Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים אופטימליים לבחינת תאי חיסון חיים ופריפריאליים במערכת העצבים המרכזית, כולל המוח, חוט השדרה וקרומי המוח. כל אחד מהפרוטוקולים הללו מסייע לוודא את תפקודם והרכבם של התאים המאכלסים תאים אלה בתנאים יציבים ודלקתיים.

Abstract

מערכת העצבים המרכזית (CNS) מורכבת מהמוח ומחוט השדרה והיא עטופה על ידי קרומי המוח, שכבות קרומיות המשמשות מחסום בין הפריפריה למערכת העצבים המרכזית. מערכת העצבים המרכזית היא אתר מיוחד מבחינה אימונולוגית, ובמצב יציב, הזכות החיסונית ניכרת ביותר בפרנכימה של מערכת העצבים המרכזית. לעומת זאת, קרומי המוח מכילים מגוון רחב של תאים מקומיים, כולל תאי מערכת החיסון המולדת והנרכשת. במהלך מצבים דלקתיים המופעלים על ידי פגיעה במערכת העצבים המרכזית, אוטואימוניות, זיהום, או אפילו ניוון עצבי, תאים חיסוניים שמקורם היקפי עשויים להיכנס לפרנכימה ולהתמקם בתוך קרומי המוח. תאים אלה נחשבים לבצע פעולות מועילות ומזיקות במהלך פתוגנזה של מחלת CNS. למרות ידע זה, לעתים קרובות מתעלמים מקרומי המוח בעת ניתוח תא CNS, מכיוון ששיטות מיצוי רקמת CNS קונבנציונליות משמיטות את שכבות קרום המוח. פרוטוקול זה מציג שתי שיטות שונות לבידוד מהיר של רקמות CNS מורין (כלומר, מוח, חוט השדרה וקרומי המוח) המתאימות לניתוח במורד הזרם באמצעות טכניקות של תא יחיד, אימונוהיסטוכימיה ושיטות הכלאה באתר. השיטות המתוארות מספקות ניתוח מקיף של רקמות CNS, אידיאלי להערכת הפנוטיפ, הפונקציה והלוקליזציה של תאים התופסים את תא CNS בתנאים הומיאוסטטיים ובמהלך פתוגנזה של המחלה.

Introduction

מערכת העצבים המרכזית (CNS) היא אתר המתמחה אימונולוגית. הפרנכימה של מערכת העצבים המרכזית, למעט חלל CSF, קרומי המוח וכלי הדם, נתפסת באופן קלאסי כאתר חסוי חיסוני 1,2,3,4,5 והיא יחסית נטולת תאים חיסוניים בתנאים הומיאוסטטיים 2,6,7. לעומת זאת, קרומי המוח, המורכבים משכבות דורה, ארכנואיד ופיה, הם מרכיבים חיוניים בתא מערכת העצבים המרכזית, ומשתתפים באופן פעיל במעקב חיסוני הומיאוסטטי ובתהליכים דלקתיים במהלך פתוגנזה של מחלות 3,6,7,8. בתנאי מצב יציב, קרומי המוח תומכים במספר רב של תאי זקיף חיסוניים, כולל תאי לימפה מולדים (ILC), מקרופאגים, תאים דנדריטיים (DC), תאי פיטום, תאי T, ובמידה פחותה, תאי B 9,10,11.

קרומי המוח הם מבנים וסקולריים מאוד ומכילים כלי לימפה המספקים קשר לימפתי בין מערכת העצבים המרכזית לבין הפריפריה שלה 8,12,13,14. במצבים דלקתיים הנגרמים על ידי פגיעה במערכת העצבים המרכזית, זיהומים, אוטואימוניות או אפילו ניוון עצבי, תאי חיסון שמקורם היקפי חודרים לפרנכימה ומשנים את הנוף החיסוני בתוך קרומי המוח. לאחר חדירת תאים, קרומי המוח עשויים לייצג נישה תפקודית עבור תאי חיסון שמקורם היקפי, לקדם צבירה של תאי מערכת החיסון, הפעלה מקומית של תאי מערכת החיסון והישרדות לטווח ארוך בתא CNS. דלקת קרום המוח בולטת נצפתה במחלות מרובות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית, כולל טרשת נפוצה (MS)15,16,17,18,19, שבץ20,21, פגיעה סטרילית 22,23 (כלומר, פגיעה בעמוד השדרה ופגיעה מוחית טראומטית), מיגרנות 24, וזיהום מיקרוביאלי 25,26,27,28,29. לפיכך, אפיון התאים השוכנים ותאי החיסון ההיקפיים בתא קרום המוח חיוני להבנת תפקידם של תאים אלה בתנאי מצב יציב ופתוגנזה של מחלות.

הפקת המוח, חוט השדרה וקרומי המוח מהגולגולת ומגוף החוליות היא מאתגרת מבחינה טכנית וגוזלת זמן. כיום אין טכניקות זמינות למיצוי מהיר של המוח כאשר כל שלוש שכבות קרום המוח שלמות. בעוד שלמינקטומיה מניבה מורפולוגיה מצוינת של רקמת חוט השדרה ומשמרת את שכבות קרום המוח, היא גם גוזלת זמן רב וגם מסובכת30,31. לעומת זאת, שיטות מיצוי קונבנציונליות יותר כגון הסרת המוח מהגולגולת והאקסטרוזיה ההידראולית של חוט השדרה מקלות על חילוץ מהיר של רקמת CNS, אך הן קרומי המוח הארכנואידים והן הדוראליים הולכים לאיבוד בטכניקות אלה30,31. השמטת שכבות דורה וארכנואיד במהלך בידוד קונבנציונלי של רקמות המוח וחוט השדרה גורמת לניתוח חלקי של התאים בתוך תא מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, זיהוי של טכניקות חדשות המתמקדות מיצוי מהיר של רקמות CNS עם קרומי המוח שלמים הוא חיוני לניתוח אופטימלי של תא CNS.

כתב יד זה מציג שתי שיטות למיצוי מהיר של המוח, חוט השדרה וקרומי המוח מעכברים, מה שמקל על ניתוח במורד הזרם של תאים תושבים ותאי חיסון שמקורם היקפי בפרנכימה של מערכת העצבים המרכזית ובקרומי המוח. פרוטוקולים אופטימליים אלה מתמקדים ב 1) בידוד מתלים חד-תאיים לניתוח במורד הזרם ו -2) הכנת רקמות לעיבוד היסטולוגי. השגת תרחיפים חד-תאיים מהמוח, מרקמת חוט השדרה ומקרומי המוח הדוראליים והארכנואידים32 מאפשרת ניתוח סימולטני של תאים השוכנים הן בתא הפרנכימלי והן בתא קרום המוח. ניתן להשתמש במתלים של תא בודד ביישומים שונים, כולל בדיקות תרבית תאים לביצוע גירוי חוץ גופי 33, אימונוספוט מקושר אנזים (ELISpot) 28,34,35, ציטומטריית זרימה 36,33 ותא בודד 37 או תעתיק בתפזורת. בנוסף, הפרוטוקול האופטימלי להסתיידות של מוח שלם וחוט השדרה עם גולגולות שלמות או עמודי חוליות, בהתאמה, מאפשר הסתיידות עדינה של העצם שמסביב, השארת קרומי המוח שלמים ושימור המורפולוגיה של הרקמה. שיטה זו מאפשרת זיהוי סלקטיבי של חלבונים או RNA באמצעות טכניקות אימונוהיסטוכימיה (IHC) או הכלאה באתרו (ISH) הן בחלל הפרנכימי והן בחלל קרום המוח. אפיון הפנוטיפ, מצב ההפעלה והלוקליזציה של תאים תושבים ותאי חיסון שמקורם היקפי במערכת העצבים המרכזית עשוי לספק מידע חיוני להבנת האופן שבו סוגי תאים בודדים בתא CNS תורמים להומאוסטזיס ולפתוגנזה של מחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל עבודת בעלי חיים משתמשת בפרוטוקולים שנבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בבית הספר לרפואה גייזל בדארטמות'.

1. עיבוד דגימות מוח וחוט שדרה לצורך הסתיידות

  1. בידוד דגימות מוח וחוט שדרה
    1. הרדימו את העכבר באמצעות שאיפתCO2 . ודא שקצב זרימתCO2 מחליף 10%-30% מנפח הכלוב לדקה.
    2. באמצעות מלקחיים, להרים את תהליך xiphoid, לחתוך את דופן הבטן לרוחב ממש מתחת לכלוב הצלעות עם מספריים, למשוך כלפי מעלה כדי למנוע חיתוך כלי הדם או איברים מתחת. חותכים דרך הסרעפת לרוחב.
    3. חותכים את כלוב הצלעות לאורך הקצוות הרוחביים במקביל לריאות עד עצם הבריח. באמצעות מלקחיים, להרים את עצם החזה ולהדק את עצם החזה עם hemostat. הניחו את המוסטאט מעל הראש כדי להרים את כלוב הצלעות ולחשוף את הלב.
    4. בעזרת מלקחיים, לתפוס את הלב קרוב לקודקוד שלו ולעשות חתך באטריום הימני של הלב כדי לספק פורקן. הכנס מחט 25 גרם עם מזרק 10 מ"ל מחובר כדי לתת באיטיות 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט 1x קר כקרח (PBS) לחדר השמאלי כדי לנקב את העכבר באופן טרנסקרדילי.
      הערה: זילוח צריך להתרחש במשך 4-5 דקות עד שהכבד מנוקה מדם. סך של 10 מ"ל של 1x PBS הוא בדרך כלל מספיק עבור זילוח, אבל יותר ניתן להשתמש במידת הצורך. כבד צלול בדרך כלל מצביע על זילוח הולם.
    5. בעזרת מספריים חדים, הסירו את הראש באמצעות עריפת ראש (איור 1; 1). בצעו חתך בקו האמצע בעור (איור 1; 2) והפכו את העור מעל העיניים כדי לשחרר את הגולגולת.
    6. חתכו בעצם האף כדי לשחרר את הלסת התחתונה מהגולגולת (איור 1; 3). הסירו את הלסת התחתונה, הלשון והעיניים. חתכו לאורך ההיבטים הצדיים של הגולגולת כדי לשחרר את הרקמה לאורך הבשר השמיעתי החיצוני (איור 1; 4). חתוך כדי להסיר את עודפי העור, השרירים והרקמות המכסות את הגולגולת.
    7. הפרידו את כלוב הצלעות מעמוד השדרה על-ידי חיתוך מקביל לעמוד השדרה באמצעות מספריים חדים (איור 1; 5 ו-6). בצעו חתך קטן באזור המותני התחתון כדי לבודד את עמוד השדרה (איור 1; 7). חתכו והוציאו כל שריר שנותר לאורך עמוד השדרה כדי לחשוף את החוליות (איור 1; 8).
      הערה: הסרת רקמה עודפת מעמוד השדרה ומהגולגולת נחוצה כדי להשיג חדירה נאותה של חיץ הסתיידות פרפורמלדהיד מקובע (PFA) וחומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA).
  2. לאחר קיבוע, הסתיידות ושימור בהקפאה
    1. באמצעות מלקחיים, מקם את המוח עם הגולגולת או עמוד השדרה השלמים בצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 4% PFA. מניחים את הצינורות על 4 ° C לפחות 48 שעות עבור קיבוע נאות.
      הערה: כדי למנוע קיבוע יתר של הרקמה, אין לחרוג מ-72 שעות של קיבוע. זמני הקיבוע מתארכים עבור דגימות עצם לפני ההסתיידות. קיבוע הולם יגן על הרקמה מפני השפעות ההסתיידות ויבטיח מורפולוגיה טובה יותר של הרקמה.
    2. שטוף את המוח או חוט השדרה על ידי הסרת הרקמה מ 4% PFA עם מלקחיים והנחת הרקמה בצינור חד פעמי 14 מ"ל עם 10 מ"ל של 1x PBS במשך 5 דקות. העבר את המוח או חוט השדרה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם 10 מ"ל של 10% EDTA (pH = 7.2-7.4).
      הערה: שימוש בצינור גדול יותר עם 10 מ"ל של EDTA מעניק ל- EDTA אזור מגע גדול יותר עם הרקמה ומאיץ את תהליך ההסתיידות.
    3. בדוק מדי יום אם העצם רכה וגמישה: הסר את הרקמה מתמיסת EDTA עם מלקחיים, הנח אותה על צלחת פטרי, ובדוק בעדינות את רכות העצם עם מחט 25 גרם. אם המחט חודרת בקלות לעצם, תהליך ההסתיידות הושלם.
    4. הסר את הרקמה מתמיסת EDTA והעבר את המוח או חוט השדרה לצינור חד פעמי של 14 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS 1x ושטוף במשך 10 דקות. חזרו על הכביסה.
      הערה: הסתיידות נמשכת בדרך כלל 2-3 ימים. יש להחליף את התמיסה כל 2-3 ימים אם העצם עדיין לא מסוידת כראוי. עם זאת, דגירה ממושכת ב- EDTA לאחר הסרת העצם עלולה לפגוע במורפולוגיה של הרקמה.
    5. הכינו תמיסות סוכרוז 10%, 20% ו-30% על ידי הוספת סוכרוז ל-PBS אחד. לדוגמה, עבור 10% סוכרוז, להוסיף 10 גרם של סוכרוז ולהביא את נפח 100 מ"ל באמצעות סטרילי 1x PBS. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש אחד.
      הערה: תמיסות סוכרוז נוטות לצמיחת מיקרואורגניזמים, ולכן אין לאחסן דגימות לפרקי זמן ממושכים בתמיסות אלה.
    6. הסר את הרקמה מ 1x PBS, מניחים אותו 10 מ"ל של 10% תמיסת סוכרוז ולאחסן אותו ב 4 ° C. תן לרקמה לשבת במשך 24 שעות או עד שהיא שוקעת לתחתית הצינור.
    7. חזור על תהליך זה, העבר את הרקמה לתמיסת 20% סוכרוז תחילה ולבסוף לתמיסת 30% סוכרוז. הניחו לרקמה לשקוע ב-30% סוכרוז (לפחות 24 שעות) והמשיכו להטמעת רקמות.
  3. הטבעה והקפאה של רקמות
    1. בעזרת מלקחיים, הסירו את הרקמה מ-30% הסוכרוז, הניחו אותה על צלחת פטרי והטו את הצלחת כדי להיפטר מעודפי תמיסת סוכרוז על הרקמה. באמצעות אזמל, לחתוך את הרקמה למקטעים הרצויים.
    2. צרו שכבה דקה של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בתחתית הקריומולד והניחו את פיסות הרקמה בתבנית. כסו את הרקמה לחלוטין בתרכובת OCT, וודאו שאין בועות.
    3. הבזק להקפיא את הבלוקים על ידי ריחוף מעל חנקן נוזלי38 או הגדרת הבלוקים על 100% איזופרופנול / קרח יבש slurry39 עד שהבלוק אטום. עטפו את הקריומולד ברדיד אלומיניום ואחסנו את הבלוקים בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך. העבר בלוקים ל- -20°C לפני החיתוך.
      הערה: יש להיזהר בעת חתך וביצוע פרוטוקולים היסטולוגיה על מוחות מסוידים מכיוון ששכבות הגולגולת וקרום המוח עלולות ללכת לאיבוד אם החלקים מטופלים באופן גס.

2. הכנת קרומי המוח ורקמות מערכת העצבים המרכזית לצביעת ציטומטריית זרימה

  1. חילוץ כובע הגולגולת והמוח
    1. בעזרת מספריים חדים, הסירו את הראש באמצעות עריפת ראש (איור 2A; 1). בעזרת מספריים, בצעו חתך בקו האמצע בעור (איור 2A; 2) והפכו את העור מעל העיניים כדי לשחרר את הגולגולת.
    2. הניחו את המספריים בתוך המגנה הקדמית והתחילו לחתוך את הגולגולת לרוחב לאורך קליפת המוח לכיוון פקעת הריח, תוך שמירה על החתכים מעל הבשר השמיעתי החיצוני והלסת התחתונה (איור 2A; 3). בצעו את אותם חתכים בצד הנגדי, כאשר חתכים נפגשים בפקעת הריח כדי לשחרר את כובע הגולגולת מהמוח (איור 2A; 3).
    3. בעזרת מלקחיים, מקלפים בחזרה את כובע הגולגולת ומניחים את מכסה הגולגולת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום סל"ד קר בתוספת HEPES 25 mM. שמור את הצינור על קרח.
    4. בעזרת מלקחיים מעוקלים, הניחו את המלקחיים מתחת לבסיס המוח, והרימו כדי לשחרר את המוח מכיפת הגולגולת. הכניסו את המוח לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של סל"ד קר בתוספת HEPES של 25 mM. שמור את הצינור על קרח עד לעיבוד.
  2. חילוץ עמוד השדרה ורקמת חוט השדרה
    1. באמצעות מלקחיים ומספריים חדים, הפרידו את כלוב הצלעות מעמוד השדרה על-ידי חיתוך במקביל לעמוד השדרה (איור 2A; 4 ו-5). בצעו חתך קטן באזור המותני התחתון כדי לבודד את עמוד השדרה (איור 2A; 6). חתכו והסרו כל שריר שנותר לאורך עמוד השדרה כדי לחשוף את החוליות (איור 2A; 7).
    2. הניחו את המספריים הכירורגיים העדינים במיוחד בתוך עמוד השדרה וחתכו לאורך הקצה הלטרלי של העמוד (איור 2C). חותכים את הקצה הצידי הנגדי לחלוטין כדי לחלק את עמוד השדרה לחלק קדמי ואחורי.
      הערה: חוט השדרה יישאר מחובר לעמוד השדרה.
    3. בעזרת מלקחיים, מקלפים לאט ובזהירות את חוט השדרה מעמוד השדרה ומניחים את הרקמה בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל סל"ד קר עם 25 מ"ל HEPES. העבר את החלקים הקדמיים והאחוריים של עמוד השדרה לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של סל"ד קר עם HEPES 25 mM.
  3. הסרת קרומי המוח להכנת מתלים חד-תאיים
    1. באמצעות מלקחיים, להסיר את מכסה הגולגולת מן המדיה RPMI. באמצעות מלקחיים חדים (#7 מלקחיים; טבלת חומרים), הניקוד סביב הקצה החיצוני של כובע הגולגולת (איור 2B) וקילף את קרומי המוח מקצה כובע הגולגולת, תוך גירוד כדי להסיר את קרומי המוח הדוראליים והארכנואידים. מניחים את קרומי המוח על צלחת פטרי.
      הערה: הסרת קרומי המוח הן מהמוח והן מחוט השדרה דורשת תרגול. אם המשתמש מתקשה לחלץ את קרומי המוח, השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי לסייע בהסרה.
    2. הסר את עמוד השדרה מהצינור. בעזרת מלקחיים חדים, הבקיעו סביב קצוות עמוד השדרה כדי לשחרר את קרומי המוח ולקלף את קרומי המוח מקצה החוליה באמצעות מלקחיים מעוקלים. מניחים את קרומי המוח על צלחת פטרי.
    3. מניחים מסננת רשת ניילון בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. העבר את קרומי המוח לתוך המסננת והוסף 3 מ"ל של RPMI בתוספת HEPES 25 mM. באמצעות הבוכנה ממזרק 5 מ"ל, לטחון את הרקמה ואת המדיה דרך המסננת.
    4. באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, שטפו את המסננת עם 2 עד 3 מ"ל נוספים של מדיה RPMI/HEPES עד שכל הרקמה הנראית לעין עברה דרך המסננת.
      הערה: כדי להשיג מספרי תאים מתאימים לניתוח ציטומטרי של זרימה, ייתכן שיהיה צורך לאגד יחד קרומי מוח מבעלי חיים מרובים. בניסוי הזה (איור 3 ואיור 4), קרומי המוח וחוט השדרה של 4-5 עכברים אוגדו יחד. אם הדגימות מאוגרות, תידרש מדיה נוספת כדי לטחון את הרקמה דרך מסננת רשת הניילון כדי למנוע התחממות יתר של הרקמה.
    5. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, מעבירים את התאים והמדיה לצינור חרוטי טרי של 15 מ"ל. באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל, לשטוף את הצינור החרוטי 50 מ"ל עם 5 מ"ל של מדיה כדי לאסוף את כל התאים הנותרים. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי pellet את התאים.
    6. באמצעות פיפטה פסטר עם ואקום, שואפים שהסופרנאטנט נזהר להימנע מכדורית התא ולהשהות מחדש את התאים בנפח ובחיץ מתאימים.
    7. כדי לספור את המתלה החד-תאי, דללו נפח קטן של התאים (כלומר, 5-10 μL) באמצעות צבע הרחקה כחול טריפאן (דילול 1:10) ו-RPMI. הוסף 10 μL של דילול hemocytometer.
    8. ספור את התאים כפי שתואר קודם לכן40,41, בממוצע לפחות שתי רשתות מרובעות של 16 לדיוק.
      הערה: באיור 3, לדוגמה, תאים מכופפים מאוגמים מקרומי המוח הושעו מחדש במאגר של 250 מיקרוליטר של מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) (1x PBS עם 1% FBS) לצורך צביעה במורד הזרם. התאים דוללו ביחס של 1:10 לצורך ספירה (5 תאי מיקרוליטר, 5 מיקרוליטר טריפאן כחול, 40 מיקרוליטר סל"ד). דילול זה הניב בין 50-100 תאים לכל 16 רשתות מרובעות, מה שהבטיח ספירת תאים מדויקת יותר מכיוון שהתאים אינם צפופים וחופפים מדי או דלילים מדי. ספירת תאים גרעיניים ממאוגדים של קרומי המוח וחוט השדרה לכל עכבר הייתה כדלקמן: עבור קרומי המוח מעכברים לטיפול בדמה = 100,000-150,000 תאים ועבור קרומי המוח ממחלת הדמיאלינציה הנגרמת על ידי וירוס Murine Encephalomyelitis של טיילר (TMEV-IDD) = 300,000-350,000 תאים. ספירת התאים תשתנה בהתאם לדיוק האיסוף, העיבוד, ואם קיימת דלקת קרום המוח.
    9. המשך לטכניקה הרצויה של תא בודד כגון משטח FACS (איור 3)14,36,42,43,44, פרוטוקולי צביעה תוך-תאיים 33,45, גירוי חוץ גופי, מבחני תרבית תאים 33,46,47, בדיקת ELISPOT 28,34,35, ותא בתפזורת או תא בודד תמלילים37,48.
      הערה: יש לשמור את כל הצינורות על קרח בין שלבי העיבוד.
  4. הכנת תרחיפים חד-תאיים של רקמת המוח וחוט השדרה
    1. העבר את רקמת המוח או חוט השדרה עם מדיה לחלק העליון של צלחת פטרי 100 מ"מ על ידי יציקת הרקמה והמדיה מהצינור. בעזרת מלקחיים, להזיז את הרקמה לתחתית צלחת פטרי. לטחון דק את המוח או חוט השדרה עם סכין גילוח סטרילי. בעזרת סכין הגילוח, הזיזו את הרקמה הטחונה לתחתית הצלחת על ידי גירוד כדי לאסוף את הרקמה.
      הערה: עבור פרוטוקול העיכול האנזימטי להלן, ניתן לאחד עד שני חוטי שדרה יחד לצורך עיבוד. המוח צריך להיות מעובד בנפרד.
    2. באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל, להוסיף 3 מ"ל של RPMI בתוספת 10% סרום עגל עוברי (FCS) לצלחת פטרי. באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל, פיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את הרקמה בתקשורת ולהעביר לצינור חרוטי 15 מ"ל.
      הערה: אם היישום במורד הזרם הוא ניתוח ריצוף RNA חד-תאי או בתפזורת או תרבית תאים, יש לבדוק את מגרשי FCS כדי להבטיח שהתאים אינם מופעלים לפני הניתוח. לחלופין, ניתן לעבד תאים באמצעות 1x PBS עם 0.04% BSA במקום RPMI עם 10% FCS.
    3. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, שטפו את צלחת הפטרי עם 2 מ"ל נוספים של מדיה כדי לאסוף כל רקמה שיורית ולהעביר לצינור חרוטי לנפח כולל של 5 מ"ל. שמור את הצינורות על קרח בין שלבי העיבוד.
    4. בעזרת פיפטה, מרחפים מחדש את אבקת הקולגנאז I במצע תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) כדי להשיג את הריכוז הרצוי (כלומר, 100 מ"ג/מ"ל). הוסף collagenase סוג I לצינור החרוטי המכיל את דגימת הרקמה הטחונה כדי לקבל את הריכוז הסופי הרצוי (כלומר, 50 μL עבור 1 מ"ג / מ"ל).
      הערה: ריכוזים גבוהים יותר של collagenase יגדילו את תפוקת התאים, אך עלולים לבקע את פני השטח של התא. לכן, collagenase I הרבה צריך להיות titrated כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי הדרוש כדי להשיג את המספר הגבוה ביותר של תאים קיימא עם כל הסמנים הדרושים פני התא שלם. לדוגמה, collagenase נבדקתי בריכוזים סופיים של 0.5 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל ו-2 מ"ג/מ"ל על דגימות מוח או חוט שדרה בודדות. כדאיות התא נקבעה באמצעות שיטת ההרחקה הכחולה של טריפאן וסמני פני התא CD45, CD19 ו- CD4 הוערכו על ידי ציטומטריית זרימה. ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל של collagenase I הניב את ספירת התאים החיים הגבוהה ביותר תוך שמירה על כל הסמנים המעניינים את פני השטח של התא. לפיכך, ריכוז זה שימש לניסויים נוספים שבחנו סוגי תאים אלה.
    5. יש להשהות בעדינות את אבקת DNase I באמצעות נתרן כלורי במינון 0.15M לריכוז הרצוי. הוסף את DNase I המרחף מחדש לצינור החרוטי המכיל את דגימת הרקמה הטחונה כדי לקבל ריכוז סופי של 20 U/mL.
      הערה: מגרשי DNase I משתנים לפי יחידות פעילות למ"ל. הריכוז שיתווסף לדגימת הרקמה ישתנה בהתאם ליחידות הפעילות של בקבוקון המלאי למיליליטר. הריכוז הרצוי הסופי לדגימה הוא 20 U/mL.
    6. הניחו את הצינורות במדף צינורות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ודגרו במשך 40 דקות. הפוך את הצינורות כל 15 דקות כדי לערבב היטב את הרקמה עם האנזימים. לאחר הדגירה, יש להוסיף 500 μL של 0.1 M EDTA (pH = 7.2) לכל צינור לקבלת ריכוז סופי של 0.01 M EDTA ולדגור במשך 5 דקות נוספות כדי להשבית את הקולגנאז.
    7. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף 9 מ"ל של RPMI בתוספת 10% FCS לכל צינור כדי להביא את נפח כל צינור ל~ 14.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בעזרת פיפטת פסטר עם ואקום, שואפים שהסופרנאטנט נזהר שלא לגעת בכדורית התא.
    8. באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, הוסף 3 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית של 100% לצינור המכיל את גלולת התא. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף מדיה נוספת של RPMI 10% FCS כדי להביא את הנפח הסופי ל -10 מ"ל והשהה מחדש את גלולת התא כדי ליצור שכבת תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית של 30%.
      הערה: הכן מראש את מדיום שיפוע הצפיפות האיזוטונית של 100% במלאי, ALIQUOT ואחסן ב- 4 °C למשך עד 3 חודשים. כדי להכין את תמיסת שיפוע הצפיפות האיזוטונית של 100%, דלל את מדיית שיפוע הצפיפות (טבלה של חומרים) באמצעות מאגר דילול מדיה של שיפוע צפיפות. הכן את מאגר דילול המדיה של שיפוע הצפיפות (80.0 גרם/ליטר NaCl, 3.0 גרם/ליטר KCl; 0.73 גרם/ליטר Na 2 HP0 4, 0.20 גרם/ליטר KH2HP04; 20.0 גרם/ליטרגלוקוז) וסנן סטריליזציה באמצעות מערכת מסנני ואקום. הפוך את תמיסת שיפוע הצפיפות האיזוטונית של 100% על ידי ערבוב חלק אחד של מאגר דילול שיפוע צפיפות ומדיית שיפוע צפיפות של 9 חלקים. מערבבים היטב.
    9. הפוך וערבב היטב כל צינור לפני הוספת שכבת השיפוע של שיפוע צפיפות איזוטונית של 70% מלאי. הכנס פיפטה סרולוגית 1 מ"ל המכילה 1 מ"ל של 70% תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית לתחתית הצינור. לאט לאט מתחת 1 מ"ל של הפתרון, נזהר לא לעשות בועות. לאט להסיר את הצינור הסרולוגי מן הצינור, נזהר לא להפריע שיפוע.
      הערה: עבור השכבה התחתונה של 70%, יש לדלל את תמיסת שיפוע הצפיפות האיזוטונית של 100% מלאי ל- 70% באמצעות מדיית RPMI (כלומר, 7 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית של 100% מלאי ו- 3 מ"ל של מדיית RPMI מעורבבת היטב). בנוסף, יצירת שכבה תחתונה נקייה ללא הפרעות של 70% חיונית לסילוק פסולת מיאלין ולקבלת מתלים טהורים של תא בודד בממשק השיפוע לאחר הצנטריפוגה.
    10. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C ללא בלם. שאפו את הסופרנטנט, כולל שכבת פסולת המיאלין עד שנשאר 2-3 מ"ל בצינור, תוך זהירות שלא להפריע לשכבת התא. קצרו את שכבת התא בין שיפוע הצפיפות של 30/70% באמצעות פיפטה של 1 מ"ל והעבירו לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל.
    11. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף מדיה RPMI 10% FCS כדי להביא את הנפח הסופי ל -15 מ"ל. צנטריפוגה 450 x גרם למשך 5 דקות ב 4 °C.
      הערה: במהלך שלב זה, ניתן לאגד שכבות תאים משני צינורות במידת הצורך. אין לאגור יותר משני צינורות, אחרת התאים לא ייפלטו בשל ריכוז מדיה הדרגתית בצפיפות גבוהה.
    12. שאפו את הסופרנאטנט בזהירות שלא להפריע לכדורית התא. השהה מחדש את התאים בנפח/מאגר מתאים כדי לספור את התאים באמצעות המוציטומטר (לדוגמה, השהה מחדש חוט שדרה יחיד במאגר FACS של 250 מיקרוליטר עבור צביעת פני השטח במורד הזרם) (איור 3).
    13. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, העבירו את מתלי התאים לחלק העליון של צינור המסנן העליון (רשימת חומרים) ואפשרו לתאים לסנן לתחתית הצינור כדי להסיר את שאריות המיאלין שנותרו.
    14. באמצעות צבע הרחקה כחול טריפאן, לדלל ולספור את התאים על המוציטומטר על ידי ממוצע של לפחות שתי רשתות מרובעות 16 לדיוק40,41.
    15. המשך עם טכניקת ניתוח התא הבודד הרצויה.
      הערה: ניתן לבודד ביעילות באמצעות צורות שונות של קולגנאז (כלומר, D, סוג I, סוג II, סוג IV), תאי חיסון, מיקרוגליה (איור 3), אסטרוציטים, פריציטים, תאי אנדותל49 ותאי עצב50 . ספירות תאים גרעיניים שהתקבלו עבור התוצאות היו כדלקמן באמצעות האנזים collagenase I titrated: מוח שלם שטופל בדמה = 500,000-600,000 תאים; מוח TMEV-IDD שלם = 800,000-1,000,000 תאים; חוט שדרה שלם שעבר טיפול דמה = 150,000-200,000 תאים; חוט שדרה שלם TMEV-IDD = 300,000-400,000. ספירת התאים תשתנה בהתאם לדיוק האיסוף, העיבוד והאם קיימת דלקת במערכת העצבים המרכזית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניסוי מייצג זה נועד לכמת תאי B ו-T ולתאר לוקליזציה של תאי B ו-T בתאי מערכת העצבים המרכזית של קרום המוח ופרנכימליה בתנאים הומיאוסטטיים וכן במודל מורין פרוגרסיבי של טרשת נפוצה (כלומר, TMEV-IDD). TMEV-IDD נגרם בעכברות SJL בנות 5 שבועות על ידי זיהום תוך גולגולתי עם 5 x 106 יחידות יוצרות פלאק (PFU) של TMEV BeAn כפי שתואר קודם לכן29.

המחקר הנוכחי העריך תאי B ו- T בקרומי המוח, במוח ובחוט השדרה במהלך TMEV-IDD כרוני ביום 120 לאחר ההדבקה. עכברים שטופלו בדמה תואמי גיל שימשו כקבוצת ביקורת. המחקר כלל שני ניסויים. הראשון התמקד בהשגת תרחיפים חד-תאיים להערכה ציטומטרית של זרימה, טכניקה מבוססת היטב לניתוח וכימות הרכב התא על ידי הערכת פני התא ו/או אנטיגנים תוך-תאיים (n = 4 מטופלים בדמה; n = 5 TMEV-IDD). הניסוי השני התמקד בתיאור לוקליזציה של תאי B ו-T בתא CNS על ידי שימוש באימונוהיסטוכימיה על רקמות מוח וחוט שדרה שעברו הסתיידות (n = 3 שטופלו בדמה; n = 8 TMEV-IDD).

בעקבות בידוד של תרחיפים חד-תאיים מהמוח, חוט השדרה וקרומי המוח המשולבים (מוח וחוט שדרה) מעכברים TMEV-IDD ועכברים שטופלו בדמה, הוחל פרוטוקול צביעת פני השטח על כל הדגימות. בקצרה, מתלים חד-תאיים הודגרו עם כתם אי הרחקת כדאיות הניתן לתיקון (780) למשך 15 דקות, נשטפו, נחסמו בבלוק Fc בנוכחות נסיוב עכבר למשך 15 דקות, והוכתמו בנוגדנים מצומדים לסמני פני התא, כולל CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3; PE-CF594), ו-CD4 (GK1.5; PE) למשך 30 דקות כפי שתואר קודם לכן28,29. התאים נשטפו ונותחו באמצעות ציטומטר זרימה28,29. בדיקת הכדאיות בוצעה כמתואר לעיל28. ביטוי CD45 הוערך כדי להבחין בין CD45hi peripherally נגזר תאים חיסוניים מסתננים (P1) מ CD45lo microglia (P2) ו CD45 - נוירונים, אסטרוציטים, ו oligodendrocytes במוח וחוט השדרה (P3; איור 3A). בעכברים שטופלו בדמה, מעט תאיCD45 hi היו נוכחים בחוט השדרה וברקמת המוח. בקרומי המוח, אותו חתך gating עבור ביטוי CD45 hi המשמש לנתוני המוח וחוט השדרה יושם לזיהוי תאי חיסוןCD45 hi (P1; איור 3C) ולא לכלול תאים לא חיסוניים הנמצאים בקרומי המוח (כלומר, פיברובלסטים, תאי אנדותל). בעכברים שטופלו בדמה, מעט תאיCD45 hi (<0.1%) היו נוכחים בקרומי המוח. בקרב תאי חיסוןמסוג CD45 hi ברקמות TMEV-IDD CNS, תאי B ותאי CD4 T זוהו על ידי ביטוי פני השטח של CD19 ו-CD4, בהתאמה (איור 3B-D). בכל רקמות TMEV-IDD CNS נצפו אחוזים מוגברים של תאי חיסון מסוג CD45hi בהשוואה לעכברים שטופלו בדמה (איור 4A). במהלך TMEV-IDD כרוני, אחוז תאי B בקרב תאי חיסון מסוג CD45hi במוח ובחוט השדרה היה גבוה יותר בהשוואה לתא קרום המוח (איור 4B).

כדי לזהות את הלוקליזציה של תאי B ותאי T בתוך תא CNS במהלך TMEV-IDD כרוני, מוחות וחוטי שדרה שעברו הסתיידות הוערכו באמצעות אימונוהיסטוכימיה באמצעות פרוטוקול הצביעה שתואר קודם לכן29. קרומי המוח וכלי הדם סומנו באמצעות למינין, רכיב קרום מרתף29,51 ו- ER-TR7, סמן תא רשתית פיברובלסטים52,53. במהלך חילוץ קונבנציונלי של המוח מכיפת הגולגולת, שכבת הפיאה הייתה שלמה, אולם שכבות קרום המוח הנותרות לא נכללו (איור 5A). בחוט השדרה, שחול הידראולי הביא להיעדר כל שכבות קרום המוח (הנתונים לא מוצגים). גם במוחות וגם בחוט השדרה שעברו הסתיידות, כל שכבות קרום המוח היו שלמות (איור 5B). כדי לבחון לוקליזציה של תאי B ו-T ב-TMEV-IDD כרוני, ביטוי IgG שימש לקביעת הלוקליזציה של תאי B 29 בעלי מיתוג איזוטיפ, ו-CD3 שימש להמחשת כל תאי T29. חידוד IgG עם ER-TR7 גילה שתאי IgG+ B עם מיתוג איזוטיפ היו נוכחים בפרנכימה של מערכת העצבים המרכזית ובקרומי המוח (איור 6A). צברים תאיים בתוך קרומי המוח ER-TR7+ הכילו תאי IgG+ B מרובים ותאי CD3+ T (איור 6B).

התוצאות המייצגות מראות אחוזים גבוהים של תאי B ותאי T בתאים פרנכימליים ובתאי קרום המוח בעכברים כרוניים מסוג TMEV-IDD, בניגוד לעכברים שטופלו בדמה תואמת גיל. ניתוח IHC הראה עוד כי ברקמת TMEV-IDD, תאי B ותאי T התפזרו בפרנכימה אך היו קשורים קשר הדוק בקרומי המוח, ויצרו אגרגטים דלקתיים. בחולי טרשת נפוצה מתקדמת, אגרגטים דלקתיים של קרום המוח קשורים לפגיעה ברקמות סמוכות ולתוצאות מחלה גרועות יותר. ב- TMEV-IDD כרוני, נוכחות מתמשכת של תאי B ותאי T בתא CNS וצבירה בקרומי המוח עשויה להיות קשורה לפגיעה ברקמות ולהתקדמות המחלה. נדרשים מחקרים נוספים כדי להבין כיצד דלקת קרום המוח לעומת דלקת פרנכימלית משפיעה על דמיאלינציה, ניוון עצבי ונכות קלינית.

Figure 1
איור 1: בידוד מוחות וחוטי שדרה לצורך הסתיידות. קווים מקווקוים כחולים מציינים חתכים שנעשו כדי לבודד את המוח באמצעות גולגולת שלמה (חתכים 1-4) ועמוד השדרה (חתכים 5-8). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בידוד מוחות, חוטי שדרה וקרומי המוח עבור שיטות של תא יחיד. (A) קווים מקווקוים כחולים מציינים חתכים שנעשו כדי לבודד את כובע הגולגולת עם קרומי המוח והמוח השלמים (חתכים 1-3) ועמוד השדרה (חתכים 5-7). חתך רוחבי 3 נעשה משני צידי הגולגולת. (B) הקו הכחול מציין חתך שנעשה כדי להבקיע ולהסיר את קרומי המוח בכובע הגולגולת ואת החתכים שבוצעו בעמוד השדרה (שני הצדדים הרוחביים) כדי לבודד את חוט השדרה ואת קרומי המוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: זיהוי של CD45היי חודר לתאי מערכת החיסון ברקמות מערכת העצבים המרכזית. (A) אסטרטגיית Gating לזיהוי תאי חיסון חודריםלתאי חיסון חודרים CD45 (P1), CD45lo microglia (P2), ו-CD45 - אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ונוירונים בקרב סך כל התאים החיים בחוט השדרה מעכברים שטופלו בדמה (אדום) או TMEV-IDD (כחול). תאיCD45 HI מינימליים התגלו במוחות ובחוטי השדרה שטופלו בדמה. (B) אסטרטגיית Gating לזיהוי תאי CD19+ B ותאי CD4+ T בקרב תאי חיסון חודריםלתאי חיסון CD45 (P1) בעכברי TMEV-IDD. אסטרטגיות Gating היו דומות עבור רקמת המוח וחוט השדרה. (C) אסטרטגיית Gating לזיהוי תאי CD45hi (P1) בקרומי המוח של עכברים שטופלו בדמה (אדום) וכרוניים TMEV-IDD (כחול). (D) אסטרטגיית Gating לזיהוי תאי CD19+ B ותאי CD4+ T בקרב תאי חיסון חודריםלתאי חיסון CD45 (P1) בקרומי המוח של עכברי TMEV-IDD כרוניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תאי חיסון מסוג CD45hi ותאי CD19+ B גדלו ברקמות מערכת העצבים המרכזית ב-TMEV-IDD כרוני. גרפים עמודות סיכומים של נתוני ציטומטריית זרימה שהתקבלו מקרום המוח שטופלו בדמה או TMEV-IDD, המוח וחוט השדרה מראים אחוזים של CD45היי חודר לתאי מערכת החיסון (A) או אחוזים של תאי CD19+ B (B). עבור רקמות TMEV-IDD, נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו מחמישה עכברים, כאשר חוטי השדרה והמוח עובדו בנפרד, בעוד קרומי המוח אוגמו לניתוח. עבור עכברים שטופלו בדמה, נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו מארבעה עכברים, כאשר חוטי השדרה והמוח עובדו בנפרד, בעוד קרומי המוח אוגמו לניתוח. נתונים עבור חוט השדרה והמוח מוצגים כממוצע ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שכבות שלמות של קרום המוח במוחות ובחוטי השדרה שעברו הסתיידות. (A) מוחות שחולצו מכובע הגולגולת או (B) מוחות מסוידים עם גולגולות שלמות ועמודי חוליות מעכברים כרוניים-TMEV-IDD הוערכו עבור DAPI (כחול), סמני קרום המוח למינין (ירוק) ו-ER-TR7 (אדום). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הצטברות תאי מערכת החיסון ניכרה בקרומי המוח במהלך TMEV-IDD כרוני. (A) עמודי חוליות מסוידים מעכברים כרוניים-TMEV-IDD נבדקו לנוכחות IgG (ירוק) כדי לזהות תאים חיסוניים בעלי מיתוג איזוטיפ בפרנכימה ובקרומי המוח ER-TR7+ (אדום). (B) תאי T CD3+ (ירוק) ותאי B בעלי מיתוג איזוטיפ IgG+ (אדום) עברו ניתוח לקרום המוח ER-TR7+ כדי להעריך לוקליזציה בתוך רקמת חוט השדרה. חיצים לבנים מדגישים תאי B ו-T בתוך קרומי המוח. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. תיבות לבנות תוחמות אזורים שנבחרו לתמונות חתוכות (מימין; סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות להערכת ההרכב התאי בתא CNS במהלך הומאוסטזיס ומחלות חיוניות להבנת המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, למרות שהם משמשים מחסום חשוב במערכת העצבים המרכזית ומאכלסים מערך מגוון של תאים חיסוניים, קרומי המוח מושמטים לעתים קרובות מהניתוח מכיוון ששיטות רבות למיצוי רקמות קונבנציונליות עבור המוח וחוט השדרה אינן מאפשרות איסוף של קרומים אלה. השמטה זו היא מגבלה קריטית בקידום הבנתנו את ההרכב והתפקוד התאי של קרומי המוח ואת תפקידם במצב יציב ובמצבים דלקתיים. מחקרים אחרונים גילו כי הן תאי חיסון מקומיים והן תאים חיסוניים היקפיים השוכנים בתא קרום המוח ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס במערכת העצבים המרכזית, כמו גם בהנעת פתוגנזה של מחלת CNS. מחקרים אלה מדגישים את הצורך לנתח לא רק את התא הפרנכימלי אלא גם את שכבות קרום המוח שמסביב. הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים בידוד מהיר של המוח וחוט השדרה תוך שמירה על קרומי המוח, ובסופו של דבר מאפשרים ניתוח מקיף במורד הזרם של תא CNS תוך שימוש הן במחקרים היסטולוגיים והן במחקרים חד-תאיים. התוצאות המייצגות מתמקדות בהערכת תאי מערכת החיסון בתא מערכת העצבים המרכזית; עם זאת, הפרוטוקולים עשויים להיות מותאמים לניתוח מיקרוגליה, אסטרוציטים, נוירונים, פריציטים, תאי אנדותל, או תאים אחרים המתגוררים במערכת העצבים המרכזית.

שלב קריטי בשיטות המתוארות הוא מיצוי זהיר של הרקמה, חיוני הן לבידוד מתלים חד-תאיים טהורים מהמוח, חוט השדרה וקרומי המוח והן להשגת רקמות CNS עם גולגולות שלמות או עמודי חוליות, המאפשרים מורפולוגיה איכותית של רקמות. תרגול הטכניקה להשגת תרחיפים חד-תאיים הוא המפתח למיצוי רקמות מוצלח מכיוון שהוא לא רק ישפר את טוהר הדגימה, אלא גם ישפר את תפוקת התאים ליישומים במורד הזרם. באופן דומה, תרגול בבידוד רקמות CNS עם גולגולות שלמות או עמודי חוליות כדי להסיר כראוי רקמה עודפת סביב העצם הוא צעד חיוני המבטיח קיבוע טוב יותר, הסתיידות, ושימור בהקפאה של הרקמה, כל המרכיבים החיוניים להשגת קטעי רקמה עם מורפולוגיה באיכות גבוהה ומטרות אנטיגן שלמות.

מגבלה אחת של הפרוטוקול שלנו לבידוד מתלים חד-תאיים מקרומי המוח היא שהוא מתמקד בהשגת קרומי המוח דוראליים וארכנואידים32,54 תוך השמטת הבידוד של PIA, שנשאר מחובר למוח או לחוט השדרה באמצעות תהליכים אסטרוציטים. למרות שהתאים השוכנים ב- pia mater הם מרכיב חיוני בתא קרום המוח, הוחלט להוציא את ה- pia mater במהלך הכנת המתלה החד-תאי בשל משך הזמן הרב הנדרש לבודדו כראוי55. באופן דומה, הפרוטוקול מתמקד רק בהשגת קרומי המוח בחלק העליון של הגולגולת ואינו כולל את בידוד קרומי המוח הפולשים במוח ובמקלעת הכורואידים. איסוף קרומי המוח הפולשים ומקלעת הכורואיד יכול להתבצע על פי פרוטוקוליםשפורסמו בעבר 55, אם כי זהו הליך הגוזל זמן. בשני המקרים הבחירה להשמיט חלק משכבות קרום המוח נבעה ממשך הזמן שנדרש לבידודן. העיתוי של הפרוטוקול המשמש להכנת מתלים חד-תאיים הדרושים ליישומים במורד הזרם כגון ציטומטריית זרימה, בדיקות תרבית תאים וריצוף RNA (RNAseq) הוא קריטי לשיפור כדאיות התא ואיכות הנתונים. לכן, בהתאם לשאלת המחקר הספציפית, יש לאזן בין זמן בידוד הדגימה לבין היסודיות בחילוץ קרומי המוח. בפרוטוקול הנוכחי, מתקבלים רק תכשירי השעיה חד-תאיים מקרומי המוח של הדורה והארכנואיד, מה שמגביל את היכולת להסיק תוצאות לכל קרומי המוח של מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, אם שיטות אלה משמשות בשילוב עם ניתוח IHC או ISH של קטעי רקמות שלמות עם שלוש שכבות של קרומי המוח, ניתן להשיג הבנה מעמיקה יותר של הדינמיקה התאית והמולקולרית בתאים parenchymal ו קרום המוח.

מגבלה נוספת של הפרוטוקול היא מספרי התאים הנמוכים המתקבלים מקרומי המוח הדוראליים והארכנואידים, במיוחד בתנאים הומיאוסטטים. עם זאת, אם מספרי התאים בחוט השדרה, במוח או בקרומי המוח נחשבים נמוכים מדי לניתוח אוכלוסיית תאי יעד מסוימת, ניתן לקבוע את מספר התאים המינימלי הדרוש לניתוח זה על ידי הערכת המספר הכולל של האירועים הדרושים לדיוק נתון (למשל, מקדם שונות של 5%) כפי שתואר בספרות קודמת שהתמחתה בניתוח אירועים נדירים56. חישובים אלה יכולים לשמש כדי לקבוע אם דגימות מבעלי חיים מרובים חייבות להיות מאוגדות על מנת להשיג מספר תאים מספיק כדי לנתח את אוכלוסיית התאים המעניינים.

השיטות המתוארות מספקות התקדמות חיונית בחקירת הדינמיקה התאית בתוך תא CNS על ידי הרחבת הניתוחים כך שיכללו את תא קרום המוח המוזנח בדרך כלל. פרוטוקולים אלה מאפשרים חילוץ אינדיבידואלי של המוח, חוט השדרה וקרומי המוח הדוראליים והארכנואידים כדי ליצור תרחיפים חד-תאיים. בנוסף, פרוטוקול ההסתיידות מאפשר ניתוח היסטולוגי של חלקי רקמה המרכיבים רקמת מוח או חוט שדרה, כולל שלוש שכבות קרום המוח. שימוש ב-EDTA מספק תהליך הסתיידות איטי אך עדין, המתאים ביותר לדגימות שבהן נדרשת מורפולוגיה איכותית של רקמות (למשל, IHC ו-ISH). הפרוטוקול משתמש ב- pH של 7.2-7.4 כדי להאט את קצב ההסתיידות ולהבטיח שמירה על מורפולוגיה שלמה של רקמות, יתרון ברור על פני חומצות חזקות וחלשות (למשל, חומצה הידרוכלורית וחומצה טריכלורואצטית), שיש להן זמן הסתיידות קצר יותר, אך משפיעות על איכות המורפולוגיה של הרקמה.

שיטות עתידיות המבקשות לבודד תרחיפים חד-תאיים מקרומי המוח צריכות להתמקד בפיתוח פרוטוקולים לקיצור הזמן הדרוש לבידוד יסודי של שכבת הפיאל מרקמות CNS וקרומי המוח הפולשים במוח. קבלת המכלול המלא של שלוש שכבות קרום המוח לא רק תגדיל את מספר התאים לכל ניתוח, אלא גם תספק הערכה מקיפה יותר של תאי החיסון המתגוררים והחודרים המאכלסים את קרומי המוח, התוחמים את מערכת העצבים המרכזית. במקביל, פרוטוקולים עתידיים שיתמקדו בהכנת מוחות וחוטי שדרה שעברו הסתיידות צריכים לנסות לזהות סוכנים חדשים שמטרתם לזרז את הסתיידות הרקמה תוך שמירה על איכות המורפולוגיה של הרקמות. עם זאת, בסך הכל, יישומים במורד הזרם המנתחים מתלים חד-תאיים CNS הכוללים קרומי מוח כפולים וארכנואידים, המבוצעים בשילוב עם ניתוח מקיף של חתך רקמות, יכולים לספק הבנה מפורטת של פנוטיפ התא, תפקוד ולוקליזציה בתוך תא CNS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לצוות המרכז לרפואה השוואתית ומחקר (CCMR) בדארטמות' על הטיפול המקצועי שלהם בעכברים ששימשו למחקרים אלה. קרן המחקר ע"ש בורנשטיין מימנה מחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, Pt 10 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, Pt 9 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019).
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 159 קרומי המוח מערכת העצבים המרכזית הסתיידות אימונוהיסטוכימיה תרחיף חד-תאי תאי מערכת החיסון עכברים
בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, … More

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter