Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tillverkning av zero mode vågledare för hög koncentration enmolekylmikroskopi

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

ERRATUM NOTICE

Summary

Beskrivs här är en nanosfär litografi metod för parallell tillverkning av nollläge vågledare, som är matriser av nanoapertures i en metallklädd glasmikroskopi coverlip för en molekyl imaging vid nano- till mikromolar koncentrationer av fluororforer. Metoden drar nytta av kolloidal crystal självmontering för att skapa en vågguidemall.

Abstract

I enzymologi med en molekylfluorescens begränsar bakgrundsfluorescens från märkta substrat i lösning ofta fluorforkoncentrationen till pico- till nanomolära intervall, flera storleksordningar mindre än många fysiologiska ligandkoncentrationer. Optiska nanostrukturer som kallas nolllägesvågledare (ZMWs), som är 100−200 nm i diameteröppningar tillverkade i en tunn ledande metall som aluminium eller guld, möjliggör avbildning av enskilda molekyler vid mikromolekylkoncentrationer av fluorforer genom att begränsa synlig ljusutplåda till zeptoliter effektiva volymer. Behovet av dyr och specialiserad nanotillverkningsutrustning har dock förhindrat den utbredda användningen av ZMWs. Vanligtvis erhålls nanostrukturer som ZMWs genom direkt skrivning med hjälp av elektronstrålelitografi, som är sekventiell och långsam. Här, kolloidal eller nanosfär, används litografi som en alternativ strategi för att skapa nanometerskaliga masker för vågledartillverkning. I detta betänkande beskrivs tillvägagångssättet i detalj, med praktiska överväganden för varje fas. Metoden gör det möjligt att göra tusentals ZMW-ämnen i aluminium eller guld parallellt, med slutliga vågledardiametrar och djup på 100−200 nm. Endast vanlig labbutrustning och en termisk förångare för metalldeponering krävs. Genom att göra ZMWs mer tillgängliga för det biokemiska samhället kan denna metod underlätta studier av molekylära processer vid cellulära koncentrationer och frekvenser.

Introduction

Enmolekylstekniker som enmolekyl fluorescensresonansenergiöverföring (smFRET) eller enmolekyl fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är kraftfulla verktyg för molekylär biofysik, vilket möjliggör studier av dynamiska rörelser, konformationer och interaktioner av enskilda biomolekyler i processer som transkription1,2,3, översättning4,5,6och många andra7. För smFRET är total inre reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi en vanlig metod eftersom många tjudrade molekyler kan följas över tiden, och den evanescentvåg som genereras av TIR är begränsad till en 100−200 nm-region intill täcket8. Men även med denna begränsning av excitationsvolymen måste fluorforer av intresse fortfarande spädas ut till pM- eller nM-intervall för att upptäcka enstaka molekylsignaler över bakgrundsfluorescens9. Eftersom Michaelis-Menten-konstanterna av cellulära enzymer vanligtvis ligger i intervallet μM till mM10, är biokemiska reaktioner i enmolekylstudier vanligtvis mycket långsammare än de i cellen. Till exempel uppträder proteinsyntesen vid 15−20 aminosyror per sekund i E. coli11,12, medan de flesta prokaryota ribosomer i smFRET-experiment översätter vid 0,1−1 aminosyra persekund 13. I proteinsyntesen visade kristallstrukturer och smFRET på avstannade ribosomer att överföring av RNAs (tRNAs) fluktuerar mellan "hybrid" och "klassiska" tillstånd före tRNA-mRNA-flyttningssteget14,15. När fysiologiska koncentrationer av flyttningen GTPase faktor, EF-G, var närvarande, observerades dock en annan konformation, mellanliggande mellan hybrid och klassiska tillstånd, i smFRET6. Att studera dynamiska molekylära processer i takt och koncentrationer som liknar dem i cellen är viktigt, men är fortfarande en teknisk utmaning.

En strategi för att öka den fluorescerande substratkoncentrationen är användningen av metallbaserade, sub synliga våglängdsöppningar, så kallade nolllägesvågledare (ZMWs), för att generera begränsade excitationsfält som selektivt excite biomolekyler lokaliserade inom öppningarna16 (Figur 1). Öppningarna är vanligtvis 100−200 nm i diameter och 100−150 nm i djup17. Ovanför en cutoff våglängd relaterad till brunnens storlek och form (λc ≈ 2,3 gånger diametern för cirkulära vågledare med vatten som det dielektriskamediet 18), är inga förökningslägen tillåtna i vågledaren, därav termen nollläge vågledare. Emellertid, ett oscillerande elektromagnetiskt fält, som kallas en evanescent våg, exponentiellt förfaller i intensitet fortfarande tunnlar en kort bit in i vågledaren18,19. Även om ZMW evanescent vågor liknar TIR evanescent vågor har en kortare förfall konstant, vilket resulterar i 10−30 nm effektiv excitation region inom vågledaren. Vid mikromolära koncentrationer av fluorescerande märkta ligander finns endast en eller ett fåtal molekyler samtidigt inom excitationsregionen. Denna begränsning av excitationsvolymen och den därav följande minskningen av bakgrundsfluorescens möjliggör fluorescensavbildning av enstaka molekyler vid biologiskt relevanta koncentrationer. Detta har tillämpats på många system20, inklusive FCS-mätningar av en proteindiffusion21, fret-mätningar med en molekyl av låg affinitet ligand-protein22 och proteinproteininteraktioner23, och spektroelektrokemiska mätningar av enstaka molekylära omsättningshändelser24.

ZMWs har producerats genom direkt mönstring av ett metallskikt med jonstrålefräsning25,26 eller elektronstrålelitografi (EBL) följt av plasmaetsning16,27. Dessa masklösa litografimetoder skapar vågledare i serie och kräver vanligtvis tillgång till specialiserade nanotillverkningsanläggningar, vilket förhindrar utbredd användning av ZMW-teknik. En annan metod, ultraviolett nanoimprint litografi lyft28, använder en kvarts glidform för att trycka en omvänd ZMW-mall på en motståndsfilm som en stämpel. Även om denna metod är mer strömlinjeformad, kräver den fortfarande EBL för tillverkning av kvartsformen. Den här artikeln presenterar protokollet för en enkel och billig mallad tillverkningsmetod som inte kräver EBL- eller jonstrålefräsning och är baserad på nära packning av nanosfärer för att bilda en litografisk mask.

Nanosfär eller "naturlig" litografi, som först föreslogs 1982 av Deckman och Dunsmuir29,30, använder självmontering av monodisperse kolloidala partiklar, allt från tiotals nanometer till tiotals mikrometer31, för att skapa mallar för mönstring via etsning och /eller nedfall av material. De tvådimensionella (2D) eller tredimensionella (3D) förlängda periodiska matriserna av kolloidala partiklar, så kallade kolloidala kristaller, kännetecknas av en ljus iridescence från spridning och diffraktion32. Även om den används mindre än elektronstråle eller fotolitografi är denna maskeringsmetod enkel, låg kostnad och lättskalad för att skapa funktionsstorlekar under 100 nm.

Att styra självmonteringen av kolloidala partiklar avgör framgången med att använda kolloidala kristaller som masker för ytmönster. Om partiklarnas storlek och form är homogena kan kolloidala partiklar lätt självmonteras med sexkantig förpackning, driven av entropisk utarmning33. Vattenavdunstning efter droppbeläggning är en effektiv väg till sediment de kolloidala partiklarna, även om andra metoder inkluderar doppbeläggning34,spinnbeläggning 35, elektroforesisk nedfall36, och konsolidering vid ett luftvattengränssnitt37. Protokollet som presenteras nedan är baserat på avdunstningssedimenteringsmetoden, som var den enklaste att genomföra. De triangulära intersticesna mellan nära-packade polystyrenpärlor bildar öppningar som för att plätera en offer belägger med metall som bildar postar (Figurera 2 och Kompletterande figurera 1). Kort glödgning av pärlor innan detta steg justerar formen och diametern på dessa stolpar. Pärlorna tas bort, ett slutligt metallskikt deponeras runt stolparna och sedan tas stolparna bort. Efter de två metalldepositionsstegen på den kolloidala nanomasken, avlägsnande av mellanliggande stolpar och ytkemimodifiering för passivering och tjudring är ZMW-matriser redo att användas för avbildning av enstaka molekyler. Mer omfattande karakterisering av ZMW optiska egenskaper efter tillverkning kan hittas i en medföljande artikel38. Förutom en termisk förångare för ångdeposition av metallerna krävs inga specialiserade verktyg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla steg kan slutföras i allmänt labbutrymme.

1. Rengöring av glasöverdrag

  1. För att ge en ren yta för avdunstningsdeposition av kolloidala partiklar, placera 24 x 30 mm optiska borosilikatglaskåpor (0,16−0,19 mm tjocklek) i de räfflade skären i en kolinerglasmålningsburk för rengöring.
    OBS: Se till att täckena står upprätt och är väl åtskilda så att alla ytor är tydligt exponerade under rengöringsprocessen.
  2. Häll tillräckligt med aceton i färgburken för att täcka täcklocken, placera locket på och ultraljudsoxidera i 10 minuter vid 40 °C.
  3. Häll ut acetonen och skölj täckena genom att fylla färgburken med destillerat H2O och häll ut vattnet. Upprepa 2 gånger till.
  4. Upprepa ultraljudsbehandlingen av aceton (steg 1.2 och 1.3) igen.
  5. Häll tillräckligt med 200 mM KOH i burken för att täcka täcken och ultraljudsbehandling, täckt, i 20 min vid 40 °C.
    OBS: KOH etsar glaset något.
  6. Skölj täckena med destillerat H2O 6 gånger.
  7. Tillsätt etanol för att täcka täckglasen, tillsätt locket och ultraljudsa i 10 min vid 40 °C.
  8. Skölj täckglasen med destillerat H2O 3 gånger.
  9. Plocka upp varje täckglas vid kanten med hjälp av mjuka tångar och torka täckena med N2-gas. Rör endast vid överdragslockets kanter. Placera var och en av de torkade, rengjorda täckena i en individuell ren Petri-skål.

2. Avdunstningsdeposition av polystyrenpärlor

  1. För att skapa den kolloidala kristallmasken för ZMW-matrisen, centrifugera 50 μL med 1 μm diameter, icke-funktionaliserade polystyrenpärlor (2,5% w/v i vatten) vid 15 000 x g, 25 °C i 5 min.
    OBS: Innan pärlorna rörs ska stamlösningen vara kort virvlad om pärlorna har lagt sig till botten av flaskan.
  2. Kassera supernaten och lämna så lite vatten som möjligt kvar.
    OBS: Restvatten kan ändra avdunstningsegenskaperna hos etanolresuspension39, så avlägsnande av en liten mängd pärlor för att avlägsna allt vatten är acceptabelt.
  3. Återanvänd pärlor från steg 2,2 i 50 μL 1:400 TritonX-100:etanollösningsmedel. Pipett upp och ner flera gånger för att noggrant blanda pärlorna med lösningsmedlet.
    OBS: TritonX-100:etanollösningsmedel ska förseglas med paraffinfilm efter användning och beredas färska en gång i månaden. Pärlor tenderar att fästa på sidorna av ett plastkärl, till exempel ett mikrocentrifugrör, så pipett längs sidorna för att säkerställa att alla pärlor återanvänds.
  4. För att sätta upp en fuktighetskammare för deposition, placera 6 Petri-rätter, var och en med ett täckskydd, på en bänk i en linje med lock som lämnas något på glänt. I varje maträtt flyttar du täcket till det öppna området så att täckglasen utsätts för miljön när luftfuktigheten ökar i nästa steg.
  5. Placera en hygrometer och en liten elektrisk fläkt centrerad bakom Petri-disken.
  6. Registrera den relativa luftfuktigheten (RH) i labbet. Fyll en 200 ml bägare med 150−200 ml ~75 °C vatten och placera den bakom fläkten.
  7. Slå på fläkten och täck petriskålar, fläkt, bägare och hygrometer med en vält, genomskinlig plastbehållare (66 cm x 46 cm x 38 cm).
  8. Låt RH i kammaren stiga till 70−75%, vilket vanligtvis tar 5−10 min.
    OBS: Om det omgivande labbet RH är lågt (under ~ 50%), låt kammaren nå en högre RH, men inte högre än 80%, för att kompensera för förlust av fuktighet under nedfallet (se nedan).
  9. När RH når 70−75%, spela in RH och lyft upp plastbehållaren något för att snabbt placera skydd på Petri-diskarna, vilket förhindrar övertänkning av täckglasen.
    OBS: Temperaturen i kammaren blir något varmare än rumstemperaturen, vanligtvis 25−26 °C, till följd av befuktning. Om fukt är synlig på täckena, är glasytorna för våta. En kommersiell handsklåda kan förenkla den här delen av protokollet.
  10. Låt RH i kammaren fortsätta att stiga till 85 procent. Registrera då RH i fuktighetskammaren och pipetten 5 μL av pärlupphängningen på mitten av varje täckglas.
  11. Stäng kammaren och Petri disk efter varje deposition för att minimera fuktförlusten. Sikta på att avsluta alla 6 depositioner inom 2 min.
  12. Spela in RH i kammaren efter förhöret.
    OBS: RH efter deposition hjälper till att mäta hur snabbt luftfuktigheten förlorades under depositionen, vilket beror på omgivande labbförhållanden. För en typisk lyckad körning börjar kammaren på 85% RH före deposition och slutar på 70−75% RH efter depositionen.
  13. Låt pärldroppar sprida sig och torka i 5 minuter.
    OBS: Om kolloidalkristallerna har många hål eller flerskiktade områden, var kammaren sannolikt för fuktig respektive torr. Justera den relativa luftfuktigheten för att stänga petriskålarna och börja depositionerna (se resultatavsnittet för vidare diskussion om optimering).

3. Pärla glödgning för att minska porstorleken i kolloidal kristallmall

  1. För att ge en enhetlig temperaturyta för glödgning av polystyrenpärlorna, som smalnar av interpärlorna interstices och rundar interstices hörn, placera en platt, fräst aluminiumplatta ovanpå en standard keramisk värmeplatta.
  2. Ställ in temperaturen på värmeplattan på 107 °C, glasövergångstemperaturen för polystyren40.
    OBS: För att uppnå stabil och exakt temperatur hölls en termoelementsond i ett 2−3 mm brett och 4−5 mm djupt hål i aluminiumplattan.
  3. Placera ett täckglas som innehåller pärlmallen på den heta aluminiumplattan och glödg i 20 s (se diskussionsavsnittet för förklaring av smälttid).
  4. Efter uppvärmning, ta bort täcket från aluminiumplattan och placera det snabbt på en annan rumstemperatur aluminiumyta för att kyla den.
    OBS: Det är bra att antingen få täckena att hänga något över kanten på plattan eller fräsa grunda kanaler (se den medföljande videon) i plattan för att underlätta upphämtning av täckglasen.

4. Nanotillverkning av vågledare i aluminium nollläge med hjälp av den kolloidala kristallmallen

  1. Använd termisk eller elektronstrålens avdunstningsdeposition, deponera 300 nm koppar vid 2 Å/s över kolloidalkristallmallen för att generera stolpar i interstices mellan pärlorna.
  2. Ta bort överflödig metall ovanpå pärlorna genom att försiktigt trycka på ytan med tejp. Skala långsamt tejpen för att dra av metallen.
    OBS: Vissa små fläckar av reflekterande överflödig metall kan finnas kvar efter tejpens drag, och dessa kan ofta avlägsnas med en ström av N2-gas. Om betydande fläckar av reflekterande överflödig metall kvarstår efter tejpdragningen, försök att blötlägga mallarna i toluen i 2 h för att delvis lösa upp polystyrenpärlorna. Tvätta täckena med destillerat vatten, torka med N2och upprepa tejpen. Den extra blötläggningen bör inte helt lösa upp pärlorna, eftersom pärlorna hjälper till att skydda stolparna från skador under tejpdragningen.
  3. För att lösa upp polystyrenpärlorna, placera pärlmallarna i toluen och blötlägg över natten.
    VARNING: Toluenångor kan vara giftiga. Arbeta med toluen under en välventilerad huva och använd personlig skyddsutrustning, inklusive handskar, skyddsglasögon och en labbrock. Toluen ska förvaras i ventilerade skåp avsedda för brandfarliga vätskor.
  4. Skölj mallarna en gång med kloroform och två gånger med etanol efter inkubationen. Hantera täcken noggrant vid denna punkt eftersom de känsliga 200−300 nm höga metallstolparna nu exponeras. Torka mallarna med N2 och ta bort restpolymer och föroreningar i en syreplasmarengöringsmedel i 30 minuter.
    VARNING: Kloroformångor kan vara giftiga. Arbeta med kloroform under en välventilerad huva och använd personlig skyddsutrustning, inklusive handskar, skyddsglasögon och en labbrock. Kloroform ska förvaras i ventilerade skåp bort från andra brandfarliga lösningsmedel.
  5. Använd termisk eller elektronstrålens avdunstningsdeposition, deponera 3 nm av ett titan vidhäftningsskikt vid 1 Å/s följt av 100−150 nm aluminium vid 4 Å/s runt och ovanpå kopparstolparna.
    OBS: Man kan använda tjockare beklädnad för att få djupare guider och bättre dämpning av bakgrundsfluorescens, men detta minskar också avkastningen efter att ha exponerat och löst upp inläggen i nästa steg (se diskussionsavsnittet).
  6. För att lösa upp metallstolparna, blötlägg täckena i koppar etchant (citronsyrabaserad; Materialförteckning) i 2 timmar.
    VARNING: Metall etchant kan orsaka brännskador i huden. Arbeta med etchants under en välventilerad huva och använd skyddsutrustning. Tvätta händerna noggrant efter hantering. Metall etchant ska förvaras i ventilerade skåp avsedda för frätande vätskor.
  7. Skölj täckena med destillerat vatten, torka med N2och polera försiktigt metallbeklädnadens yta med linspapper för att exponera eventuella stolpar som fortfarande är täckta av beklädnad. Placera täckena tillbaka i koppar etchant i ytterligare 2 timmar, skölj sedan igen med destillerat vatten och torka med N2.
    OBS: ZMW-diabilder ska förvaras i täckta, rena petriskålar för att hålla dem fria från föroreningar.

5. Nanotillverkning av vågledare i guld nollläge med hjälp av den kolloidala kristallmallen

OBS: Metoden för att tillverka ZMWs i guld (Kompletterande figur 1), som speglar protokollet för att tillverka aluminium ZMWs, finns i detta avsnitt.

  1. Använd termisk eller elektronstrålens avdunstningsdeposition, deponera 3 nm av ett titan vidhäftningsskikt vid 1 Å/s följt av 300 nm aluminium vid 4 Å/s.
  2. Ta bort överflödig metall ovanpå pärlorna genom att försiktigt trycka på ytan med tejp. Skala långsamt tejpen för att dra av metallen.
  3. För att lösa upp polystyrenpärlorna, placera pärlmallarna i toluen och blötlägg över natten.
  4. Skölj mallarna en gång med kloroform och två gånger med etanol efter inkubationen. Torka mallarna med N2 och avlägsna kvarvarande polymerföroreningar i en syreplasmarengöringsmedel i 30 minuter.
  5. Använd termisk eller elektronstråle avdunstningsdeposition, deponera 100−150 nm guld vid 5 Å/s runt och ovanpå aluminiumstolparna.
  6. För att lösa upp metallstolparna, blötlägg täckena i aluminium etchant (fosforsyrabaserad; Materialförteckning) i 1 timme.
  7. Skölj täckena med destillerat vatten, torka med N2och polera försiktigt metallbeklädnadens yta med linspapper för att exponera eventuella stolpar som fortfarande är täckta av beklädnad. Placera täckena tillbaka i aluminium etchant i 1 h, skölj sedan igen med destillerat vatten och torka med N2.
    OBS: ZMW-diabilder ska förvaras i täckta, rena petriskålar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Självmonteringen av polystyrenkolloidala partiklar via avdunstningssedimentering (steg 2.1−2.13) kan ge en rad resultat eftersom det kräver kontroll av lösningsmedlets avdunstningshastighet. Men eftersom depositionerna är snabba (10−15 min per omgång) kan proceduren snabbt optimeras för olika omgivande labbförhållanden. Figur 3A visar en välformad kolloidal mall efter nedfall och avdunstning. Makroskopiskt är pärlor regionen cirkulär, med gränser som definieras av en ogenomskinlig, flerskiktad ring av pärlor. De genomskinliga, men inte vita områdena i bilden är de önskade monoskiktområdena. Figur 3B visar en kolloidal mall som var packad i en alltför fuktig miljö (80% RH när Petri-rätter stängdes). Dessa mallar tenderar att inte ha en ren cirkulär gräns och har flerskiktade tendrils som sträcker sig utåt. Nedfallet är acceptabelt och kan användas i efterföljande faser, men hålen i gitteret minskar antalet användbara ZMW-matrisområden för enkelmolekylsavbildning. Figur 3C visar en kolloidal mall som var packad i en alltför torr miljö (65% RH när Petri diskar stängdes). Dessa mallar är vanligtvis mindre i diameter jämfört med de ideala, väl uppslagsmallarna. Depositionen kan användas, men de flerskiktade, vita regionerna, som sträcker sig inåt, minskar det område som kan användas för avbildning. Således rekommenderar vi inte att utföra mer än 6 depositioner åt gången eftersom depositioner mot slutet av processen kommer att inträffa vid en lägre fuktighet när kammaren öppnas och stängs. Figur 3D visar regnbågsmönstret som produceras genom diffraktion av reflekterat ljus från polystyrenkristallen. Detta mönster kan användas för att bekräfta framgång och kvalitet på kristallförpackning med öga. Figur 3E,F visar bilder av välpackade kolloidala mallar. Defekterna mellan korn uppstår från störning under avdunstningssedimenteringen41, och distinkta korn kan ses med ett 10x-mål. Att undersöka kolloiddepositionerna med ett lågeffektljusmikroskop kan därför också användas för att bedöma förpackningen.

Efter deponering av koppar på de glödgade kolloidala mallarna (steg 4.1) bör regnbågsdiffraktionsmönstret fortfarande vara synligt och förbättras av den reflekterande metallbeläggningen på pärlornas toppar (figur 4A,B). Mallarna förlorar det reflekterande regnbågsdiffraktionsmönstret efter scotch tape pull (steg 4.2) som tar bort överskott av koppar (Figur 4C). Figur 4D,E visar AFM-bilder av ett typiskt fält av kopparstolpar efter metalldeponering. Defekterna mellan kolloidala kristallkorn i figur 3E är synliga i kopparpostbilderna som större kopparregioner. Analys av AFM-bilder visar att för en koppardeponeringstjocklek på 300 nm är de eventuella kopparstolparna i genomsnitt 255 nm (figur 4F) i höjd och 121 nm i diameter (Figur 4G).

Nedfall av aluminiumbeklädnaden (steg 4.5) där pärlorna var och ovanpå kopparstolparna, och efterföljande upplösning av stolparna (steg 4.6 och 4.7) resulterar i aluminium ZMWs som visas i figur 5A−C. Defekter mellan kolloidala kristallkorn är synliga som större öppningar (figur 5B). Det genomsnittliga avståndet mellan ZMW-centra i figur 5C är 559 nm, i överensstämmelse med det avstånd som fastställts av den sexkantiga nära förpackningsgeometrin hos 1 μm-pärlor ( Equation 1 Med hjälp av polystyrenmallar som glödgades i 20 s resulterar i vågledare som i genomsnitt är 118 nm i diameter (Figur 5D,E), överensstämmer med stolpens diametrar och tillräckligt liten för att skära av förökning av synligt ljus. En höjdprofil för en vågledare från figur 5D visar också att den är ~120 nm djup.

Fret med en molekyl utfördes i ZMWs för att testa funktionaliteten (figur 6A). Ett typiskt fält av ZMWs för avbildning visas i figur 6B, som innehåller >3000 vågledare i ett 40 x 80 μm synfält. ZMWs passiverades först med hjälp av protokoll som beskrivitstidigare 42,43. Kortfattat var aluminium ZMWs passiverade med poly (vinylfosfonsyra) för att täcka aluminiumbeklädnaden följt av metoxi-avslutad polyetylenglykol (PEG) dopad med biotin-avslutad PEG för att täcka glasbottnarna på ZMWs. Guld ZMWs kan passiveras med tiol-derivatized PEG för att täcka guldbeklädnaden följt av en liknande PEG-behandling för glasbottnarna. Flödeskammare, ~20 μL volym, konstruerades sedan för en enda molekyl imaging44. En enda molekyl FRET imaging av DNA duplex utfördes som beskrivits tidigare38. Kort, 100 pM−1 nM cyanin-3/cyanin-5 (Cy3/Cy5), biotinylerade DNA-duplex (33 baspar längd) inkuberades i 10 min i flöde kanaler funktionella med streptavidin (5 min inkubation, 0,5 mg/mL lösning). Koncentrationen av märkta makromolekyler kan titreras för att uppnå ~ 20% belastning av vågledare med en molekyl, vilket leder till <5% vågledare laddade med mer än en molekyl, baserat på Poisson distribuerad belastning (de flesta vågledare, ~ 75%, kommer inte att ha några molekyler)45. Obundet DNA spolades bort med nukleasfri duplexbuffert följt av belysningsbuffert (0,3% [w/v] glukos, 300 μg/mL glukosoxidas, 120 μg/mL katalas och 1,5 mM Trolox [6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chromane-2-karboxylsyra]). Icke-biotinylerade Cy5-märkta DNA-duplex (33 basparlängd) fanns i belysningsbufferten vid 0, 50, 100 och 500 nM som bakgrundsfluorforer i lösning. Enmolekyl fret spår från immobiliserade Cy3/Cy5 duplex DNA molekyler registrerades med ett specialbyggt TIRF mikroskop justerat till epi-fluorescens villkor. Filmer spelades in med ett 1,48 numeriskt bländare (NA) 100x oljesänkningsmål med alternerande 532 nm och 640 nm excitation (100 ms exponering) och en dubbel vy spektral splitter för att registrera Cy3 och Cy5 utsläpp samtidigt på en elektron-multiplicerande laddning-kopplade enhet (EMCCD) kamera. Fret-spår med enstegsblekmedel i Cy5-kanalen kunde påvisas vid alla koncentrationer av omgivande Cy5-testade (figur 6C−F). I jämförelse skulle enstaka molekyler endast kunna detektera vid TIRF-belysning med pM till låga nM-lösningsfluoroforkoncentrationer46.

Figure 1
Bild 1: Schematisk vågledare i nollläge. Diagram över ZMW-matrisen med utökat tvärsnittsdiagram över en enda ZMW till höger. Enstaka fluorescerande märkta enzymer av intresse (brun ribosom med röd cirkel för att representera fluorescerande färgämne) kemiskt immobiliserade (via mRNA i detta exempel) till ZMWs glasbotten (vanligtvis funktionell med biotinylerad-PEG) kan avbildas med en typisk laserbaserad epifluorescensmikroskopi inställning. 532 nm excitationsljuset (gröna pilar) reflekteras vid glasmetallgränsen på grund av bländarens lilla storlek (100−200 nm diameter), men en icke-förökande evanescentvåg som sönderfaller exponentiellt i intensitet finns inom ZMW. Detta resulterar i ett 10−30 nm effektivt belysningsdjup (grön skuggning i bländare). Individuella fluorescerande ligands (blå tRNAs med gröna cirklar som fluorescerande taggar) vid nM till μM koncentrationer tillsätts. En individuell ligand som sprider sig in i bländaren och interagerar med enzymet avbildas utan oöverkomlig bakgrundsfluorescens. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Schematisk kollegial templatingmetod utvecklad för att tillverka ZMW-matriser i aluminium. Polystyrenpärlor, 1 μm i diameter, deponeras och monteras själv på ett rengjort glaslock, enligt beskrivningen i avsnitt 2 i protokollet. Pärlor glödgas sedan för att minska porstorlekarna (avsnitt 3), följt av koppardeponering och pärlupplösning i toluen. Aluminium deponeras runt och ovanpå kopparstolparna, som sedan selektivt etsas bort för att lämna efter sig ett sexkantigt utbud av nanoapertures (avsnitt 4). För de tre sista stegen ges tvärsnittsvyer till höger om planvyerna för att visa bredderna och höjderna på kopparstolparna och aluminium ZMWs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa resultat av avdunstningsdeponering av kolloider. A) Exempel på optimal kolloiddeposition. B) Exempel på en acceptabel kolloid nedfall där förhållandena var fuktigare (80% RH) än idealiska. Hål i kristallmonalayern är uppenbara. c) Exempel på en acceptabel kolloiddeposition där förhållandena var torrare (65% RH) än optimala. Monoskiktsregionerna är något genomskinliga medan flerskiktade områden är vita och ogenomskinliga (omkrets och streck inåt). D) En kolloidal kristall upplyst med vitt ljus för att framhäva regnbågsdiffraktionen från kristallerna. (E) AFM-bild (tappningssond AFM i luften) av ett monoskikt av sexkantigt packade polystyrenpärlor från en lyckad kolloiddeposition (skalstång = 10 μm). (F) Utökad AFM-bild av packade pärlor (skalstreck = 2 μm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Makroskopiska och mikroskopiska bilder av ZMW-mallar efter koppardeposition. a) Bild av diabilder efter fysisk avdunstning av koppar ovanpå pärlmallarna. B) Regnbågsdiffraktionsmönster från pärlmallar efter koppardeponering. (C) Bild på en mall (höger) efter en tejpdragning för att ta bort överflödig koppar och tejpen (vänster). (D) AFM-bild av kopparstolpar efter tejpdragning och fullständig upplösning av polystyrenpärlor (skalstång = 5 μm). e) Högre förstoring AFM-bild av panel D (skalstång = 2 μm). F)Histogram av kopparstolpens höjder (definieras som maximal höjdmätning inom varje stolpe), n = 534. G)Histogram av kopparstolpen Feret diametrar, n = 201. Feretdiameter är det maximala avståndet mellan två parallella linjer tangent till postgränsen (kvantifierad i bildJ47). För att identifiera partiklar för analys användes en tröskel halvvägs mellan toppen av beklädnaden och bottenglasytan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Makroskopiska och mikroskopiska bilder av ZMW i aluminium. A) Bild av diabilder efter fysisk avdunstningsdeposition av 150 nm aluminium runt och ovanpå kopparstolparna. (B) AFM-bild av aluminium ZMWs efter postupplösning (skalstång = 5 μm). C) Högre förstoringsbild av panel B (skalstreck = 0,2 μm). D) Typisk djupprofil för en enskild ZMW från panel C. Profil hämtad från den gröna linjen som ritats i panel C. (E) Histogram av ZMW Feret diametrar, n = 240. Feretdiametrar mättes enligt figur 4. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Fret-avbildning med en molekyl i ZMWs. A) Schematiska (ej skalade) av fret-avbildning av Cy3, Cy5-märkta DNA-duplex i ZMWs med Cy5-märkta duplex i bakgrunden. B) Exempelfält för ZMWs under vit ljusbelysning (skalstång = 10 μm). - Jagär inte så bra på att ta dig till det här. Fret-inspelningar av DNA-duplex immobiliserade i ZMWs i närvaro av 0 (C),50 (D),100 (E)och 500 nM (F) Cy5-märkta duplex i lösning. För varje koncentration visar den övre panelen cy3 (grön) och cy5 (röd) fluorescensintensitet under 532 nm laserbelysning (FRET-avbildning), mittpanelen visar Cy5-fluorescensintensiteten under 640 nm laserbelysning (direkt acceptans eller excitation), och den lägsta panelen visar FRET-effektiviteten ( Equation 2 ) beräknad från den råa Cy3 (ID) och Cy5 (IA) fluorescensintensiteterna. Under avbildningen växlade excitationsvåglängden mellan 532 och 640 nm var 100 ms. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: Schematisk kollegial templatingmetod utvecklad för att tillverka ZMW-matris i guld. Protokoll för att tillverka ZMW-matris i guld är analogt med protokollet för att tillverka ZMW-matris i aluminium (figur 2). Istället för att deponera koppar ovanpå polystyrenpärlorna deponeras aluminium. Efter att ha löst upp pärlorna i toluen deponeras guld istället för aluminium ovanpå stolparna. Aluminiumstolpar etsas sedan selektivt för att lämna efter sig ZMW-matris i guld. För de tre sista stegen ges tvärsnittsvyer till höger om planvyerna för att visa bredderna och höjderna på aluminiumstolparna och guld ZMWs. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Finita elementmodellering av elektromagnetisk fältförökning i ZMWs. (A−D) Korsa avsnitt av storleken på den tidsgenomsnittliga Poynting-vektorn (W/m2)genom en vågledare gjord av en oanmämerad mall (A,C) och en glödgad mall (B,D). Linjärt polariserade elektromagnetiska planvågor (1 W fördelade över bildens område) vid de våglängder som anges i figuren (400 nm eller 1 000 nm) projicerades på underytan, och det lägsta (grundläggande) läget, som har det lägsta vågn talet, beräknades med hjälp av modelleringsprogram (Materialförteckning) med den finita elementmetoden för att lösa Maxwells ekvationer och lämpliga gränsförhållanden. Vågledarnas gränser antogs vara perfekta elektriska ledare, som är väl approximerade av aluminium- eller guldväggar. Tvärsnittet från den oannealerade vågledarmallen bestämdes av den sexkantiga förpackningen av cirklar med 1 μm diameter, och de tre spetsiga spetsarna från den resulterande triangulära formen klipptes till ~ 60 nm bredd för att modellera en realistisk fysisk bländare. Tvärsnittet från de glödgade mallarna approximerades som en cirkel 130 nm i diameter. Båda vågledarna hade ett djup på 130 nm, liknande beklädnadsdjupet efter tillverkning. (E,F) Förutom excitationsvåglängder på 400 nm och 1 000 nm löstes modellerna vid 100 excitationsvåglängder jämnt förde mellan 400 nm och 1 000 nm, och det effektiva Equation 3 lägesindexet (definierat som , där kz är vågnumret i vågledaren, som minskas på grund av begränsningar i det tvärgående planet, och k är excitationsljusvågen i vakuum) ritades mot excitationsvåglängd för de triangulära (E) och cirkulära (F) vågguiderna. För kortare våglängder är högre lägen upphetsade, och det effektiva lägesindexet ökar (max effektivt lägesindex är 1, vilket är det begränsande fallet där den elektromagnetiska planvågen färdas obundet i den tvärgående dimensionen). Vågledarnas effektiva våglängder uppskattades som den våglängd vid vilken det effektiva lägesindexet sjunker till 0. Observera att den cirkulära styrningen λcutoff = 221 nm från finita elementmodellering (F) överensstämmer med den teoretiska förutsägelsen av en cirkulär vågledares cutoff våglängd (λcutoff,analytisk = 1,7d = 221 nm, där d är vågstyrningens diameter). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Representativa resultat från Au ZMW-tillverkning. A) Makroskopisk bild av ZMW-matriser i guld. (B−D) AFM-bilder av aluminiumstolpar från en pärlmall som inte glödgades (B),en mall som glödgades vid 107 °C för 20 s (C)och en mall som glödgades vid 107 °C i 25 s (D). (E) AFM-bild av guld ZMWs efter upplösning av aluminiumstolpar. (F) Högre förstoring AFM-bild av panel E. (G) Typisk djupprofil för en guld ZMW. Profil hämtad från den gröna linjen som ritats i panel F (skalstång = 1 μm i B, C, Doch F; 5 μm i E). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För kolloidal självmontering (protokoll avsnitt 2) påskyndar användningen av etanol snarare än vatten eftersom suspensionslösningen påskyndar avdunstningsprocessen så att mallarna är klara på 2−3 min efter nedfall snarare än 1−2 h som i tidigaremetoder 48,49. Det avdunstningssedimenteringsprotokoll som presenteras här är också enklare än tidigare sedimenteringsprotokoll som kräver kontroll av ytlutning, temperatur och luftvolym översuspensionen 49,50,51. Partikelvolymfraktionen som används i detta protokoll är 2,4%, högre än de 0,2−0,5% som används i tidigare sedimenteringsmetoder48, som återanvände kolloider i vatten-glycerolblandningar under mycket längre sedimenteringstidsvågar. Kvaliteten på depositionerna är dock robust för förändringar i partikelvolymfraktionen, med tidigare studier som visar att det kan varieras mellan 2−10%49,50,51. Kornstorlekarna hos de kolloidala kristaller som erhålls vid en lyckad nedfall från detta protokoll är 20−30 μm tvärs över, större än korn från tidigare sedimenteringsmetoder (vanligtvis flera hundra nanometer över)48,49. Makroskopiskt är de cirka 2 cm i diameter områden av kolloidal monoskikt också jämförbara med de 1 cm områden som producerats med tidigare metoder49. Den stora storleken på de kolloidala kristallmallar som produceras i denna metod gör det också möjligt att göra 3−5 separeradeflödeskammare 44, var och en ca 3−4 mm bred, att göras på varje ZMW-glid. Således kan flera oberoende enstaka molekylexperiment utföras på varje bild.

Annealing av kolloidal pärla mallar (protokoll avsnitt 3) efter självmontering är ett enkelt, men avgörande steg för att tillräckligt minska bakgrund fluorescens med ZMWs. Som kompletterande figur 2 visar är den effektiva cutoff-våglängden för en vågledare med det triangulära tvärsnittet från en oanmält mall 894 nm. I jämförelse är den effektiva cutoff våglängden för en cirkulär vågledare med diametern 130 nm från en glödgad mall 221 nm, vilket bestäms både analytiskt (1,7 gånger diametern på ledaren18) och numeriskt. Att använda mindre pärlor för deposition kan också minska storleken på mallporerna, men vågledarna skulle då vara fördelade närmare än 200 nm, vilket ligger runt diffraktionsgränsen för synligt ljus. Dessutom skulle vågledarna förbli triangulära i tvärsnitt, vilket leder till icke-symmetrisk kraftspridning genom vågledaren (Kompletterande figur 2A−D). En nackdel med glödgningssteget är att variation i smälttiden kan införa fluktuationer i vågledardiametern, så noggrann timing hjälper till att minimera variationen mellan partier. Interstices börjar stänga vid glödgningstider längre än 25 s, och postdiametrar minskar inte särskilt mycket mellan 20−25 s (Kompletterande figur 3B−D). Ett snabbt test för interstice stängning är att kontrollera om glödgade mallar fortfarande producerar en regnbåge diffraktion mönster när de lyser med ljus och ses i en vinkel. Om inte, har majoriteten av interstices sannolikt stängt. Förhållandet mellan glödgningstid och typiska pordiametrar har presenterats tidigare38.

Efter att ha uppnått önskad porstorlek under glödgningssteget deponeras koppar (steg 4.1) på mallarna för att skapa en skugga av masken. Det är viktigt att använda siktlinjedeposition, med metallen närmar sig mallen så vinkelrätt som möjligt. Således ökar avståndet mellan provet och metallkällan samt säkerställer att plattan som håller mallarna inte snurrar, vilket automatiskt görs i vissa ångdepositionsmaskiner, kommer att bidra till att minimera sidodepositionen av metall på polystyrensubstratet. Emellertid är en del lateralt nedfall oundvikligt, vilket minskar storleken på det interstitiella hålet och därmed post tvärsnittet som mer metall deponeras52. Detta resulterar i pyramidala metallstolpar snarare än prismaliknande strukturer52.

Eftersom kopparstolparna sannolikt är pyramidala snarare än prismaformade, täcker aluminiumdepositionen (steg 4.5) ovanpå stolparna också några av de sluttande sidorna, vilket blockerar tillgängligheten för koppar etchant för några av stolparna. Således lades linspappersbättringssteget (steg 4,7 eller 5,7) till efter den första blötläggningen i etchant för att mekaniskt störa alla kopparstolpar som fortfarande är täckta av aluminium. Deponering av mer koppar för att skapa högre stolpar gör också stolparna mer mottagliga för mekaniska störningar under linspappersbättring. Mer än 500 nm koppar bör dock inte deponeras eftersom målet med nedfallet är att projicera det mellansideshålet vid 500 nm mittlinjen på 1 μm pärlor.

En annan potentiell svårighet är oavsiktlig borttagning av aluminiumbeklädnad under linspappersbättring (steg 4.7 eller 5.7). Det konstaterades att förlust av aluminiumbeklädnad under buffring blev vanligare efter att glödgningssteget tillsattes, sannolikt på grund av ökade polystyrenrester, vilket kan störa aluminium vidhäftning till glas (protokollavsnitt 3). Men den över natten toluene blötläggning (steg 4.3 eller 5.3) efter tejpdragning löste detta problem. I AFM-bilden i figur 4Ekan vissa restringar av polystyren ses mellan stolparna, men aluminiumbeklädnaden stod fortfarande emot flera buffs i steg 4.7. Om förlust av aluminiumbeklädnaden fortfarande är ett problem efter den över natten toluen blötläggningen, kan en RCA-1 (standard clean-1) tvätt, piranha tvätt eller ytterligare syre plasma rengöring läggas till steg 4.4 eller 5.4. Dessa tvättsteg kan också läggas till efter det sista etsningssteget (steg 4.7 eller 5.7) och före passivering för att ytterligare rengöra ZMWs.

Prestandan hos ZMWs i fret-experiment med en molekyl liknade ZMWs som tillverkades med EBL. I en tidigare studievar 53 som utförde fret med en enda molekyl på Cy3 märkt ensträngat DNA med Cy5-märkt DNA-helicase loaderprotein i lösning (samma givar-acceptorarrangemang som i figur 6A),FRET-händelser tydligt urskiljbara vid 100 nM Cy5-bakgrund, var mindre tydliga (lägre acceptorspårningssignal till brus) vid 1 μM och kunde inte urskiljas vid 10 μM. Vi noterar att en tidigare studie med kommersiella ZMWs rapporterade enmolekyl fret acceptor signaler vid bakgrundskoncentrationer så hög som 1 mM54, högre än vi och andra tidigarestudier 42,53 med interna tillverkade ZMWs har uppnått. Ytterligare diskussion om signal-till-bakgrund prestanda bland ZMWs ges i Jamiolkowski et al.38. Ospecificerad interaktion mellan fluorescerande prov och ZMW-ytorna53 är en vanlig utmaning som begränsar tillgången till högre koncentrationer, särskilt om den spridande fluorescerande arten i lösningen är en stor makromolekyl. Studier med ZMWs på komplexa biokemiska system som översättning har vanligtvis begränsat fria fluorescerande substratkoncentrationer till 100−250 nM55,56,57,58. Oavsett den avsedda tillämpningen av ZMWs kommer optimering av passiveringsmetoder för olika system sannolikt att vara nödvändig för att upprätthålla godtagbar signal till buller vid höga koncentrationer.

Sammantaget kräver metoden som presenteras här inga specialiserade färdigheter eller utrustning, möjliggör parallell tillverkning av många mallar samtidigt och kan anpassas för att tillverka ZMWs i olika metaller. I detta arbete ersattes koppar och aluminium med aluminium respektive guld för att tillverka ZMW i guld (Kompletterande figur 3). Detta är fördelaktigt för laboratorier som använder passiveringsmetoder av guld snarare än aluminium. Dessutom har guld ZMWs visat sig förbättra utsläppen för fluorforer som absorberar i den röda regionen av det synliga spektrumet, medan aluminium ZMWs ökar utsläppen för fluorforer som absorberar i den gröna regionen59. I framtiden kan fluorescerande signalintensitet från ZMWs som tillverkas med denna metod förbättras genom att etsa in i glaset under ZMW metallbeklädnad med HF16,26,60. Detta för de immobiliserade biomolekylerna längre bort från metallväggarna, vilket kan släcka fluorforer61. Dessutom finns det en maximal excitationsbelysningsintensitet under bländarens ingång, och detta har utnyttjats tidigare för att förbättraenmolekylutsläpp 26,60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01GM080376, R35GM118139 och NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 till Y.E.G., och av ett NIAID pre-doctoral NRSA-stipendium F30AI114187 till R.M.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. Electromagnetism. , Addison-Wesley. Boston, MA. (2002).
  19. Jackson, J. D. Classical electrodynamics. Third edition. , Wiley. New York, NY. (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Tags

Bioengineering Nummer 159 vågledare i nollläge nanopertur fluorescens med en molekyl nanosfärlitografi kolloidal kristall självmontering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

Tillverkning av zero mode vågledare för hög koncentration enmolekylmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M.,… More

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter