Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikasjon av zero mode waveguides for høy konsentrasjon enkeltmolekylmikroskopi

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

ERRATUM NOTICE

Summary

Beskrevet her er en nanosfære litografi metode for parallell fabrikasjon av null modus bølgeledere, som er rekker av nanoapertures i en metall-kledd glassmikroskopi coverlip for enkelt molekyl avbildning ved nano- til mikromolar konsentrasjoner av fluoroforer. Metoden drar nytte av kolloidal krystall selvmontering for å lage en waveguide-mal.

Abstract

I enkeltmolekylet fluorescens enzymologi begrenser bakgrunnsfluorescens fra merkede substrater i løsning ofte fluoroforsentrasjon til pico- til nanomolarområder, flere størrelsesordener mindre enn mange fysiologiske ligandkonsentrasjoner. Optiske nanostrukturer kalt zero mode waveguides (ZMWs), som er 100-200 nm i diameter blenderåpninger fremstilt i et tynt ledende metall som aluminium eller gull, tillater avbildning av individuelle molekyler ved mikromolarkonsentrasjoner av fluoroforer ved å begrense synlig lyseksitasjon til zeptoliter effektive volumer. Imidlertid har behovet for dyrt og spesialisert nanofabrikasjonsutstyr utelukket den utbredte bruken av ZMWs. Vanligvis oppnås nanostrukturer som ZMW ved direkte skriving ved hjelp av elektronstrålelitografi, som er sekvensiell og langsom. Her brukes kolloidal, eller nanosfære, litografi som en alternativ strategi for å lage nanometerskalamasker for bølgelederfabrikasjon. Denne rapporten beskriver tilnærmingen i detalj, med praktiske hensyn for hver fase. Metoden gjør det mulig å lage tusenvis av ZMW-er i aluminium eller gull parallelt, med endelige bølgelederdiametre og dybder på 100-200 nm. Bare vanlig laboratorieutstyr og en termisk fordamper for metallavsetning er nødvendig. Ved å gjøre ZMWs mer tilgjengelig for det biokjemiske samfunnet, kan denne metoden lette studiet av molekylære prosesser ved cellulære konsentrasjoner og priser.

Introduction

Enkeltmolekylteknikker som enkeltmolekylfluorescensresonansenergioverføring (smFRET) eller enkeltmolekylkorrelasjonsspektroskopi (FCS) er kraftige verktøy for molekylær biofysikk, slik at studiet av dynamiske bevegelser, konformasjoner og interaksjoner av individuelle biomolekyler i prosesser som transkripsjon1,2,3, oversettelse4,5,6og mange andre7. For smFRET er total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi en vanlig metode fordi mange tethered molekyler kan følges over tid, og den unnvikende bølgen generert av TIR er begrenset til en 100-200 NM-region ved siden avcoverlip 8. Men selv med denne begrensningen på eksitasjonsvolum, må fluoroforer av interesse fortsatt fortynnes til pM- eller nM-områder for å oppdage enkeltmolekylsignaler over bakgrunnsfluorescens9. Siden Michaelis-Menten-konstantene av cellulære enzymer vanligvis er i μM til mM-området10, er biokjemiske reaksjoner i enkeltmolekylstudier vanligvis mye langsommere enn de i cellen. For eksempel forekommer proteinsyntese ved 15-20 aminosyrer per sekund i E. coli11,12, mens de fleste prokaryote ribosomer i smFRET-eksperimenter oversettes ved 0,1-1 aminosyre per sekund13. I proteinsyntese viste krystallstrukturer og smFRET på stallede ribosomer at overføring av RNAer (tRNAer) svinger mellom 'hybrid' og 'klassisk' tilstand før tRNA-mRNA-translokasjonstrinnet14,15. Men når fysiologiske konsentrasjoner av translokasjonen GTPase faktor, EF-G, var til stede, ble en annen konformasjon, mellomliggende mellom hybrid og klassisk tilstand, observert i smFRET6. Det er viktig å studere dynamiske molekylære prosesser med hastigheter og konsentrasjoner som ligner de i cellen, men er fortsatt en teknisk utfordring.

En strategi for å øke fluorescerende substratkonsentrasjon er bruk av metallbaserte, sub-synlige bølgelengdeåpninger, kalt nullmodus waveguides (ZMWs), for å generere begrensede eksitasjonsfelt som selektivt begeistrer biomolekyler lokalisert innenfor blenderåpningene16 (Figur 1). Blenderåpningene er vanligvis 100-200 nm i diameter og 100−150 nm i dybde17. Over en avskjæringsbølgelengde relatert til brønnens størrelse og form (λc ≈ 2,3 ganger diameteren for sirkulære bølgeledere med vann som det dielektriske mediet18), er det ikke tillatt med forplantningsmodus i bølgelederen, derav begrepet nullmodus bølgeledere. Men et oscillerende elektromagnetisk felt, kalt en unnvikende bølge, eksponentielt forfallende i intensitet, tunnelerer fortsatt kort avstand inn i bølgelederen18,19. Selv om det ligner på TIR-unnvikende bølger, har ZMW unnvikende bølger en kortere forfallskonstant, noe som resulterer i 10-30 nm effektiv eksitasjonsregion i bølgelederen. Ved mikromolarkonsentrasjoner av fluorescerende merkede ligander er bare ett eller noen få molekyler samtidig til stede innenfor eksitasjonsområdet. Denne begrensningen av eksitasjonsvolumet og påfølgende reduksjon av bakgrunnsfluorescens muliggjør fluorescensavbildning av enkeltmolekyler ved biologisk relevante konsentrasjoner. Dette har blitt brukt på mange systemer20, inkludert FCS-målinger av enkeltproteindiffusjon21, enkeltmolekyl FRET-målinger av lavaffinitetsligandprotein22 og proteinproteininteraksjoner23, og spektro-elektrokjemiske målinger av enkeltmolekylære omsetningshendelser24.

ZMW-er er produsert ved å mønstre et metalllag direkte ved hjelp av ionstråle fresing25,26 eller elektronstrålelitografi (EBL) etterfulgt av plasma-etsning16,27. Disse maskløse litografimetodene skaper bølgeledere i serier og krever vanligvis tilgang til spesialiserte nanofabrikasjonsanlegg, og forhindrer utbredt bruk av ZMW-teknologi. En annen metode, ultrafiolett nanoimtrykk litografi lift-off28, bruker en kvarts lysbildeform for å trykke en omvendt ZMW-mal på en motstå film som et stempel. Selv om denne metoden er mer strømlinjeformet, krever den fortsatt EBL for fabrikasjon av kvartsformen. Denne artikkelen presenterer protokollen for en enkel og billig malproduksjonsmetode som ikke krever EBL- eller ionstrålefresing og er basert på tett pakking av nanosfærer for å danne en litografisk maske.

Nanosfære eller "naturlig" litografi, som først ble foreslått i 1982 av Deckman og Dunsmuir29,30, bruker selvmontering av monodisperse kolloidale partikler, alt fra titalls nanometer til titalls mikrometer31, for å lage maler for overflatemønster via etsning og / eller avsetning av materialer. De todimensjonale (2D) eller tredimensjonale (3D) utvidede periodiske matrisene av kolloidale partikler, referert til som kolloidale krystaller, er preget av en lys iriscens fra spredning og diffraksjon32. Selv om denne maskeringsmetoden er mindre brukt enn elektronstråle eller fotolitografi, er den enkel, lav pris og enkelt skalert ned for å skape funksjonsstørrelser under 100 nm.

Dirigering av selvmontering av kolloidale partikler bestemmer suksessen med å bruke kolloidale krystaller som masker for overflatemønster. Hvis størrelsen og formen på partikler er homogene, kan kolloidale partikler lett monteres selv med sekskantet pakking, drevet av entropisk uttømming33. Vannfordampning etter dråpebelegg er en effektiv rute for å sedimentere kolloidale partikler, selv om andre metoder inkludererdip-belegg 34, spinnbelegg35, elektroforetisk avsetning36og konsolidering ved et luftvannsgrensesnitt37. Protokollen som presenteres nedenfor er basert på fordampningssedimenteringsmetoden, som var den enkleste å implementere. De trekantede interstices mellom tettpakkede polystyrenperler danner åpninger der man kan plate et offermetall, danner stolperler (Figur 2 og Supplerende figur 1). Kort annealing av perlene før dette trinnet justerer formen og diameteren på disse stolpene. Perlene fjernes, et endelig metalllag avsettes rundt stolpene, og deretter fjernes stolpene. Etter de to metallavsetningstrinnene på kolloidal nanomaske, fjerning av mellomstolpene og overflatekjemimodifisering for passivisering og tethering, er ZMW-matriser klare til bruk for enkeltmolekylavbildning. Mer omfattende karakterisering av ZMW optiske egenskaper etter fabrikasjon finnes i en tilhørende artikkel38. Foruten en termisk fordamper for dampavsetning av metallene, er det ikke nødvendig med spesialiserte verktøy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle trinn kan fullføres i generell laboratorieplass.

1. Glassdekslerlip rengjøring

  1. For å gi en ren overflate for fordampningsavsetning av kolloidale partikler, plasser 24 x 30 mm optiske borosilikatglassdeksler (0,16-0,19 mm tykkelse) innenfor de rillede innsatsene til en coplin glassflekker for rengjøring.
    MERK: Pass på at dekslene står oppreist og er godt separert slik at alle overflater er tydelig eksponert under rengjøringsprosessen.
  2. Hell nok aceton i fargeboksen til å dekke dekslene, legg dekselet på og soniker i 10 min ved 40 °C.
  3. Hell ut acetonen og skyll dekslene ved å fylle fargekannen med destillert H2O og hell ut vannet. Gjenta 2 ganger til.
  4. Gjenta aceton sonikeringen (trinn 1.2 og 1.3) igjen.
  5. Hell nok 200 mM KOH i krukken til å dekke dekslene og sonikere, dekket, i 20 min ved 40 °C.
    MERK: KOH etser litt glasset.
  6. Skyll dekslene med destillert H2O 6 ganger.
  7. Tilsett etanol for å dekke dekslene, tilsett lokket og soniker i 10 minutter ved 40 °C.
  8. Skyll dekslene med destillert H2O 3 ganger.
  9. Plukk opp hvert deksle på kanten ved hjelp av milde tang og tørk dekslene med N2 gass. Berør bare kantene på dekslene. Legg hver av de tørkede, rensede dekslene i en individuell ren Petri-tallerken.

2. Fordampning av avsetning av polystyrenperler

  1. For å lage den kolloidale krystallmasken for ZMW-matrisen, sentrifugerer du 50 μL med en diameter på 1 μm, ikke-funksjonaliserte polystyrenperler (2,5 % m/v i vann) ved 15 000 x g, 25 °C i 5 minutter.
    MERK: Før pipettering av perlene, bør lagerløsningen kort virveliseres i tilfelle perlene har lagt seg til bunnen av flasken.
  2. Kast supernatanten, og la så lite vann være igjen som mulig.
    MERK: Restvann kan endre fordampningsegenskapene til etanolresuspension39, så fjerning av en liten mengde perler for å fjerne alt vannet er akseptabelt.
  3. Resuspend perlene fra trinn 2.2 i 50 μL av 1:400 TritonX-100:etanol løsningsmiddel. Pipette opp og ned flere ganger for å blande perlene grundig med løsningsmidlet.
    MERK: TritonX-100:etanolløsningsmiddel skal forsegles med parafinfilm etter bruk og tilberedes fersk en gang i måneden. Perlene har en tendens til å holde seg til sidene av et plastbeholder, for eksempel et mikrocentrifugerør, slik pipette langs sidene for å sikre at alle perler blir resuspendert.
  4. For å sette opp et fuktighetskammer for avsetning, plasser 6 Petri-retter, hver med en dekslelip, på en benk i en linje med lokk igjen litt ajar. I hver tallerken flytter du dekslene til det åpne området slik at dekslene blir utsatt for miljøet når fuktigheten økes i neste trinn.
  5. Plasser et hygrometer og en liten elektrisk vifte sentrert bak Petri-rettene.
  6. Registrer start relativ fuktighet (RH) i laboratoriet. Fyll et 200 ml beger med 150-200 ml ~75 °C vann og plasser det bak viften.
  7. Slå på viften og dekk Petri-rettene, viften, begeret og hygrometeret med en veltet, gjennomsiktig oppbevaringsbeholder for plast (66 cm x 46 cm x 38 cm).
  8. La RH i kammeret stige til 70-75%, som vanligvis tar 5-10 min.
    MERK: Hvis omgivelseslaboratoriet RH er lav (under ~50%), la kammeret nå en høyere RH, men ikke høyere enn 80%, for å kompensere for tap av fuktighet under avsetning (se nedenfor).
  9. Når RH når 70-75%, registrer RH og løft opp plastbeholderen litt for raskt å plassere deksler på Petri-rettene, noe som forhindrer over-fukting av dekslene.
    MERK: Temperaturen i kammeret vil være litt varmere enn romtemperaturen, vanligvis 25-26 °C, som følge av fukting. Hvis fuktighet er synlig på dekslene, er glassflatene for våte. En kommersiell hanskeboks kan forenkle denne delen av protokollen.
  10. La RH i kammeret fortsette å stige til 85%. På det tidspunktet registrerer du RH i fuktighetskammeret og pipetten 5 μL av perlefjæringen på midten av hvert deksle.
  11. Lukk kammeret og Petri retter etter hver avsetning for å minimere tap av fuktighet. Ta sikte på å fullføre alle 6 avsetninger innen 2 min.
  12. Registrer RH i kammeret etter avsetningen.
    MERK: RH etter avsetning vil bidra til å måle hvor fort luftfuktigheten gikk tapt under avsetning, noe som avhenger av omgivelseslaboratoriets forhold. For en typisk vellykket løp, vil kammeret starte på 85% RH før avsetning og slutte på 70-75% RH etter avsetningen.
  13. La perledråpene spre seg og tørke i 5 min.
    MERK: Hvis kolloidalkrystallene har mange hull eller flerlagsområder, var kammeret sannsynligvis for fuktig eller tørt. Juster den relative fuktigheten for å lukke Petri-rettene og begynne avsetningene (se resultatdelen for videre diskusjon av optimalisering).

3. Bead annealing for å redusere porestørrelse i kolloidal krystallmalen

  1. For å gi en jevn temperaturoverflate for annealing av polystyrenperlene, som begrenser inter-perle interstices og runder interstices hjørner, plasser en flat, malt aluminiumsplate på toppen av en standard keramisk varmeplate.
  2. Sett temperaturen på varmeplaten til 107 °C, glassovergangstemperaturen til polystyren40.
    MERK: For å oppnå stabil og nøyaktig temperatur ble det holdt en termokoblingssonde i et 2-3 mm bredt og 4-5 mm dypt hull i aluminiumsplaten.
  3. Plasser en coverlip som inneholder perlemalen på den varme aluminiumsplaten og annealen i 20 s (se diskusjonsseksjonen for forklaring av smeltetid).
  4. Etter oppvarming, fjern dekslene fra aluminiumsplaten og plasser den raskt på en annen aluminiumsoverflate for romtemperatur for å avkjøle den.
    MERK: Det er nyttig å enten la dekslene henge litt over kanten på platen eller frese grunne kanaler (se den medfølgende videoen) inn i platen for å lette hentingen av dekslene.

4. Nanofabrikasjon av bølgeledere i nullmodus i aluminium ved hjelp av den kolloidale krystallmalen

  1. Ved hjelp av termisk eller elektronstråle fordampningsavsetning, avsett 300 nm kobber ved 2 Å/s over den kolloidale krystallmalen for å generere stolperler i interstices mellom perlene.
  2. Fjern overflødig metall på toppen av perlene ved å trykke forsiktig på overflaten med tape. Skrell langsomt tapen for å trekke av metallet.
    MERK: Noen små flekker av reflekterende overflødig metall kan forbli etter tape-trekket, og disse kan ofte fjernes av en strøm av N2-gass. Hvis betydelige flekker av reflekterende overflødig metall forblir etter tapetrekket, kan du prøve å suge malene i toluen i 2 timer for delvis å oppløse polystyrenperlene. Vask dekslene med destillert vann, tørk med N2, og gjenta tapetrekket. Den ekstra suge bør ikke helt oppløse perlene, da perlene bidrar til å beskytte stolpene mot skade under tapetrekket.
  3. For å oppløse polystyrenperlene, plasser perlemalene i toluen og suge over natten.
    FORSIKTIG: Toluendamp kan være giftig. Arbeid med toluen under en godt ventilert hette og bruk personlig verneutstyr, inkludert hansker, vernebriller og en labfrakk. Toluen skal oppbevares i ventilerte skap beregnet på brennbare væsker.
  4. Etter tolueninkubasjonen, skyll malene en gang med kloroform og to ganger med etanol. Håndtaket dekker forsiktig på dette punktet fordi de delikate 200-300 nm høye metallstolpene nå er utsatt. Tørk malene med N2 og fjern restpolymer og forurensninger i en oksygenplasmarenser i 30 min.
    FORSIKTIG: Kloroformdamp kan være giftig. Arbeid med kloroform under en godt ventilert hette og bruk personlig verneutstyr, inkludert hansker, vernebriller og labfrakk. Kloroform skal oppbevares i ventilerte skap vekk fra andre brannfarlige løsemidler.
  5. Ved hjelp av termisk eller elektronstråle fordampningsavsetning, avsett 3 nm titanadhesjonslag ved 1 Å/s etterfulgt av 100-150 nm aluminium ved 4 Å/s rundt og oppå kobberstolpene.
    MERK: Man kan bruke tykkere kledning for å få dypere guider og bedre demping av bakgrunnsfluorescens, men dette reduserer også utbyttet etter å ha eksponert og oppløst innleggene i neste trinn (se diskusjonsdelen).
  6. For å oppløse metallstolpene, suge dekslene i kobbereterkant (sitronsyrebasert; Tabell over materialer) i 2 timer.
    FORSIKTIG: Metalleter kan forårsake hudforbrenninger. Arbeid med etsemidler under en godt ventilert hette og bruk verneutstyr. Vask hendene grundig etter håndtering. Metalletskant skal lagres i ventilerte skap beregnet på etsende væsker.
  7. Skyll dekslene med destillert vann, tørk med N2, og poler forsiktig overflaten av metallbekledningen med linsepapir for å eksponere eventuelle stolper som fortsatt er dekket av kledning. Legg dekslene tilbake i kobberets etse i ytterligere 2 timer, skyll deretter igjen med destillert vann og tørk med N2.
    MERK: ZMW-lysbilder skal oppbevares i tildekkede, rene Petri-retter for å holde dem fri for forurensninger.

5. Nanofabrikasjon av bølgeledere i gull null modus ved hjelp av den kolloidale krystallmalen

MERK: Metoden for å fremstille gull-ZMW-er (Tilleggsfigur 1), som speiler protokollen for å fremstille ZMW-er i aluminium, er gitt i denne delen.

  1. Ved hjelp av termisk eller elektronstråle fordampningsavsetning, avsett 3 nm titanadhesjonslag ved 1 Å/s etterfulgt av 300 nm aluminium ved 4 Å/s.
  2. Fjern overflødig metall på toppen av perlene ved å trykke forsiktig på overflaten med tape. Skrell langsomt tapen for å trekke av metallet.
  3. For å oppløse polystyrenperlene, plasser perlemalene i toluen og suge over natten.
  4. Etter tolueninkubasjonen, skyll malene en gang med kloroform og to ganger med etanol. Tørk malene med N2 og fjern gjenværende polymerforurensninger i en oksygenplasmarenser i 30 min.
  5. Ved hjelp av termisk eller elektronstråle fordampningsavsetning, avsett 100-150 nm gull på 5 Å / s rundt og på toppen av aluminiumsstolpene.
  6. For å oppløse metallstolpene, suge dekslene i aluminiumsetikt (fosforsyrebasert; Tabell over materialer) i 1 time.
  7. Skyll dekslene med destillert vann, tørk med N2, og poler forsiktig overflaten av metallbekledningen med linsepapir for å eksponere eventuelle stolper som fortsatt er dekket av kledning. Legg dekslene tilbake i aluminiumsetkant i 1 time, skyll deretter igjen med destillert vann og tørk med N2.
    MERK: ZMW-lysbilder skal oppbevares i tildekkede, rene Petri-retter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Selvmonteringen av polystyrenkolloidale partikler via fordampningssedimentering (trinn 2.1−2.13) kan gi en rekke resultater siden det krever kontroll av fordampningshastigheten for løsningsmidlet. Men fordi avsetningene er raske (10-15 min per runde), kan prosedyren raskt optimaliseres for forskjellige omgivelseslaboratorier. Figur 3A viser en velformet kolloidal mal etter avsetning og fordampning. Makroskopisk er perleområdet sirkulært, med grenser definert av en ugjennomsiktig, flerlags ring av perler. De gjennomskinnelige, men ikke hvite områdene i bildet er de ønskede monolayerområdene. Figur 3B viser en kolloidal mal som var pakket i et altfor fuktig miljø (80 % RELATIV når Petri-rettene ble lukket). Disse malene har en tendens til ikke å ha en ren sirkulær grense og har flerlags tendrils som strekker seg utover. Avsetningen er akseptabel og kan brukes i etterfølgende faser, men hullene i gitteret reduserer antall brukbare ZMW-matriseområder for enkeltmolekylavbildning. Figur 3C viser en kolloidal mal som ble pakket i et altfor tørt miljø (65 % RELATIV når Petri-rettene ble lukket). Disse malene er vanligvis mindre i diameter sammenlignet med de ideelle, godt spredte malene. Avsetningen kan brukes, men de flerlags, hvite områdene, som strekker seg innover, reduserer området som kan brukes til avbildning. Dermed anbefaler vi ikke å utføre mer enn 6 avsetninger om gangen siden avsetninger mot slutten av prosessen vil oppstå ved lavere luftfuktighet når kammeret åpnes og lukkes. Figur 3D viser regnbuemønsteret produsert ved diffraksjon av reflektert lys fra polystyrenkrystallen. Dette mønsteret kan brukes til å bekrefte suksess og kvalitet på krystallpakking for øyet. Figur 3E,F viser afm-bilder (atomkraftmikroskopi) av godt pakkede kolloidale maler. Feilene mellom korn oppstår fra jamming under fordampningssedimentering41, og distinkte korn kan ses med et 10x mål. Dermed kan undersøkelse av kolloidavsetningene med et laveffekts lysmikroskop også brukes til å vurdere pakking.

Etter avsetning av kobber på de glødede kolloidale malene (trinn 4.1), bør regnbuediffraksjonsmønsteret fortsatt være synlig og forsterket av reflekterende metallbelegg toppene på perlene (Figur 4A, B). Malene mister det reflekterende regnbuediffraksjonsmønsteret etter scotch tape pull (trinn 4.2) som fjerner overflødig kobber (Figur 4C). Figur 4D,E viser AFM-bilder av et typisk felt av kobberstolper etter metallavsetning. Feilene mellom kolloidale krystallkorn i figur 3E er synlige i kobberstolpebildene som større kobberområder. Analyse av AFM-bilder viser at for en kobberavsetningstykkelse på 300 nm, er de endelige kobberstolpene gjennomsnittlig 255 nm (Figur 4F) i høyden og 121 nm i diameter (Figur 4G).

Avsetning av aluminiumsbekledningen (trinn 4.5) der perlene var og på toppen av kobberstolpene, og etterfølgende oppløsning av stolpene (trinn 4.6 og 4.7) resulterer i aluminiumSMWene vist i figur 5A-C. Defekter mellom kolloidale krystallkorn er synlige som større åpninger (Figur 5B). Den gjennomsnittlige avstanden mellom ZMW-sentrene i figur 5C er 559 nm, i samsvar med avstanden som er angitt av den sekskantede tettpakkegeometrien til de 1 μm perlene ( Equation 1 Bruke polystyrenmaler som ble annealed for 20 s resulterer i bølgeledere som i gjennomsnitt er 118 nm i diameter (Figur 5D,E), i samsvar med stiftdiametrene og tilstrekkelig små til å kutte forplantning av synlig lys. En høydeprofil for en bølgeguide fra figur 5D viser også at den er ~120 nm dyp.

Enkeltmolekylet FRET ble utført i ZMW-ene for å teste for funksjonalitet (figur 6A). Et typisk felt med ZMW-er for avbildning vises i figur 6B, som inneholder >3000 bølgeledere i et synsfelt på 40 x 80 μm. ZMW-ene ble først passivert ved hjelp av protokoller som er beskrevet tidligere42,43. Kort sagt, aluminium ZMWs ble passivisert med poly (vinylfosfonsyre) for å belegge aluminiumsbekledningen etterfulgt av metoksy-terminert polyetylenglykol (PEG) dopet med biotin-terminert PEG for å belegge glassbunnen på ZMWs. Gold ZMWs kan passiviseres med thiol-derivatisert PEG for å belegge gullbekledningen etterfulgt av en lignende PEG-behandling for glassbunnene. Strømningskamre, ~ 20 μL volum, ble deretter konstruert for enkeltmolekylavbildning44. Enkeltmolekyl FRET-avbildning av DNA-dupleksene ble utført som beskrevet tidligere38. Kort sagt ble 100 pM−1 nM cyanin-3/cyanin-5 (Cy3/Cy5), biotinylerte DNA-duplekser (33 baseparlengde) inkubert i 10 minutter i strømningskanaler funksjonalisert med streptavidin (5 min inkubasjon, 0,5 mg/ml oppløsning). Konsentrasjonen av merkede makromolekyler kan titreres for å oppnå ~ 20% lasting av bølgelederne med ett molekyl, noe som fører til <5% bølgeledere lastet med mer enn ett molekyl, basert på Poisson distribuert lasting (de fleste bølgeledere, ~ 75%, vil ikke ha noen molekyler)45. Ubundet DNA ble vasket bort med nukleasefri dupleksbuffer etterfulgt av belysningsbuffer (0,3 % [w/v] glukose, 300 μg/ml glukoseoksidase, 120 μg/ml katalase og 1,5 mM Trolox [6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametyl-kromatan-2-karboksylsyre]). Ikke-biotinylerte Cy5-merkede DNA-duplekser (33 baseparlengde) var til stede i belysningsbufferen ved 0, 50, 100 og 500 nM som bakgrunnsflunoforer i oppløsning. Enkeltmolekyl FRET-spor fra de immobiliserte Cy3/Cy5 dupleks-DNA-molekylene ble registrert med et spesialbygget TIRF-mikroskop justert til epifluorescensforhold. Filmer ble spilt inn med en 1,48 numerisk blenderåpning (NA) 100x olje nedsenkning mål med vekslende 532 nm og 640 nm eksitasjon (100 ms eksponering) og en dual view spektral splitter for å spille inn Cy3 og Cy5 utslipp samtidig på en elektron-multipliserende ladning-koblet enhet (EMCCD) kamera. Ett enkelt molekyl FRET-spor med enkelttrinns blekemidler i Cy5-kanalen var påvisbare ved alle konsentrasjoner av ambient Cy5 testet (Figur 6C-F). Til sammenligning ville enkeltmolekyler bare kunne påvises i TIRF-belysning med pM til lave nM-løsning fluoroforkonsentrasjoner46.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for bølgeledere i null modus. Diagram over ZMW-matrise med utvidet tverrsnittsdiagram av en enkelt ZMW til høyre. Enkelt fluorescerende taggede enzymer av interesse (brunt ribosom med rød sirkel for å representere fluorescerende fargestoff) kjemisk immobilisert (via mRNA i dette eksemplet) til glassbunnen på ZMWs (vanligvis funksjonalisert med biotinylert-PEG) kan avbildet med et typisk laserbasert epifluorescence mikroskopioppsett. Eksitasjonslyset på 532 nm (grønne piler) reflekteres ved glassmetallgrensen på grunn av den lille størrelsen på blenderåpningen (100-200 nm diameter), men en ikke-forplantende unnvikende bølge som forfaller eksponentielt i intensitet er til stede innenfor ZMW. Dette resulterer i en 10-30 nm effektiv belysningsdybde (grønn skyggelegging i blenderåpning). Individuelle fluorescerende ligander (blå tRNAer med grønne sirkler som fluorescerende koder) ved nM til μM-konsentrasjoner tilsettes. En individuell ligand som diffuserer inn i blenderåpningen og samhandler med enzymet, er avbildet uten forbudsmessig bakgrunnsfluorescens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk for kolloidal templatingmetode utviklet for å fremstille ZMW-aluminiumskjeder i aluminium. Polystyrenperler, 1 μm i diameter, deponeres og monteres selv på en rengjort glassdekslerlip, som beskrevet i paragraf 2 i protokollen. Perler blir deretter glødet for å redusere porestørrelser (avsnitt 3), etterfulgt av kobberavsetning og perleoppløsning i toluen. Aluminium deponeres rundt og på toppen av kobberstolpene, som deretter selektivt etses bort for å etterlate et sekskantet utvalg av nanopiksler (avsnitt 4). For de tre siste trinnene er tverrsnittsvisninger gitt til høyre for planvisningene for å vise bredden og høyden på kobberstolpene og aluminiums-ZMW-ene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative resultater fra fordampningsavsetning av kolloider. (A) Eksempel på optimal kolloidavsetning. (B) Eksempel på en akseptabel kolloidavsetning der forholdene var mer fuktige (80% RH) enn ideelle. Hull i krystallmonolayeren er tydelige. (C) Eksempel på en akseptabel kolloidavsetning der forholdene var tørrere (65 % RELATIV) enn optimale. Monolayerområdene er litt gjennomsiktige, mens flerlagsområder er hvite og ugjennomsiktige (omkrets og striper innover). (D) En kolloidal krystall opplyst med hvitt lys for å markere regnbuediffraksjonen fra krystallene. (E) AFM-bilde (tappesonde AFM i luft) av en monolayer av sekskantede pakkede polystyrenperler fra en vellykket kolloidavsetning (skalastang = 10 μm). (F) Utvidet AFM-bilde av pakkede perler (skalastang = 2 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Makroskopiske og mikroskopiske bilder av ZMW-maler etter kobberavsetning. (A) Bilde av lysbilder etter fysisk fordampning av kobber på toppen av perlemalene. (B) Regnbuediffraksjonsmønster fra perlemaler etter kobberavsetning. (C) Bilde av en mal (til høyre) etter et tapetrekk for å fjerne overflødig kobber og tape (venstre). (D) AFM-bilde av kobberstolper etter tapetrekk og fullstendig oppløsning av polystyrenperlene (skalastang = 5 μm). (E) Høyere forstørrelse AFM bilde av panel D (skala bar = 2 μm). (F) Histogram av kobberstolpehøydene (definert som maksimal høydemåling i hver stolpe), n = 534. (G) Histogram av kobberstolpen Feret diameter, n = 201. Feretdiameter er den maksimale avstanden mellom to parallelle linjer tangent til stiftgrensen (kvantifisert i ImageJ47). For å identifisere partikler for analyse ble det brukt en terskel halvveis mellom toppen av kledningen og den nederste glassoverflaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Makroskopiske og mikroskopiske bilder av ZMW-er i aluminium. (A) Bilde av lysbilder etter fysisk fordampningsavsetning på 150 nm aluminium rundt og oppå kobberstolpene. (B) AFM bilde av aluminium ZMWs etter post oppløsning (skala bar = 5 μm). (C) Høyere forstørrelsesbilde av panel B (skaleringsstang = 0,2 μm). (D) Typisk dybdeprofil for en individuell ZMW fra panel C. Profil hentet fra den grønne linjen trukket i panel C. (E) Histogram av ZMW Feret diameter, n = 240. Feretdiametre ble målt som i figur 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Enkeltmolekyl FRET-avbildning i ZMWs. (A) Skjematisk (ikke å skalere) av enkeltmolekyl FRET-avbildning av Cy3, Cy5-merkede DNA-duplekser i ZMWs med Cy5-merkede duplekser i bakgrunnen. (B) Eksempelfelt for ZMW-er under hvitt lysbelysning (skalastang = 10 μm). (C−F) Enkeltmolekyl FRET-opptak av DNA-duplekser immobilisert i ZMW-ene i nærvær av 0 (C), 50 (D), 100 (E)og 500 nM (F) Cy5-merkede duplekser i løsning. For hver konsentrasjon viser topppanelet Cy3 (grønn) og Cy5 (rød) fluorescensintensitet under 532 nm laserbelysning (FRET-avbildning), midtpanelet viser Cy5 fluorescensintensiteten under 640 nm laserbelysning (direkte akseptoreksitasjon), og det laveste panelet viser FRET-effektiviteten ( Equation 2 ) beregnet fra rå Cy3 ( ID) og Cy5 (IA) fluorescensintensitet. Under bildet vekslet eksitasjonsbølgelengden mellom 532 og 640 nm hver 100 ms. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Skjematisk for kolloidal templating-metode utviklet for å fremstille ZMW-gullmatrise. Protokoll for å fremstille gull ZMW-matrise er analog med protokollen for å fremstille ZMW-aluminiumskjede (figur 2). I stedet for å deponere kobber på toppen av polystyrenperlene, blir aluminium avsatt. Etter å ha oppløst perlene i toluen, blir gull avsatt i stedet for aluminium på toppen av stolpene. Aluminiumsstolper blir deretter selektivt etset for å etterlate seg gull ZMW-array. For de tre siste trinnene er tverrsnittsvisninger gitt til høyre for planvisningene for å vise bredden og høyden på aluminiumsstolpene og gull-ZMW-ene.

Supplerende figur 2: Endelig elementmodellering av elektromagnetisk feltutbredelse i ZMWs. (A-D) Tverrsnitt av størrelsen på den tidsgjennomsnittte Poynting-vektoren (W/m2) gjennom en bølgeleder laget av en uannealisert mal (A, C) og en glødet mal (B,D). Lineært polariserte elektromagnetiske planbølger (1 W fordelt over skredområdet) ved bølgelengdene som er oppført i figuren (400 nm eller 1000 nm) ble projisert på bunnoverflaten, og den laveste (grunnleggende) modusen, som har lavest bølgenummer, ble beregnet ved hjelp av modelleringsprogramvare (Tabell over materialer) med den begrensede elementmetoden for å løse Maxwells ligninger og passende grensebetingelser. Grensene til bølgelederne ble antatt å være perfekte elektriske ledere, som er godt tilnærmet av aluminium eller gullvegger. Tverrsnittet fra den uannede bølgeledermalen ble bestemt av sekskantet pakking av sirkler med 1 μm diameter, og de tre spisse spissene fra den resulterende trekantede formen ble kuttet til ~ 60 nm bredde for å modellere en realistisk fysisk blenderåpning. Tverrsnittet fra de glødede malene ble tilnærmet som en sirkel på 130 nm i diameter. Begge bølgelederne hadde en dybde på 130 nm, tilsvarende kledningsdybden etter fabrikasjon. (E,F) I tillegg til eksitasjonsbølgelengder på 400 nm og 1000 nm, ble modellene løst ved 100 eksitasjonsbølgelengder jevnt fordelt mellom 400 nm og 1000 nm, og den effektive modusindeksen (definert som Equation 3 , der kz er bølgenummeret i bølgelederen, som reduseres på grunn av begrensning i det tverrgående planet, og k er eksitasjonslysbølgenummeret i vakuum) ble plottet mot eksitasjonsbølgelengde for trekantede (E) og sirkulære (F) bølgeledere. For kortere bølgelengder er høyere moduser begeistret, og den effektive modusindeksen øker (maksimal effektiv modusindeks er 1, som er det begrensende tilfellet der den elektromagnetiske planbølgen beveger seg ubundet i den tverrgående dimensjonen). De effektive avskjæringsbølgelengdene til bølgelederne ble estimert som bølgelengden der den effektive modusindeksen faller til 0. Merk at den sirkulære føringen λcutoff = 221 nm fra endelig elementmodellering (F) er i samsvar med den teoretiske prediksjonen av en sirkulær bølgeleders avskjæringsbølgelengde (λcutoff, analytisk = 1,7d = 221 nm, hvor d er bølgelederens diameter). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Representative resultater fra Au ZMW fabrikasjon. (A) Makroskopisk bilde av gull ZMW matriser. (B−D) AFM-bilder av aluminiumsstolper fra en perlemal som ikke var glødet (B), en mal som ble annealed ved 107 °C i 20 s (C), og en mal som ble annealed ved 107 °C i 25 s (D). (E) AFM-bilde av gull-ZMW-er etter oppløsning av aluminiumsstolper. (F) Høyere forstørrelse AFM bilde av panel E. (G) Typisk dybdeprofil av en gull ZMW. Profil hentet fra den grønne linjen tegnet i panel F (skalastang = 1 μm i B, C, Dog F; 5 μm i E). Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For den kolloidale selvmonteringen (protokolldel 2) øker bruken av etanol i stedet for vann, da suspensjonsløsningsmidlet fremskynder fordampningsprosessen slik at malene er klare i 2-3 minutter etter avsetning i stedet for 1−2 t som i tidligere metoder48,49. Den fordampende sedimenteringsprotokollen som presenteres her, er også enklere enn tidligere sedimenteringsprotokoller som krever kontroll av overflatevinkel, temperatur og luftvolum over suspensjonen49,50,51. Partikkelvolumfraksjonen som brukes i denne protokollen er 2,4%, høyere enn 0,2-0,5% brukt i tidligere sedimenteringsmetoder48, som resuspenderte kolloider i vannglyserolblandinger for mye lengre sedimenteringstidskalaer. Imidlertid er kvaliteten på avsetningene robust mot endringer i partikkelvolumfraksjonen, med tidligere studier som finner at den kan varieres mellom 2-10%49,50,51. Kornstørrelsene på kolloidale krystaller oppnådd i en vellykket avsetning fra denne protokollen er 20-30 μm over, større enn korn fra tidligere sedimenteringsmetoder (vanligvis flere hundre nanometer over)48,49. Makroskopisk er de omtrent 2 cm i diameter områder av kolloidal monolayer også sammenlignbare med de 1 cm områdene som produseres ved tidligere metoder49. Den store størrelsen på kolloidale krystallmaler produsert i denne metoden tillater også at 3-5 separerte strømningskamre44, hver ca 3-4 mm bred, kan gjøres på hver ZMW lysbilde. Dermed kan flere uavhengige enkeltmolekyleksperimenter utføres på hvert lysbilde.

Annealing av kolloidale perlemaler (protokolldel 3) etter selvmontering er et enkelt, men avgjørende skritt for tilstrekkelig reduksjon av bakgrunnsfluorescens med ZMWs. Som supplerende figur 2 viser, er den effektive avskjæringsbølgelengden for en bølgeleder med det trekantede tverrsnittet fra en uannet mal 894 nm. Til sammenligning er den effektive cutoff bølgelengden for en 130 nm diameter sirkulær bølgeleder fra en glødet mal 221 nm, som bestemt både analytisk (1,7 ganger diameteren på guiden18) og numerisk. Bruk av mindre perler til avsetning kan også redusere størrelsen på malporene, men bølgelederne vil da bli fordelt nærmere enn 200 nm, som er rundt diffraksjonsgrensen for synlig lys. Videre vil bølgelederne forbli trekantede i tverrsnitt, noe som fører til ikke-symmetrisk kraftutbredelse gjennom bølgelederen (Supplerende figur 2A-D). En ulempe med glødetrinnet er at variasjon i smeltetiden kan introdusere svingninger i bølgelederdiameteren, så nøyaktig timing bidrar til å minimere variasjon mellom partier. Interstices begynner å lukke ved annealing ganger lengre enn 25 s, og stolpediametre reduseres ikke veldig mye mellom 20-25 s (Supplerende figur 3B-D). En rask test for interstice lukking er å sjekke om annealed maler fortsatt produserer en regnbue diffraksjon mønster når opplyst med lys og sett i en vinkel. Hvis ikke, har flertallet av interstices sannsynligvis stengt. Forholdet mellom glødetid og typiske porediametere har blitt presentert tidligere38.

Etter å ha oppnådd ønsket porestørrelse under glødetrinnet, blir kobber avsatt (trinn 4.1) på malene for å skape en skygge av masken. Det er viktig å bruke avsetningslinje, med metallet som nærmer seg malen så vinkelrett som mulig. Dermed vil det å øke avstanden mellom prøven og metallkilden samt sikre at platen som holder malene ikke spinner, som det automatisk gjøres i noen dampavsetningsmaskiner, bidra til å minimere lateral avsetning av metall på polystyrenunderlaget. Noen lateral avsetning er imidlertid uunngåelig, noe som reduserer størrelsen på interstitialhullet og dermed stolpens tverrsnitt etter hvert som mer metall avsettes52. Dette resulterer i pyramidale metallstolper i stedet for prismelignende strukturer52.

Fordi kobberstolpene sannsynligvis er pyramidale i stedet for prismeformede, dekker aluminiumsavsetning (trinn 4.5) på toppen av stolpene også noen av de skrånende sidene, og blokkerer tilgjengeligheten til kobberets etchant for noen av stolpene. Dermed ble linsepapirbøyetrinnet (trinn 4.7 eller 5.7) lagt til etter den første suge i etchant for å forstyrre eventuelle kobberstolper som fortsatt er dekket av aluminium mekanisk. Deponering av mer kobber for å lage høyere stolper gjør også stolpene mer utsatt for mekanisk forstyrrelse under linsepapirbøyingen. Imidlertid bør mer enn 500 nm kobber ikke avsettes siden målet med avsetning er å projisere interstitialhullet på 500 nm midtlinjen til de 1 μm perlene.

En annen potensiell vanskelighet er utilsiktet fjerning av aluminiumsbekledning under linsepapirboffingen (trinn 4.7 eller 5.7). Det ble funnet at tap av aluminiumbekledning under buffing ble hyppigere etter at annealingtrinnet ble lagt til, sannsynligvis på grunn av økt polystyrenrester, noe som kan forstyrre aluminiums overholdelse av glass (protokoll seksjon 3). Nattlige toluen suge (trinn 4.3 eller 5.3) etter tape pull løste imidlertid dette problemet. I AFM-bildet i figur 4Ekan man se noen gjenværende ringer av polystyren mellom stolpene, men aluminiumsbekledningen motsto fortsatt flere buffs i trinn 4.7. Hvis tap av aluminiumsbekledning fortsatt er et problem etter nattlig toluen suge, kan en RCA-1 (standard clean-1) vask, piranha vask eller ytterligere oksygenplasma rengjøring legges til trinn 4.4 eller 5.4. Disse vasketrinnene kan også legges til etter det siste etsetrinnet (trinn 4.7 eller 5.7) og før passivasjon for å rengjøre ZMW-ene ytterligere.

Ytelsen til ZMWs i ett molekyl FRET eksperimenter var lik den av ZMWs fabrikkert med EBL. I en tidligere studie53 utfører enkeltmolekyl FRET på Cy3 merket enkelt strandet DNA med Cy5 merket DNA helicase loader protein i løsning (samme donor-akseptor arrangement som at i figur 6A), FRET hendelser var tydelig merkbar på 100 nM Cy5 bakgrunn, var mindre klar (lavere akseptor spor signal til støy) på 1 μM, og ikke merkbar på 10 μM. Vi merker oss at en tidligere studie med kommersielle ZMWs rapporterte enkeltmolekyl FRET akseptor signaler ved bakgrunnskonsentrasjoner så høyt som 1 mM54, høyere enn vi og andre tidligere studier42,53 med interne fabrikkerte ZMWs har oppnådd. Videre diskusjon av signal-til-bakgrunn-ytelsen blant ZMWs er gitt i Jamiolkowski et al.38. Ikke-spesifikk interaksjon av fluorescerende prøve med ZMW-overflatene53 er en vanlig utfordring som begrenser tilgangen til høyere konsentrasjoner, spesielt hvis de diffuserende fluorescerende artene i løsningen er en stor makromolekyl. Studier med ZMW-er på komplekse biokjemiske systemer som oversettelse har vanligvis begrenset fri fluorescerende substratkonsentrasjoner til 100-250 nM55,56,57,58. Uavhengig av den tiltenkte anvendelsen av ZMW-ene, vil optimalisering av passivasjonsmetoder for forskjellige systemer sannsynligvis være nødvendig for å opprettholde akseptabelt signal til støy ved høye konsentrasjoner.

Totalt sett krever metoden som presenteres her ingen spesialiserte ferdigheter eller utstyr, tillater parallell fabrikasjon av mange maler samtidig, og kan tilpasses for å fremstille ZMW-er i forskjellige metaller. I dette arbeidet ble kobber og aluminium erstattet med henholdsvis aluminium og gull for å fremstille gull ZMW-er (Supplerende figur 3). Dette er fordelaktig for laboratorier som bruker passivasjonsmetoder for gull i stedet for aluminium. I tillegg har gull ZMW-er vist seg å forbedre utslippet for fluoroforer som absorberer i den røde regionen av det synlige spekteret, mens aluminium ZMW forbedrer utslippet for fluoroforer som absorberer i den grønne regionen59. I fremtiden kan fluorescerende signalintensitet fra ZMWs fremstilt med denne metoden forbedres ved å etse inn i glasset under ZMW metallbekledning ved hjelp av HF16,26,60. Dette bringer de immobiliserte biomolekylene lenger unna metallveggene, som kan slukke fluoroforer61. Videre er det maksimalt eksitasjonsbelysningsintensitet under inngangen til blenderåpningen, og dette har tidligere blitt utnyttet for å forbedre enkeltmolekylutslipp26,60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01GM080376, R35GM118139 og NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 til Y.E.G., og av et NIAID predoktorstipend F30AI114187 til R.M.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. Electromagnetism. , Addison-Wesley. Boston, MA. (2002).
  19. Jackson, J. D. Classical electrodynamics. Third edition. , Wiley. New York, NY. (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Tags

Bioengineering Utgave 159 nullmodus bølgeledere nano-blenderåpning enkeltmolekyl fluorescens nanosfære litografi kolloidal krystall selvmontering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

Fabrikasjon av zero mode waveguides for høy konsentrasjon enkeltmolekylmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M.,… More

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter