Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Yüksek Konsantrasyonlı Tek Moleküllü Mikroskopi için Sıfır Mod Dalga Kılavuzlarının İmalatı

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

ERRATUM NOTICE

Summary

Burada açıklanan, nano-mikromolar florofor konsantrasyonlarında tek molekül görüntüleme için metal kaplı cam mikroskopi kapak kapağındaki nanoapertures dizileri olan sıfır mod dalga kılavuzlarının paralel üretimi için bir nanosfer litografi yöntemidir. Yöntem, bir dalga kılavuzu şablonu oluşturmak için kolloidal kristal kendi kendine montajdan yararlanır.

Abstract

Tek moleküllü floresan enzimolojisinde, çözeltideki etiketli substratlardan gelen arka plan floresanları genellikle florofor konsantrasyonu ile piko- nanomolar aralıkları, birçok fizyolojik ligand konsantrasyonundan daha az büyüklük sırasını sınırlar. Alüminyum veya altın gibi ince iletken bir metalde üretilen 100−200 nm çapında diyafram açıklıkları olan sıfır mod dalga kılavuzları (ZMWs) adı verilen optik nanoyapılar, görünür ışık eksiltmeyi zeptoliter etkili hacimlere hapsederek floroforların mikromoler konsantrasyonlarında tek tek moleküllerin görüntülenmesini sağlar. Bununla birlikte, pahalı ve özel nanofabrikasyon ekipmanına duyulan ihtiyaç, ZMW'lerin yaygın kullanımının önüne geçmektedir. Tipik olarak, ZMWs gibi nanoyapılar, sıralı ve yavaş olan elektron ışını litografisi kullanılarak doğrudan yazılarak elde edilir. Burada kolloidal veya nanosfer litografi, dalga kılavuzu imalatı için nanometre ölçeğinde maskeler oluşturmak için alternatif bir strateji olarak kullanılır. Bu rapor, yaklaşımı her aşama için pratik hususlarla ayrıntılı olarak açıklar. Yöntem, son dalga kılavuzu çapları ve derinlikleri 100−200 nm olan binlerce alüminyum veya altın ZMW'ın paralel olarak yapılmasına izin verir. Metal biriktirme için sadece ortak laboratuvar ekipmanı ve termal evaporatör gereklidir. Bu yöntem, ZMW'leri biyokimyasal topluluk için daha erişilebilir hale getirerek, moleküler süreçlerin hücresel konsantrasyonlarda ve oranlarda incelenmesini kolaylaştırabilir.

Introduction

Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) veya tek moleküllü floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) gibi tek moleküllü teknikler moleküler biyofizik için güçlü araçlardır, transkripsiyon1, 2 ,3, çeviri4,5,6ve diğerleri gibi süreçlerde bireysel biyomoleküllerin dinamik hareketlerinin, konformasyonlarının ve etkileşimlerinin incelenmesine izin verir7. SmFRET için, total iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopisi yaygın bir yöntemdir, çünkü birçok bağlı molekül zamanla takip edilebilir ve TIR tarafından oluşturulan evanescent dalgası kapak8'ebitişik 100−200 nm bölgesi ile sınırlıdır. Bununla birlikte, ekscitasyon hacmindeki bu kısıtlamaya rağmen, arka plan floresanının üzerindeki tek molekül sinyallerini tespit etmek için ilgi flüforlarının pM veya nM aralıklarına seyreltilmesi gerekir9. Hücresel enzimlerin Michaelis-Menten sabitleri tipik olarak μM ila mM aralığında10olduğundan, tek molekül çalışmalarında biyokimyasal reaksiyonlar genellikle hücredekilerden çok daha yavaştır. Örneğin, protein sentezi E. coli11 , 12'de saniyede15−20amino asittegerçekleşirken,smFRET deneylerindeki prokaryotik ribozomların çoğu saniyede 0.1−1 amino asitte tercümeedilir 13. Protein sentezinde, duran ribozomlardaki kristal yapılar ve smFRET, transfer RNA'larının (tRNA'lar) tRNA-mRNA translokasyon adımı14,15'denönce 'hibrit' ve 'klasik' durumlar arasında dalgalanarak dalgalandırdığını göstermiştir. Bununla birlikte, translokasyon GTPase faktörüNÜN fizyolojik konsantrasyonları ef-G mevcut olduğunda, smFRET6'damelez ve klasik durumlar arasında orta olan farklı bir konformasyon gözlenmiştir. Dinamik moleküler süreçleri hücredekilere benzer oranlarda ve konsantrasyonlarda incelemek önemlidir, ancak teknik bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Floresan substrat konsantrasyonunu artırmaya yönelik bir strateji,16 diyafram açıklıkları içinde lokalize biyomolekülleri seçici olarak heyecanlandıran sınırlı uyarlama alanları oluşturmak için sıfır mod dalga kılavuzları (ZMWs) adı verilen metal bazlı, alt görünür dalga boyu diyaframlarının kullanılmasıdır (Şekil 1). Diyafram açıklıkları tipik olarak 100−200 nm çapında ve 100−150 nm derinlik17' dir. Kuyuların büyüklüğü ve şekli ile ilgili bir kesme dalga boyunun üzerinde (φc ≈ dielektrik orta 18 olarak su ile dairesel dalga kılavuzları için çapın2,3katı), dalga kılavuzunda yayılma modlarına izin verilmez, bu nedenle sıfır mod dalga kılavuzları terimi. Bununla birlikte, salınımlı bir elektromanyetik alan, evanescent dalgası olarak adlandırılan, yoğunlukta katlanarak çürüyen hala dalga kılavuzuna kısa bir mesafe tüneller18,19. TIR evanescent dalgalarına benzer olmasına rağmen, ZMW evanescent dalgaları daha kısa bir çürüme sabitine sahiptir ve bu da dalga kılavuzu içinde 10−30 nm etkili bir eksitasyon bölgesine neden olur. Floresan etiketli ligandların mikromolar konsantrasyonlarında, ekscitasyon bölgesinde aynı anda sadece bir veya birkaç molekül bulunur. Uyarım hacminin bu şekilde kısıtlanması ve bunun sonucunda arka plan floresanının azaltılması, tek moleküllerin biyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarda floresan görüntülenmesini sağlar. Bu, tek protein difüzyon21'inFCS ölçümleri, düşük benzeşimli ligand-protein22'nintek moleküllü FRET ölçümleri ve protein-protein etkileşimleri23 ve tek moleküler devir olaylarının spektro-elektrokimyasal ölçümleri dahil olmak üzere birçoksisteme uygulanmıştır 24.

ZMW'ler, iyon ışın frezeleme25, 26veya elektron ışını litografisi (EBL) ve ardından plazma gravür16,27kullanılarak metal bir tabakanın doğrudan desenlenerek üretilmiştir. Bu maskesiz litografi yöntemleri seri olarak dalga kılavuzları oluşturur ve tipik olarak ZMW teknolojisinin yaygın olarak benimsenmesini önleyen özel nanofabrikasyon tesislerine erişim gerektirir. Başka bir yöntem, ultraviyole nanoimprint litografi lift-off28, ters bir ZMW şablonunu damga gibi bir direnç filmine bastırmak için kuvars slayt kalıbı kullanır. Bu yöntem daha aerodinamik olsa da, kuvars kalıbının imalatı için hala EBL gerektirir. Bu makalede, EBL veya iyon ışın frezeleme gerektirmeyen ve litografik bir maske oluşturmak için nanosferlerin yakın paketlenmesine dayanan basit ve ucuz şablonlu bir imalat yöntemi için protokol sunulmaktadır.

İlk olarak 1982 yılında Deckman ve Dunsmuir29,30tarafından önerilen nanosfer veya "doğal" litografi, malzemelerin gravür ve / veya biriktirme yoluyla yüzey deseni için şablonlar oluşturmak için onlarca nanometreden onlarca mikrometre31'ekadar değişen monodisperz kolloidal parçacıkların kendi kendine montajını kullanır. Kolloidal kristaller olarak adlandırılan kolloidal parçacıkların iki boyutlu (2D) veya üç boyutlu (3D) genişletilmiş periyodik dizileri, saçılma ve kırınım32'denparlak bir yanardönerlik ile karakterize edilir. Elektron ışını veya fotolitografiden daha az yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu maskeleme metodolojisi basit, düşük maliyetlidir ve 100 nm'nin altında özellik boyutları oluşturmak için kolayca ölçeklendirilir.

Kolloidal parçacıkların kendi kendine birliğini yönlendirmek, kolloidal kristallerin yüzey desenleme için maske olarak kullanılmasının başarısını belirler. Parçacıkların boyutu ve şekli homojen ise, kolloidal parçacıklar entropik tükenme33tarafından tahrik edilen altıgen ambalaj ile kolayca kendi kendine monte edilebilir. Damla kaplamadan sonra su buharlaşması kolloidal parçacıkları tortulamak için etkili bir yoldur, ancak diğer yöntemler daldırmakaplama 34, spin kaplama35, elektroforetik biriktirme36ve hava-su arayüzünde konsolidasyon37içerir. Aşağıda sunulan protokol, uygulanması en basit olan buharlaşma sedimasyon yöntemine dayanmaktadır. Üçgen, yakın paketlenmiş polistiren boncuklar arasındaki kesişmeler, kurbanlık bir metalin kaplanacağı açıklıklar oluşturur, direkler oluşturur (Şekil 2 ve Ek Şekil 1). Bu adımdan önce boncukların kısa tavlanması, bu direklerin şeklini ve çapını ayarlar. Boncuklar çıkarılır, direklerin etrafına son bir metal tabaka biriktirilir ve ardından direkler kaldırılır. kolloidal nanoküme, ara direklerin çıkarılması ve pasivasyon ve bağlama için yüzey kimyası modifikasyonu üzerine iki metal biriktirme adımından sonra, ZMW dizileri tek molekül görüntüleme için kullanıma hazırdır. İmalat sonrası ZMW optik özelliklerinin daha kapsamlı karakterizasyonu, eşlik eden bir makalede bulunabilir38. Metallerin buhar biriktirmesi için bir termal evaporatör dışında, özel bir alet gerekmez.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Tüm adımlar genel laboratuvar alanında tamamlanabilir.

1. Cam kapak temizliği

  1. Kolloidal parçacıkların buharlaştırıcı birikmesi için temiz bir yüzey sağlamak için, temizlik için coplin cam boyama kavanozunun yivli kesici uçlarına 24 x 30 mm optik borosilikat cam kapak örtüleri (0,16−0,19 mm kalınlık) yerleştirin.
    NOT: Temizlik işlemi sırasında tüm yüzeylerin net bir şekilde açığa çıkması için kapakların dik durduğundan ve iyi ayrıldığından emin olun.
  2. Boyama kavanozuna örtüleri örtecek, kapağı yerize edecek ve 40 ° C'de 10 dakika boyunca sonicate edecek kadar aseton dökün.
  3. Asetonu dökün ve boyama kavanozuna damıtılmış H2O doldurup suyu dökerek kapakları durulayın. 2 kez daha tekrarlayın.
  4. Aseton sonication (adım 1.2 ve 1.3) bir kez daha tekrarlayın.
  5. 40 ° C'de 20 dakika boyunca örtüleri ve sonikatı kaplayacak kadar kavanoza 200 mM KOH dökün.
    NOT: KOH camı hafifçe etches.
  6. Kapakları damıtılmış H 2 Oile 6kez durulayın.
  7. Kapakları örtmek için etanol ekleyin, kapağı ekleyin ve 40 ° C'de 10 dakika boyunca sonicate.
  8. Kapakları damıtılmış H ile2O 3 kez durulayın.
  9. Yumuşak tokparlaplar kullanarak her kapak kapağını kenardan alın ve kapakları N2 gazı ile kurutun. Sadece kapak ucunun kenarlarına dokunun. Kurutulmuş, temizlenmiş kapak örtülerinin her birini ayrı bir temiz Petri kabına yerleştirin.

2. Polistiren boncukların buharlaştırıcı birikmesi

  1. ZMW dizisi için kolloidal kristal maske oluşturmak için, 1 μm çapında 50 μL santrifüj, 15.000 x g,25 °C'de 5 dakika boyunca işlevsel olmayan polistiren boncuklar (suda% 2,5 w/ v).
    NOT: Boncukları pipetlemeden önce, boncukların şişenin dibine yerleşmesi durumunda stok çözeltisi kısa bir süre girdaplanmalıdır.
  2. Mümkün olduğunca az su bırakarak süpernatant atın.
    NOT: Artık su etanol resüspenzyon39buharlaşma özelliklerini değiştirebilir, bu nedenle tüm suyu çıkarmak için az miktarda boncuk çıkarılması kabul edilebilir.
  3. Boncukları adım 2.2'den 1:400 TritonX-100:etanol çözücünün 50 μL'sinde yeniden atın. Pipet, boncukları çözücü ile iyice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı.
    NOT: TritonX-100:etanol çözücü kullanımdan sonra parafin filmi ile kapatılmalı ve ayda bir kez taze olarak hazırlanmalıdır. Boncuklar, mikrosantrifüj tüpü gibi plastik bir kabın kenarlarına yapışma eğilimindedir, bu nedenle tüm boncukların yeniden dirilmesini sağlamak için yanlar boyunca pipet.
  4. Biriktirme için bir nem odası kurmak için, her biri bir kapaklı 6 Petri kabını, kapakları biraz aralık bırakılmış bir çizgide bir bankın üzerine yerleştirin. Her yemekte, bir sonraki adımda nem arttığında kapak örtülerinin ortama maruz kalabilmesi için kapakçığı açık bölgeye taşıyın.
  5. Petri tabaklarının arkasına bir higrometre ve küçük bir elektrikli fan yerleştirin.
  6. Laboratuvarda başlangıç bağıl nemini (RH) kaydedin. 200 mL'lik bir kabı 150−200 mL ~75 °C su ile doldurun ve fanın arkasına yerleştirin.
  7. Fanı açın ve Petri kaplarını, fanı, kabı ve higrometreyi devrilmiş, şeffaf bir plastik saklama kabıyla (66 cm x 46 cm x 38 cm) örtün.
  8. Haznedeki RH'nin %70−75'e yükselmesine izin verin, bu da tipik olarak 5−10 dakika sürer.
    NOT: Ortam laboratuvarı RH'si düşükse (~%50'nin altında), biriktirme sırasındaki nem kaybını telafi etmek için odanın daha yüksek bir RH'ye ulaşmasını, ancak% 80'den yüksek olmamasını sağlar (aşağıya bakın).
  9. RH% 70−75'e ulaştığında, RH'yi kaydedin ve plastik saklama kabını hafifçe kaldırarak petri kaplarına kapakları hızlı bir şekilde yerleştirin, bu da kapakların aşırı ıslanmasını önler.
    NOT: Haznedeki sıcaklık, nemlendirme sonucu oda sıcaklığından biraz daha sıcak olacaktır, tipik olarak 25−26 °C. Kapaklarda nem görünüyorsa, cam yüzeyler çok ıslaktır. Ticari bir torpido gözü protokolün bu bölümünü basitleştirebilir.
  10. Odadaki RH%85'e yükselmeye devam etsin. Bu noktada, RH'yi nem haznesine kaydedin ve boncuk süspansiyonunun pipeti 5 μL'yi her kapak kapağının ortasına kaydedin.
  11. Nem kaybını en aza indirmek için her biriktirmeden sonra odayı ve Petri tabaklarını kapatın. 2 dakika içinde tüm 6 ifadeleri bitirmek hedefleyin.
  12. İfadeden sonra RH'yı hazneye kaydedin.
    NOT: Biriktirmeden sonraki RH, ortam laboratuvarı koşullarına bağlı olarak biriktirme sırasında nemin ne kadar hızlı kaybolduğunu ölçmeye yardımcı olacaktır. Tipik bir başarılı çalışma için, oda ifadeden önce% 85 RH'den başlayacak ve ifadeden sonra% 70−75 RH'de sona erecektir.
  13. Boncuk damlacıklarının yayılmasına ve 5 dakika kurumasına izin verin.
    NOT: Kolloidal kristallerin çok sayıda deliği veya çok katmanlı bölgesi varsa, oda sırasıyla çok nemli veya kuruydu. Petri kaplarını kapatmak ve ifadelere başlamak için bağıl nemi ayarlayın (optimizasyonun daha fazla tartışılması için sonuçlar bölümüne bakın).

3. Kolloidal kristal şablonunda gözenek boyutunu azaltmak için boncuk tavlama

  1. Boncuklar arası kesişme yerlerini daraltan ve interstices'in köşelerini yuvarlayan polistiren boncukların tavlama için düzgün bir sıcaklık yüzeyi sağlamak için, standart bir seramik sıcak plakanın üzerine düz, öğütülmüş bir alüminyum plaka yerleştirin.
  2. Sıcak plakanın sıcaklığını 107 °C'ye, polistirenin cam geçiş sıcaklığını40'aayarlayın.
    NOT: Kararlı ve doğru sıcaklık elde etmek için alüminyum plakada 2−3 mm genişliğinde ve 4−5 mm derinliğinde bir delikte bir termokuple probu tutulmuş.
  3. Sıcak alüminyum plakaya boncuk şablonunun ve 20 sn tavlamanın üzerine boncuk şablonunun bulunduğu bir kapak ucu yerleştirin (erime süresinin açıklanması için tartışma bölümüne bakın).
  4. Isıttıktan sonra, kapak kapağını alüminyum plakadan çıkarın ve soğutmak için derhal başka bir oda sıcaklığındaki alüminyum yüzeye yerleştirin.
    NOT: Kapakların teslim alımını kolaylaştırmak için kapak kapaklarının plakanın kenarına hafifçe asması veya sığ kanalları (beraberindeki videoya bakın) plakaya asması yararlıdır.

4. Kolloidal kristal şablonu kullanılarak alüminyum sıfır mod dalga kılavuzlarının nanofabrikasyonu

  1. Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, boncuklar arasındaki kafeslerde direkler oluşturmak için kolloidal kristal şablonun üzerine 2 Å/sn'de 300 nm bakır biriktirin.
  2. Yüzeye bantla hafifçe bastırarak boncukların üstündeki fazla metali çıkarın. Metali çıkarmak için bandı yavaşça soyun.
    NOT: Bant çekildikten sonra bazı küçük yansıtıcı fazla metal lekeleri kalabilir ve bunlar genellikle N2 gazı akışı ile çıkarılabilir. Bant çekildikten sonra önemli yansıtıcı fazla metal lekeleri kalırsa, polistiren boncukları kısmen çözmek için şablonları 2 saat boyunca toluen içine çekmeyi deneyin. Kapakları damıtılmış suyla yıkayın, N2ile kurulayın ve bant çekmesini tekrarlayın. Boncuklar bant çekme sırasında direkleri hasardan korumaya yardımcı olduğu için ek ıslatma boncukları tamamen çözmemelidir.
  3. Polistiren boncukları çözmek için boncuk şablonlarını toluene yerleştirin ve gece boyunca ıslatın.
    DİkKAT: Toluen dumanı toksik olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında toluen ile çalışın ve eldivenler, güvenlik gözlükleri ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Toluen yanıcı sıvılar için belirlenmiş havalandırmalı dolaplarda saklanmalıdır.
  4. Toluen inkübasyonundan sonra, şablonları bir kez kloroform ve iki kez etanol ile durulayın. Hassas 200−300 nm boyundaki metal direkler artık açığa çıktığı için bu noktada kapak örtülerini dikkatlice tutturun. Şablonları N2 ile kurutun ve oksijen plazma temizleyicisinde kalan polimer ve kirleticileri 30 dakika boyunca çıkarın.
    DİkKAT: Kloroform dumanlar toksik olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında kloroformla çalışın ve eldivenler, güvenlik gözlükleri ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Kloroform, diğer yanıcı çözücülerden uzakta havalandırılmış dolaplarda saklanmalıdır.
  5. Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, 1 Å/s'de 3 nm titanyum yapışıklık tabakası ve ardından bakır direklerin etrafında ve üstünde 4 Å/s'de 100−150 nm alüminyum biriktirin.
    NOT: Daha derin kılavuzlar ve arka plan floresanının daha iyi zayıflamasını elde etmek için daha kalın kaplamalar kullanılabilir, ancak bu aynı zamanda bir sonraki adımda gönderileri açığa çıkardıktan ve çözdükten sonra verimi azaltır (tartışma bölümüne bakın).
  6. Metal direkleri çözmek için, kapakları bakır etchant (sitrik asit bazlı) içine batırın; Malzeme Masası) 2 saat boyunca.
    DİkKAT: Metal etchant cilt yanıklara neden olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında etchantlarla çalışın ve koruyucu ekipman giyin. Elleçlemeden sonra ellerinizi iyice yıkayın. Metal etchant, aşındırıcı sıvılar için belirlenmiş havalandırmalı dolaplarda saklanmalıdır.
  7. Kapakları damıtılmış suyla durulayın, N2ile kurutun ve hala kaplama ile kaplı herhangi bir gönderiyi ortaya çıkarmak için metal kaplamanın yüzeyini lens kağıdı ile hafifçe buff. Kapakları 2 saat daha bakır vbhant içine yerleştirin, sonra damıtılmış su ile tekrar durulayın ve N2ile kurulayın.
    NOT: ZMW slaytlar, kirleticilerden uzak tutmak için kapalı, temiz Petri kaplarında saklanmalıdır.

5. Kolloidal kristal şablonu kullanılarak altın sıfır mod dalga kılavuzlarının nanofabrikasyonu

NOT: Alüminyum ZMWs imal protokolü yansıtan altın ZMWs(Ek Şekil 1)imal yöntemi bu bölümde verilmiştir.

  1. Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, 1 Å/s'de 3 nm titanyum yapışıklık tabakası ve ardından 4 Å/s'de 300 nm alüminyum biriktirin.
  2. Yüzeye bantla hafifçe bastırarak boncukların üstündeki fazla metali çıkarın. Metali çıkarmak için bandı yavaşça soyun.
  3. Polistiren boncukları çözmek için boncuk şablonlarını toluene yerleştirin ve gece boyunca ıslatın.
  4. Toluen inkübasyonundan sonra, şablonları bir kez kloroform ve iki kez etanol ile durulayın. Şablonları N2 ile kurutun ve oksijen plazma temizleyicisinde kalan polimer kirleticileri 30 dakika boyunca çıkarın.
  5. Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirmeyi kullanarak, alüminyum direklerin etrafında ve üstünde 5 Å/s'de 100−150 nm altın biriktirin.
  6. Metal direkleri çözmek için, kapakları alüminyum etchant (fosforik asit bazlı) içine batırın; Malzeme Masası) 1 saat boyunca.
  7. Kapakları damıtılmış suyla durulayın, N2ile kurutun ve hala kaplama ile kaplı herhangi bir gönderiyi ortaya çıkarmak için metal kaplamanın yüzeyini lens kağıdı ile hafifçe buff. Kapakları 1 saat boyunca alüminyum vbhant içine geri yerleştirin, ardından damıtılmış su ile tekrar durulayın ve N2ile kurulayın.
    NOT: ZMW slaytlar kapalı, temiz Petri kaplarında saklanmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Polistiren kolloidal parçacıkların buharlaştırıcı sedimansasyon yoluyla kendi kendine montajı (adım 2.1−2.13), çözücü buharlaşma hızının kontrol edilmesi gerektirdiğinden bir dizi sonuç üretebilir. Bununla birlikte, ifadeler hızlı olduğundan (tur başına 10−15 dk), prosedür farklı ortam laboratuvarı koşulları için hızlı bir şekilde optimize edilebilir. Şekil 3A, biriktirme ve buharlaşmadan sonra iyi biçimlendirilmiş bir kolloidal şablon gösterir. Makroskopik olarak, boncukların bölgesi daireseldir ve kenarlıklar opak, çok katmanlı bir boncuk halkası ile tanımlanır. Görüntüdeki yarı saydam, ancak beyaz olmayan bölgeler istenen monolayer alanlardır. Şekil 3B, aşırı nemli bir ortamda paketlenmiş bir kolloidal şablonu göstermektedir (Petri yemekleri kapatıldığında% 80 RH). Bu şablonlar temiz bir dairesel sınıra sahip olma eğilimindedir ve dışa doğru uzanan çok katmanlı dallara sahiptir. Biriktirme kabul edilebilir ve sonraki aşamalarda kullanılabilir, ancak kafesteki delikler tek molekül görüntüleme için kullanılabilir ZMW dizi alanlarının sayısını azaltır. Şekil 3C, aşırı kuru bir ortamda paketlenmiş bir kolloidal şablonu göstermektedir (Petri yemekleri kapatıldığında% 65 RH). Bu şablonlar genellikle ideal, iyi yayılmış şablonlara kıyasla daha küçüktür. Biriktirme kullanılabilir, ancak içe doğru çizgili çok katmanlı, beyaz bölgeler görüntüleme için kullanılabilir alanı azaltır. Bu nedenle, işlemin sonuna doğru ifadeler oda açılıp kapatıldığı için daha düşük bir nemde gerçekleşeceğinden, aynı anda 6'dan fazla ifade verilmesini önermiyoruz. Şekil 3D, yansıyan ışığın polistiren kristalinden kırınımı ile üretilen gökkuşağı desenini göstermektedir. Bu desen, gözle kristal paketlemenin başarısını ve kalitesini doğrulamak için kullanılabilir. Şekil 3E,F, iyi paketlenmiş kolloidal şablonların atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) görüntülerini gösterir. Tahıllar arasındaki kusurlar buharlaştırıcı çökelti41sırasında sıkışmadan kaynaklanır ve farklı taneler 10x hedefiyle görülebilir. Bu nedenle, kolloid indüksiyonlarının düşük güçlü bir ışık mikroskobu ile incelenmesi, ambalajlamayı değerlendirmek için de kullanılabilir.

Bakırın tavlanmış kolloidal şablonlara yerleştirilmesinden sonra (adım 4.1), gökkuşağı kırınım deseni boncukların üstlerini yansıtan metal kaplama ile hala görünür ve geliştirilmiş olmalıdır (Şekil 4A,B). Şablonlar, fazla bakırı temizleyen Scotch bant çekmeden (adım 4.2) sonra yansıtıcı gökkuşağı kırınım desenini kaybeder (Şekil 4C). Şekil 4D,E, metal biriktirmeden sonra tipik bir bakır direk alanının AFM görüntülerini gösterir. Şekil 3E'deki kolloidal kristal taneleri arasındaki kusurlar bakır post görüntülerinde bakırın daha büyük bölgeleri olarak görülebilir. AFM görüntülerinin analizi, 300 nm bakır biriktirme kalınlığı için, nihai bakır direklerinin ortalama 255 nm (Şekil 4F) yüksekliğinde ve 121 nm çapında (Şekil 4G).

Boncukların bakır direklerin üzerinde ve üzerinde olduğu alüminyum kaplamanın (adım 4,5) birikmesi ve daha sonra direklerin çözülmesi (adım 4,6 ve 4,7) Şekil 5A−C'degösterilen alüminyum ZMW'lerle sonuçlanır. Kolloidal kristal taneleri arasındaki kusurlar daha büyük açıklıklar olarak görülebilir (Şekil 5B). Şekil 5C'deki ZMW merkezleri arasındaki ortalama mesafe 559 nm'dir, 1 μm boncukların altıgen yakın ambalaj geometrisi tarafından ayarlanan aralıkla tutarlı ( Equation 1 20 s için tavlanmış polistiren şablonları kullanarak ortalama 118 nm çapında dalga kılavuzları ile sonuçlanır (Şekil 5D,E), post çapları ile tutarlı ve görünür ışığın yayılmasını kesmek için yeterince küçük. Şekil 5D'den bir dalga kılavuzunun yükseklik profili de ~120 nm derinliğinde olduğunu göstermektedir.

İşlevsellik testi için ZMW'lerde tek molekül FRET yapıldı (Şekil 6A). Görüntüleme için tipik bir ZMWs alanı Şekil 6B'de gösterilmiştir, bu alan 40 x 80 μm görüş alanında >3000 dalga kılavuzu içerir. ZMW'ler ilk olarak daha önce açıklanan protokoller kullanılarakpasifleştirilmiştir 42,43. Kısaca, alüminyum ZMW'ler, alüminyum kaplamayı kaplamak için poli (vinilfosfonik asit) ile pasifleştirildi ve ardından ZMW'lerin cam diplerini kaplamak için biyotinle sonlandırılmış PEG ile doped metoksi ile sonlandırılmış polietilen glikol (PEG) yapıldı. Altın ZMW'ler, altın kaplamayı kaplamak için tiyol türevi PEG ile pasif hale getirilebilir ve ardından cam dipler için benzer bir PEG tedavisi yapılabilir. Akış odaları, ~20 μL hacim, daha sonra tek molekül görüntüleme için inşa edilmiştir44. DNA dublekslerinin tek molekülli FRET görüntülemesi daha önce açıklandığı gibigerçekleştirildi 38. Kısaca, streptavidin (5 dk inkübasyon, 0,5 mg/mL çözelti) ile işlevsel hale getirilen akış kanallarında 100 pM−1 nM siyanin-3/siyanin-5 (Cy3/Cy5), biyotinillenmiş DNA dubleksleri (33 baz çift uzunluğu) 10 dk kuluçkaya alındı. Etiketli makromoleküllerin konsantrasyonu, dalga kılavuzlarının tek bir molekülle ~ % 20 yüklenmesini sağlamak için titratlanabilir ve Poisson dağıtılmış yüklemesine dayanarak birden fazla molekülle yüklenen% <5 dalga kılavuzuna yol açabilir (çoğu dalga kılavuzu, ~ % 75, molekülleri olmayacaktır)45. İlişkisiz DNA nükleaz içermeyen dubleks tampon ve ardından aydınlatma tamponu (%0,3 [w/v] glikoz, 300 μg/mL glikoz oksidaz, 120 μg/mL katalaz ve 1,5 mM Trolox [6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametrin-kroman-2-karboksilik asit]). Biyotinilasyonsuz Cy5 etiketli DNA dubleksleri (33 baz çift uzunluğu) aydınlatma tamponunda 0, 50, 100 ve 500 nM'de çözeltide arka plan floroforları olarak mevcuttu. Hareketsiz Cy3/Cy5 dubleks DNA moleküllerinden elde edilen tek moleküllü FRET izleri, epi-floresan koşullarına göre ayarlanmış özel yapım bir TIRF mikroskobu ile kaydedildi. Filmler, alternatif 532 nm ve 640 nm uyarım (100 ms pozlama) ile 1.48 sayısal diyafram (NA) 100x yağ daldırma hedefi ve Cy3 ve Cy5 emisyonunu aynı anda elektron çarpan yük bağlantılı bir cihaz (EMCCD) kamerasına kaydetmek için çift görüş spektral ayırıcı ile kaydedildi. Cy5 kanalında tek adımlı ağartıcılar bulunan tek moleküllü FRET izleri, test edilen Cy5'in tüm ortam konsantrasyonlarında tespit edilebilirdi (Şekil 6C−F). Buna karşılık, tek moleküller sadece pM ila düşük nM çözelti florofor konsantrasyonları46ile TIRF aydınlatmasında tespit edilebilir.

Figure 1
Şekil 1: Sıfır mod dalga kılavuzlarının şeması. Sağdaki tek bir ZMW'nin genişletilmiş kesit diyagramı ile ZMW dizisinin diyagramı. ZMWs'nin cam tabanına kimyasal olarak hareketsiz hale getirilmiş (bu örnekteki mRNA aracılığıyla) tek floresan etiketli ilgi çekici enzimler (floresan boyayı temsil eden kırmızı daireli kahverengi ribozom) tipik bir lazer tabanlı epifluoresans mikroskopisi kurulumu ile görüntülenebilir. 532 nm heyecan ışığı (yeşil oklar), diyaframın küçük boyutu (100−200 nm çapı) nedeniyle cam-metal sınırına yansır, ancak ZMW içinde katlanarak çürüyen yayılmayan bir evanescent dalgası bulunur. Bu, 10−30 nm etkili aydınlatma derinliği (diyaframda yeşil gölgeleme) ile sonuçlanır. NM ila μM konsantrasyonlarında bireysel floresan ligandlar (floresan etiketleri olarak yeşil dairelere sahip mavi tRNA'lar) eklenir. Diyaframa yayılır ve enzimle etkileşime giren bireysel bir ligand, yasaklayıcı arka plan floresan olmadan görüntülenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Alüminyum ZMW dizileri imal etmek için geliştirilen kolloidal templating yönteminin şeması. 1 μm çapında polistiren boncuklar, protokolün 2. Boncuklar daha sonra gözenek boyutlarını azaltmak için tavlanır (bölüm 3), ardından toluen bakır biriktirme ve boncuk çözünmesi. Alüminyum, bakır direklerin etrafına ve üstüne biriktirilir, daha sonra altıgen bir nanoaperture dizisini geride bırakmak için seçici olarak kazınır (bölüm 4). Son üç adım için, bakır direklerin ve alüminyum ZMW'lerin genişliklerini ve yüksekliklerini göstermek için plan görünümlerinin sağında kesitsel görünümler sağlanır.

Figure 3
Şekil 3: Kolioidlerin buharlaştırıcı birikiminden temsili sonuçlar. (A) Optimal kolloid birikimi örneği. (B) Koşulların idealden daha nemli (%80 RH) olduğu kabul edilebilir kolloid birikimi örneği. Kristal monolayerdeki delikler belirgindir. (C) Koşulların optimalden daha kuru (%65 RH) olduğu kabul edilebilir kolloid birikimi örneği. Monolayer bölgeler biraz yarı saydamken, çok katmanlı alanlar beyaz ve opaktır (çevre ve çizgiler içe). (D) Kristallerden gökkuşağı kırınımını vurgulamak için beyaz ışıkla aydınlatılmış kolloidal bir kristal. (E) Başarılı bir kolloid birikiminden altıgen olarak paketlenmiş polistiren boncuk tek katmanlı bir tek katmanlının AFM görüntüsü (havadaki prob AFM'ye dokunma) (ölçek çubuğu = 10 μm). (F) Paketlenmiş boncukların genişletilmiş AFM görüntüsü (ölçek çubuğu = 2 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Bakır birikiminden sonra ZMW şablonlarının makroskopik ve mikroskobik görüntüleri. (A) Boncuk şablonlarının üstündeki bakırın fiziksel buharlaşmasından sonra slaytların resmi. (B) Bakır biriktirmeden sonra boncuk şablonlarından gökkuşağı kırınım deseni. (C) Fazla bakırı ve bandı (solda) çıkarmak için bir bant çekildikten sonra bir şablonun resmi (sağda). (D) Polistiren boncukların bant çekilmesi ve tamamen çözülmesinden sonra bakır direklerin AFM görüntüsü (ölçek çubuğu = 5 μm). (E) D panelinin daha yüksek büyütme AFM görüntüsü (ölçek çubuğu = 2 μm). (F) Bakır direk yüksekliklerinin histogramı (her post içinde maksimum yükseklik ölçümü olarak tanımlanır), n = 534. (G) Bakır post Feret çaplarının histogramı, n = 201. Feret çapı, iki paralel çizgi arasındaki en yüksek mesafedir (ImageJ47'deölçülür). Analiz için parçacıkları tanımlamak için, kaplamanın üst kısmı ile alt cam yüzeyi arasında bir eşik kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Alüminyum ZMW'lerin makroskopik ve mikroskobik görüntüleri. (A) Bakır direklerin etrafında ve üstünde 150 nm alüminyumun fiziksel buharlaştırıcı birikmesinden sonra slaytların resmi. (B) Çözünme sonrası alüminyum ZMW'lerin AFM görüntüsü (ölçek çubuğu = 5 μm). (C) B panelinin daha yüksek büyütme görüntüsü (ölçek çubuğu = 0,2 μm). (D) C panelinden tek bir ZMW'nin tipik derinlik profili C panelinde çizilen yeşil çizgiden alınan profil C. (E) ZMW Feret çaplarının histogramı, n = 240. Feret çapları Şekil 4'teolduğu gibi ölçtürüldüğünde. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: ZMW'lerde tek molekül FRET görüntüleme. (A) Cy3'ün tek moleküllü FRET görüntülemesinin şematik (ölçeklememek için değil), arka planda Cy5 etiketli dubleksler ile ZMW'lerde Cy5 etiketli DNA dubleksleri. (B) Beyaz ışık aydınlatması altında ZMWs örnek alanı (ölçek çubuğu = 10 μm). (C−F) Çözeltide 0 (C), 50 (D) , 100 (E)ve 500 nM (F)Cy5 etiketli dubleksler varlığında ZMW'lerde hareketsiz hale getirilen DNA dublekslerinin tek moleküllü FRET kayıtları. Her konsantrasyon için, üst panel 532 nm lazer aydınlatma (FRET görüntüleme) altında Cy3 (yeşil) ve Cy5 (kırmızı) floresan yoğunluğunu gösterir, orta panel altında Cy5 floresan yoğunluğunu gösterir 640 nm lazer aydınlatma (doğrudan alıcı uyarımı) ve en düşük Equation 2 panel, ham Cy3 (ID) ve Cy5 (IA) floresan yoğunluklarından hesaplanan FRET verimliliğini gösterir. Görüntüleme sırasında, heyecan dalga boyu her 100 ms'de bir 532 ila 640 nm arasında değişir.

Ek Şekil 1: Altın ZMW dizisini imal etmek için geliştirilen kolloidal templating yönteminin şeması. Altın ZMW dizisi imal protokolü alüminyum ZMW dizisi imal protokol benzer (Şekil 2). Polistiren boncukların üzerine bakır biriktirmek yerine alüminyum birikir. Boncukları toluen içinde çözdükten sonra, direklerin üzerine alüminyum yerine altın biriktirilir. Alüminyum direkler daha sonra altın ZMW dizisini geride bırakmak için seçici olarak kazınır. Son üç adım için, alüminyum direklerin ve altın ZMW'lerin genişliklerini ve yüksekliklerini göstermek için plan görünümlerinin sağında kesitsel görünümler sağlanır.

Ek Şekil 2: ZMW'lerde elektromanyetik alan yayılımının sonlu eleman modellemesi. (A−D) Zaman ortalaması alan Poynting vektörü (W/m2)büyüklüğünün kesitleri, unannealed şablondan (A,C) ve tavlanmış şablondan (B,D)yapılan bir dalga kılavuzu aracılığıyla. Şekilde listelenen dalga boylarındaki doğrusal polarize elektromanyetik düzlem dalgaları (slayt alanına dağılmış 1 W) alt yüzeye yansıtılmış, ve en düşük dalga sayısına sahip olan en düşük (temel) mod, Maxwelldenklemlerinive uygun sınır koşullarını çözmek için sonlu eleman yöntemiyle modelleme yazılımı ( Malzeme Tablosu ) kullanılarak hesaplanmıştır. Dalga kılavuzlarının sınırlarının, alüminyum veya altın duvarlarla iyi bir şekilde yaklaşık olarak tahmin edilen mükemmel elektrik iletkenleri olduğu varsayıldı. Unannealed waveguide şablonundan kesit, 1 μm çapında dairelerin altıgen ambalajı ile belirlendi ve ortaya çıkan üçgen şeklinden elde edilen üç köşeli uçlar gerçekçi bir fiziksel diyaframı modellemek için ~ 60 nm genişliğe kırpıldı. Tavlanmış şablonlardan kesit yaklaşık 130 nm çapında bir daire olarak yapıldı. Her iki dalga kılavuzu da imalat sonrası kaplama derinliğine benzer şekilde 130 nm derinliğe sahipti. (E,F) 400 nm ve 1.000 nm'lik heyecan dalga boylarına ek olarak, modeller 400 nm ile 1.000 nm arasında eşit aralıklarla 100 heyecan dalga boyunda çözüldü. ve etkili mod Equation 3 indeksi (k z'nin enine düzlemdeki kısıtlama nedeniyle azalan dalga kılavuzundaki dalga sayısı olduğu ve k vakumdaki heyecan ışığı dalga sayısı olduğu) üçgen (E) ve dairesel (F) dalga kılavuzları için heyecan dalga boylarına karşı çizilmiştir. Daha kısa dalga boyları için daha yüksek modlar heyecanlanır ve etkili mod indeksi artar (maksimum etkili mod indeksi 1'dir, bu da elektromanyetik düzlem dalgasının enine boyutta sınırsız hareket ettiği sınırlayıcı durumdur). Dalga kılavuzlarının etkili kesme dalga boyları, etkili mod indeksinin 0'a düştüğü dalga boyu olarak tahmin edildi. Dairesel kılavuzun sonlu eleman modellemesinden (F) 221 nm'lik kesmenin dairesel dalga kılavuzunun kesme dalga boyunun teorik tahminiyle tutarlı olduğunu unutmayın (φkesme,analitik = 1,7d = 221 nm, burada d dalga kılavuzu çapıdır). Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Au ZMW imalatından temsili sonuçlar. (A) Altın ZMW dizilerinin makroskopik resmi. (B−D) Tavlanmamış bir boncuk şablonundan alüminyum gönderilerin AFM görüntüleri (B), 20 s (C)için 107 °C'de tavlanmış bir şablon ve 25 s (D)için 107 °C'de tavlanmış bir şablon. (E) Alüminyum direklerin çözülmesinden sonra altın ZMWs'nin AFM görüntüsü. (F) E panelinin daha yüksek büyütme AFM görüntüsü(G) Altın bir ZMW'nin tipik derinlik profili. F panelinde çizilen yeşil çizgiden alınan profil (ölçek çubuğu = B, C, Dve F'de1 μm ; E'de5 μm). Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kolloidal kendi kendine montaj için (protokol bölüm 2), süspansiyon çözücü olarak su yerine etanol kullanımı buharlaşma işlemini hızlandırır, böylece şablonlar önceki yöntemlerde olduğu gibi 1−2 saat yerine 2−3 dakika içinde hazırlanır48,49. Burada sunulan evaporatif sedimentasyon protokolü, süspansiyon49,50,51'inüzerindeki yüzey eğimini, sıcaklığı ve hava hacmini kontrol etmeyi gerektiren önceki sedirasyon protokollerinden daha basittir. Bu protokolde kullanılan parçacık hacmi fraksiyonu% 2.4'tür, önceki sedimentasyon yöntemlerinde kullanılan% 0.2−0.5'ten daha yüksektir48, bu da kolloidleri su gliserol karışımlarında çok daha uzun çökeltme zaman ölçekleri için yeniden kullandı. Bununla birlikte, ifadelerin kalitesi parçacık hacmi fraksiyonundaki değişikliklere karşı sağlamdır, geçmiş çalışmalar% 2−1049,50,51arasında değişebileceğini bulmaktadır. Bu protokolden başarılı bir şekilde ifade edilen kolloidal kristallerin tane boyutları 20−30 μm çapındadır, önceki sedimasyon yöntemlerinden (genellikle birkaç yüz nanometre çapında) oluşan tanelerden dahabüyüktür 48,49. Makroskopik olarak kolloidal monolayerin kabaca 2 cm çapındaki alanları da önceki yöntemlerle üretilen 1 cm'lik alanlarla karşılaştırılabilir49. Bu yöntemde üretilen kolloidal kristal şablonlarının büyük boyutu, her biri yaklaşık 3−4 mm genişliğinde3−5ayrılmış akış odası 44'ün her ZMW kaydırağı üzerinde yapılmasını sağlar. Böylece, her slaytta birden fazla bağımsız tek molekül deneyi yapılabilir.

Kolloidal boncuk şablonlarını (protokol bölüm 3) kendi kendine montajdan sonra tavlamak, ZMW'lerle arka plan floresanını yeterince azaltmak için basit, ancak önemli bir adımdır. Ek Şekil 2'nin gösterdiği gibi, üçgen kesitli bir dalga kılavuzu için uygun kesme dalga boyu 894 nm'dir. Buna karşılık, tavlanmış bir şablondan 130 nm çapında dairesel dalga kılavuzu için etkili kesme dalga boyu, hem analitik olarak (kılavuzun çapının 1,7 katı 18) hem de sayısal olarak belirlendiği gibi221 nm'dir. Biriktirme için daha küçük boncuklar kullanmak şablon gözeneklerinin boyutunu da azaltabilir, ancak dalga kılavuzları daha sonra görünür ışığın kırınım sınırı etrafında olan 200 nm'den daha yakın aralıklı olacaktır. Ayrıca, dalga kılavuzları kesitte üçgen olarak kalır ve bu da dalga kılavuzu yoluyla simetrik olmayan güç yayılmasına yol açar(Ek Şekil 2A−D). Tavlama adımının bir dezavantajı, erime süresindeki değişkenliğin dalga kılavuzu çapında dalgalanmalara neden olabileceğidir, bu nedenle doğru zamanlama partiler arasındaki varyasyonu en aza indirmeye yardımcı olur. Interstices tavlama süreleri 25 s'den daha uzun sürede kapanmaya başlar ve post çapları 20−25 s(Ek Şekil 3B−D)arasında çok fazla azalmaz. Geçiş kapanışı için hızlı bir test, tavlanmış şablonların ışıkla aydınlatıldığında ve bir açıyla bakıldığında hala gökkuşağı kırınım deseni üretip üretmediğini kontrol etmektir. Değilse, interstices çoğunluğu muhtemelen kapanmış olabilir. Tavlama süresi ve tipik gözenek çapları arasındaki ilişki daha önce38.

Tavlama adımı sırasında istenen gözenek boyutuna ulaştıktan sonra, maskenin gölgesini oluşturmak için şablonlara bakır biriktirilir (adım 4.1). Metal şablona mümkün olduğunca dik bir şekilde yaklaşırken görüş hattı biriktirmeyi kullanmak önemlidir. Bu nedenle, numune ve metal kaynağı arasındaki mesafeyi artırmak ve şablonları tutan plakanın, bazı buhar biriktirme makinelerinde otomatik olarak yapıldığı gibi dönmemesini sağlamak, metalin polistiren substratına yanal birikmesini en aza indirmeye yardımcı olacaktır. Bununla birlikte, bazı yanal biriktirme kaçınılmazdır, bu da geçiş deliğinin boyutunu azaltır ve böylece daha fazla metal biriktirildikçe kesitsonrası 52. Bu prizma benzeri yapılar yerine piramit metal direkler ile sonuçlanır52.

Bakır direkler prizma şeklinde değil piramit şeklinde olduğundan, direklerin üstündeki alüminyum biriktirme (adım 4.5) eğimli tarafların bir kısmını da kaplar ve bazı direkler için bakır etchant'ın erişilebilirliğini engeller. Böylece, lens kağıdı buffing adımı (adım 4.7 veya 5.7), hala alüminyumla kaplı bakır direkleri mekanik olarak bozmak için etchant'a ilk ıslatmadan sonra eklendi. Daha uzun direkler oluşturmak için daha fazla bakır biriktirmek, lens kağıdı buffing sırasında gönderileri mekanik bozulmaya karşı daha hassas hale getirir. Bununla birlikte, 500 nm'den fazla bakır biriktirilmemelidir, çünkü biriktirmenin amacı 1 μm boncukların 500 nm orta çizgisine geçiş deliğini yansıtmaktır.

Diğer bir potansiyel zorluk, lens kağıdı buffing sırasında alüminyum kaplamanın istenmeden çıkarılmasıdır (adım 4.7 veya 5.7). Tavlama adımı eklendikten sonra, muhtemelen cama alüminyum yapışmasını engelleyebilen polistiren kalıntısının artması nedeniyle buffing sırasında alüminyum kaplama kaybının daha sık hale geldiğini tespit etti (protokol bölüm 3). Ancak, bant çekildikten sonra gece toluen ıslatma (adım 4.3 veya 5.3) bu sorunu çözdü. Şekil 4E'dekiAFM görüntüsünde, direkler arasında bazı polistiren artık halkaları görülebilir, ancak alüminyum kaplama 4.7 adımında hala birden fazla buff'a direndi. Alüminyum kaplamanın kaybı gece toluen ıslatıldıktan sonra bir sorun olmaya devam ederse, adım 4.4 veya 5.4'e bir RCA-1 (standart temizleme-1) yıkama, piranha yıkama veya daha fazla oksijen plazması temizliği eklenebilir. Bu yıkama adımları, ZMW'leri daha fazla temizlemek için son etch adımından (adım 4.7 veya 5.7) ve pasivasyondan önce de eklenebilir.

ZMW'lerin tek moleküllü FRET deneylerindeki performansı, EBL ile üretilen ZMW'lerin performansına benzerdi. Önceki birçalışmada, Cy3 etiketli tek moleküllü FRET, çözeltideki Cy5 etiketli DNA helikaz yükleyici proteini ile tek iplikli DNA (Şekil 6A'dakiyleaynı donör-alıcı düzenlemesi), FRET olayları 100 nM Cy5 arka planında açıkça ayırt edilebilirdi, 1 μM'de daha az açıktı (gürültüye daha düşük alıcı izleme sinyali) ve 10 μM'de ayırt edilemezdi. Ticari ZMWs ile daha önceki bir çalışmada, 1 mM54gibi yüksek arka plan konsantrasyonlarında tek moleküllü FRET kabul sinyallerinin, bizden ve şirket içi fabrikasyonZMW'larla 42,53'ün elde ettiği diğer çalışmalardan daha yüksek olduğunu not ediyoruz. ZMW'ler arasında sinyalden arka plana performansın daha fazla tartışılması Jamiolkowski veark. Floresan örneğinin ZMW yüzeyleri53 ile spesifik olmayan etkileşimi, özellikle çözeltideki dağınık floresan türleri büyük bir makromolekül ise, daha yüksek konsantrasyonlara erişimi sınırlayan yaygın bir zorluktur. Çeviri gibi karmaşık biyokimyasal sistemler üzerinde ZMWs ile yapılan çalışmalar genellikle serbest floresan substrat konsantrasyonlarını 100−250 nM55 , 56,57,58ile sınırlamaktadır. ZMW'lerin amaçlanan uygulamasından bağımsız olarak, yüksek konsantrasyonlarda gürültüye karşı kabul edilebilir sinyali korumak için farklı sistemler için pasivasyon yöntemlerinin optimizasyonu muhtemelen gerekli olacaktır.

Genel olarak, burada sunulan yöntem özel bir beceri veya ekipman gerektirmez, aynı anda birçok şablonun paralel olarak üretilmesine izin verir ve farklı metallerde ZMW'ler imal etmek için uyarlanabilir. Bu çalışmada bakır ve alüminyum, altın ZMWs imal etmek için sırasıyla alüminyum ve altın ile değiştirilmiştir (Ek Şekil 3). Bu, alüminyum yerine altın pasivasyon yöntemlerini kullanan laboratuvarlar için avantajlıdır. Ek olarak, altın ZMW'lerin görünür spektrumun kırmızı bölgesinde emen floroforlar için emisyonu artırdığı, alüminyum ZMW'lerin ise yeşil bölgede emen floroforlar için emisyonu artırdığı gösterilmiştir59. Gelecekte, bu yöntemle üretilen ZMW'lerden gelen floresan sinyal yoğunluğu, HF 16,26,60kullanılarak ZMW metal kaplamanın altındaki cama kazınarak artırılabilir. Bu, hareketsiz biyomolekülleri metal duvarlardan daha uzağa getirir, bu da floroforları61. Ayrıca, diyafram girişinin altında maksimum heyecan aydınlatma yoğunluğu vardır ve bu daha önce tek molekül emisyonunu geliştirmek için26,60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH hibeleri R01GM080376, R35GM118139 ve NSF Mühendislik Merkezi MechanoBiology CMMI: 15-48571'den Y.E.G.'ye ve NIAID doktora öncesi NRSA bursu F30AI114187'den R.M.J.'ye desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. Electromagnetism. , Addison-Wesley. Boston, MA. (2002).
  19. Jackson, J. D. Classical electrodynamics. Third edition. , Wiley. New York, NY. (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Tags

Biyomühendislik Sayı 159 sıfır mod dalga kılavuzları nano diyafram tek molekül floresan nanosfer litografi kolloidal kristal kendi kendine montaj

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

Yüksek Konsantrasyonlı Tek Moleküllü Mikroskopi için Sıfır Mod Dalga Kılavuzlarının İmalatı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M.,… More

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter