluorescerend monster met de ZMW-oppervlakken53 is een veel voorkomende uitdaging om de toegang tot hogere concentraties te beperken, vooral als de diffuserende fluorescerende soorten in oplossing een groot macromolecule zijn. Studies met ZMW 's over complexe biochemische systemen zoals vertaling hebben doorgaans vrije fluorescerende substraatconcentraties beperkt tot 100−250 nM55,56,57,58. Ongeacht de beoogde toepassing van de ZMW's zal waarschijnlijk optimalisatie van passiveringsmethoden voor verschillende systemen nodig zijn om een aanvaardbaar signaal naar lawaai bij hoge concentraties te behouden.

Over het algemeen vereist de hier gepresenteerde methode geen gespecialiseerde vaardigheden of apparatuur, maakt parallelle fabricage van veel sjablonen tegelijk mogelijk en kan worden aangepast om ZMW's in verschillende metalen te fabriceren. In dit werk werden koper en aluminium vervangen door respectievelijk aluminium en goud om gouden ZMW's te fabriceren (Aanvullende figuur 3). Dit is voordelig voor laboratoria die passiveringsmethoden van goud gebruiken in plaats van aluminium. Bovendien is aangetoond dat gouden ZMW's de emissie verbeteren voor fluoroforen die absorberen in het rode gebied van het zichtbare spectrum, terwijl aluminium ZMW's de emissie verbeteren voor fluoroforen die absorberen in het groene gebied59. In de toekomst kan de fluorescerende signaalintensiteit van ZMW's die met deze methode zijn vervaardigd, worden verbeterd door in het glas onder de ZMW-metalen bekleding te etsen met HF16,26,60. Dit brengt de geïmmobiliseerde biomoleculen verder weg van de metalen wanden, die fluoroforen kunnen doven61. Bovendien is er een maximale excitatie-verlichtingsintensiteit onder de ingang van de opening, en dit is eerder benut om de emissie van één molecuul26,60te verbeteren .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01GM080376, R35GM118139 en NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 aan Y.E.G., en door een NIAID predoctorale NRSA fellowship F30AI114187 aan R.M.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. Electromagnetism. , Addison-Wesley. Boston, MA. (2002).
  19. Jackson, J. D. Classical electrodynamics. Third edition. , Wiley. New York, NY. (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Tags

Bioengineering zero mode waveguides nano-diafragma fluorescentie van één molecuul nanosfeerlithografie colloïdaal kristal zelfassemblage

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

Fabricage van Zero Mode Waveguides voor hoge concentratie single molecule microscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M.,… More

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter