Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av vävnader i centrala nervsystemet och tillhörande hjärnhinnor för nedströmsanalys av immunceller

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

Denna artikel presenterar två optimerade protokoll för att undersöka immunceller i centrala nervsystemet, inklusive hjärnan, ryggmärgen och hjärnhinnorna. Vart och ett av dessa protokoll hjälper till att fastställa funktionen och sammansättningen av cellerna som upptar dessa fack under steady state och inflammatoriska förhållanden.

Abstract

Det centrala nervsystemet (CNS) består av hjärnan och ryggmärgen och omges av hjärnhinnorna, membranösa lager som fungerar som en barriär mellan periferin och CNS. CNS är en immunologiskt specialiserad plats, och vid steady state-förhållanden är immunprivilegiet tydligast i CNS-parenkymet. Däremot hyser hjärnhinnorna ett varierat utbud av inhemska celler, inklusive medfödda och adaptiva immunceller. Under inflammatoriska tillstånd som utlöses av CNS-skada, autoimmunitet, infektion eller till och med neurodegeneration kan perifert härledda immunceller komma in i parenkymet och bosätta sig i hjärnhinnorna. Dessa celler tros utföra både fördelaktiga och skadliga åtgärder under CNS-sjukdomspatogenesen. Trots denna kunskap förbises ofta hjärnhinnorna vid analys av CNS-kompartmentet, eftersom konventionella CNS-vävnadsextraktionsmetoder utelämnar meningealskikten. Detta protokoll presenterar två distinkta metoder för snabb isolering av murina CNS-vävnader (dvs. hjärna, ryggmärg och hjärnhinnor) som är lämpliga för nedströmsanalys via encellstekniker, immunhistokemi och in situ-hybridiseringsmetoder. De beskrivna metoderna ger en omfattande analys av CNS-vävnader, idealisk för att bedöma fenotypen, funktionen och lokaliseringen av celler som upptar CNS-facket under homeostatiska förhållanden och under sjukdomspatogenes.

Introduction

Det centrala nervsystemet (CNS) är ett immunologiskt specialiserat ställe. CNS-parenkymet, exklusive CSF-utrymmet, hjärnhinnorna och kärlen, ses klassiskt som en immunprivilegierad plats 1,2,3,4,5 och är relativt tom på immunceller under homeostatiska förhållanden 2,6,7. Däremot är hjärnhinnorna, som består av dura-, araknoid- och piaskikten, viktiga komponenter i CNS-facket, som aktivt deltar i homeostatisk immunövervakning och inflammatoriska processer under sjukdomspatogenes 3,6,7,8. Under stabila förhållanden stöder hjärnhinnorna många immunportvaktsceller, inklusive medfödda lymfoida celler (ILC), makrofager, dendritiska celler (DC), mastceller, T-celler och i mindre utsträckning B-celler 9,10,11.

Hjärnhinnorna är mycket vaskulariserade strukturer och innehåller lymfkärl som ger en lymfatisk förbindelse mellan CNS och dess periferi 8,12,13,14. Vid inflammatoriska tillstånd som induceras av CNS-skada, infektioner, autoimmunitet eller till och med neurodegeneration, infiltrerar perifert härledda immunceller parenkymet och förändrar immunlandskapet i hjärnhinnorna. Efter cellinfiltration kan hjärnhinnorna utgöra en funktionell nisch för perifert härledda immunceller, vilket främjar aggregering av immunceller, aktivering av lokala immunceller och långsiktig överlevnad i CNS-kompartmentet. Framträdande hjärnhinneinflammation observeras vid flera sjukdomar som påverkar CNS, inklusive multipel skleros (MS)15,16,17,18,19, stroke 20,21, steril skada 22,23 (dvs. ryggmärgsskada och traumatisk hjärnskada), migrän 24 och mikrobiell infektion 25,26,27,28,29. Således är karakteriseringen av residenta celler och perifert härledda immunceller i meningealfacket avgörande för att förstå dessa cellers roll under steady state-förhållanden och sjukdomspatogenes.

Extraktionen av hjärnan, ryggmärgen och hjärnhinnorna från kraniet och kotkropparna är tekniskt utmanande och tidskrävande. Det finns för närvarande inga tillgängliga tekniker för snabb extraktion av hjärnan med alla tre hjärnhinnorna intakta. Även om laminektomi ger utmärkt morfologi i ryggmärgsvävnaden och bevarar hjärnhinnelagren, är det både extremt tidskrävande och komplicerat30,31. Omvänt underlättar mer konventionella extraktionsmetoder som avlägsnande av hjärnan från kraniet och hydraulisk extrudering av ryggmärgen en snabb extraktion av CNS-vävnaden, men både araknoidal- och duralhjärnhinnorna går förlorade med dessa tekniker30,31. Utelämnandet av dura- och araknoidalskikt under konventionell isolering av hjärn- och ryggmärgsvävnader resulterar i en ofullständig analys av cellerna i CNS-facket. Således är identifieringen av nya tekniker med fokus på snabb extraktion av CNS-vävnader med intakta hjärnhinnor avgörande för optimal analys av CNS-kompartmentet.

Detta manuskript presenterar två metoder för snabb extraktion av hjärna, ryggmärg och hjärnhinnor från möss, vilket underlättar nedströmsanalys av inhemska celler och perifert härledda immunceller i CNS-parenkymet och hjärnhinnorna. Dessa optimerade protokoll fokuserar på att 1) isolera encellssuspensioner för nedströmsanalys och 2) förbereda vävnad för histologisk bearbetning. Genom att erhålla encellssuspensioner från hjärnan, ryggmärgsvävnaden och dural- och araknoidalhinnorna32 kan man samtidigt analysera celler som finns i både parenkymala och meningeala fack. Encellssuspensioner kan användas i olika tillämpningar, inklusive cellodlingsanalyser för att utföra in vitro-stimulering 33, enzymkopplad immunospot (ELISpot)28,34,35, flödescytometri 36,33 och encells-37 eller bulktranskriptomik. Dessutom möjliggör det optimerade protokollet för avkalkning av hela hjärnor och ryggmärg med intakta skallar respektive ryggrader en skonsam avkalkning av det omgivande benet, vilket lämnar hjärnhinnorna intakta och bevarar vävnadsmorfologin. Denna metod möjliggör selektiv identifiering av proteiner eller RNA med hjälp av immunhistokemi (IHC) eller in situ hybridiseringstekniker (ISH) inom både parenkymala och meningeala utrymmen. Karakteriseringen av fenotypen, aktiveringstillståndet och lokaliseringen av residenta celler och perifert härledda immunceller inom CNS kan ge information som är väsentlig för att förstå hur enskilda celltyper i CNS-facket bidrar till homeostas och sjukdomspatogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Allt djurarbete använder protokoll som granskats och godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Geisel School of Medicine i Dartmouth.

1. Bearbetning av hjärn- och ryggmärgsprover för avkalkning

  1. Isolering av hjärn- och ryggmärgsprover
    1. Avliva musen via CO2 -inandning. Se till att CO2 -flödet förskjuter 10%–30% av burvolymen per minut.
    2. Använd en pincett, lyft xiphoid-processen och klipp bukväggen i sidled strax under bröstkorgen med en sax, dra uppåt för att undvika att skära av underliggande blodkärl eller organ. Skär genom membranet i sidled.
    3. Skär bröstkorgen längs sidokanterna parallellt med lungorna upp till nyckelbenet. Använd en pincett, lyft bröstbenet och kläm fast bröstbenet med en hemostat. Placera hemostaten över huvudet för att lyfta bort bröstkorgen och exponera hjärtat.
    4. Använd en pincett, ta tag i hjärtat nära dess topp och gör ett snitt i hjärtats högra förmak för att ge ett utlopp. Sätt in en 25 G nål med en 10 ml spruta fäst för att långsamt administrera 10 ml iskall 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i vänster kammare för att transkardiellt perfusionera musen.
      OBS: Perfusion bör ske under 4–5 minuter tills levern är tömd på blod. Totalt 10 ml 1x PBS räcker vanligtvis för perfusion, men mer kan användas vid behov. En ren lever indikerar vanligtvis tillräcklig perfusion.
    5. Använd en vass sax och ta bort huvudet genom halshuggning (Figur 1; 1). Gör ett snitt i mitten av huden (Figur 1; 2) och vänd huden över ögonen för att frigöra skallen.
    6. Skär i näsbenet för att frigöra underkäken från skallen (Figur 1; 3). Ta bort underkäken, tungan och ögonen. Skär längs de laterala aspekterna av skallen för att frigöra vävnaden längs den yttre hörselgången (Figur 1; 4). Trimma för att ta bort all överflödig hud, muskler och vävnad som ligger ovanpå skallen.
    7. Separera bröstkorgen från ryggraden genom att klippa parallellt med ryggraden med en vass sax (Figur 1; 5 och 6). Gör ett litet snitt i nedre ländryggen för att isolera ryggraden (Figur 1; 7). Trimma och ta bort eventuella kvarvarande muskler längs ryggraden för att exponera kotorna (Figur 1; 8).
      OBS: Det är nödvändigt att ta bort överflödig vävnad från ryggraden och skallen för att få tillräcklig penetration av fixativ paraformaldehyd (PFA) och etylendiamintetraättiksyra (EDTA) avkalkningsbuffert.
  2. Efterfixering, avkalkning och kryokonservering
    1. Använd en pincett och placera hjärnan med den intakta skallen eller ryggraden i ett 15 ml koniskt rör som innehåller 10 ml 4 % PFA. Placera rören vid 4 °C i minst 48 timmar för adekvat fixering.
      OBS: För att undvika överfixering av vävnaden, överskrid inte 72 timmars fixering. Fixeringstiderna förlängs för benprover före avkalkning. Adekvat fixering skyddar vävnaden från effekterna av avkalkningen och säkerställer bättre vävnadsmorfologi.
    2. Skölj hjärnan eller ryggmärgen genom att ta bort vävnaden från 4% PFA med pincett och placera vävnaden i en engångstub på 14 ml med 10 ml 1x PBS i 5 min. Överför hjärnan eller ryggmärgen till ett 50 ml koniskt rör med 10 ml 10 % EDTA (pH = 7,2–7,4).
      OBS: Att använda ett större rör med 10 ml EDTA ger EDTA en större kontaktyta med vävnaden och påskyndar avkalkningsprocessen.
    3. Kontrollera dagligen om benet är mjukt och smidigt: ta bort vävnaden från EDTA-lösningen med en pincett, lägg den på en petriskål och testa försiktigt benets mjukhet med en 25 G nål. Om nålen lätt tränger in i benet är avkalkningsprocessen klar.
    4. Ta bort vävnaden från EDTA-lösningen och överför hjärnan eller ryggmärgen till en 14 ml engångsslang som innehåller 10 ml 1x PBS och tvätta i 10 minuter. Upprepa tvätten.
      OBS: Avkalkning tar vanligtvis 2–3 dagar. Lösningen bör bytas var 2–3:e dag om benet ännu inte är tillräckligt avkalkat. Långvarig inkubation i EDTA efter att benet har avkalkats kan dock skada vävnadens morfologi.
    5. Förbered 10 %, 20 % och 30 % sackaroslösningar genom att tillsätta sackaros till 1x PBS. Till exempel, för 10 % sackaros, tillsätt 10 g sackaros och höj volymen till 100 ml med steril 1x PBS. Förvara lösningen vid 4 °C i upp till 1 månad.
      OBS: Sackaroslösningar är benägna att växa mikroorganismer, så samples bör inte förvaras under längre perioder i dessa lösningar.
    6. Ta bort vävnaden från 1x PBS, lägg den i 10 ml 10 % sackaroslösning och förvara den vid 4 °C. Låt näsduken sitta i 24 timmar eller tills den sjunker till botten av röret.
    7. Upprepa denna process och flytta vävnaden till en 20 % sackaroslösning först och slutligen till en 30 % sackaroslösning. Låt vävnaden sjunka i 30 % sackaros (minst 24 timmar) och fortsätt till vävnadsinbäddning.
  3. Inbäddning och frysning av vävnad
    1. Använd en pincett, ta bort vävnaden från 30 % sackaros, placera den på en petriskål och luta skålen för att bli av med överflödig sackaroslösning på vävnaden. Använd en skalpell och skär vävnaden i önskade segment.
    2. Skapa ett tunt lager av optimal skärtemperatur (OCT) i botten av kryomolden och placera vävnadsbitarna i formen. Täck vävnaden helt med OCT-föreningen och se till att det inte finns några bubblor.
    3. Snabbfrys blocken genom att hovra över flytande kväve38 eller ställa blocken på en 100 % isopropanol/torrisuppslamning39 tills blocket är ogenomskinligt. Slå in kryomolderna i aluminiumfolie och förvara blocken vid -80 °C för långtidsförvaring. Flytta blocken till -20 °C före sektionering.
      OBS: Försiktighet måste iakttas vid snittning och histologiprotokoll på avkalkade hjärnor eftersom skall- och hjärnhinneskikten kan gå förlorade om snitten hanteras grovt.

2. Beredning av hjärnhinnor och CNS-vävnader för färgning av flödescytometri

  1. Extrahera kalotten och hjärnan
    1. Använd en vass sax för att ta bort huvudet genom halshuggning (Figur 2A; 1). Använd en sax för att göra ett snitt i mitten av huden (Figur 2A; 2) och vänd huden över ögonen för att frigöra skallen.
    2. Placera saxen i foramen magna och börja klippa skallen lateralt längs hjärnbarken mot luktbulben, håll snitten ovanför den yttre hörselgången och underkäken (Figur 2A; 3). Utför samma snitt på motsatt sida, med snitt som möts vid luktbulben för att frigöra skallskålen från hjärnan (Figur 2A; 3).
    3. Använd en pincett, dra tillbaka dödskallelocket och placera skalllocket i ett 15 ml koniskt rör som innehåller 5 ml kallt RPMI-medium kompletterat med 25 mM HEPES. Håll röret på is.
    4. Använd en böjd pincett, placera pincetten under hjärnans bas och lyft för att frigöra hjärnan från skalllocket. Placera hjärnan i ett 15 ml koniskt rör som innehåller 5 ml kall RPMI kompletterat med 25 mM HEPES. Håll röret på is tills bearbetning.
  2. Extraktion av ryggraden och ryggmärgsvävnaden
    1. Använd en pincett och en vass sax för att separera bröstkorgen från ryggraden genom att klippa parallellt med ryggraden (Figur 2A; 4 och 5). Gör ett litet snitt i nedre ländryggen för att isolera ryggraden (Figur 2A; 6). Trimma och ta bort eventuella kvarvarande muskler längs ryggraden för att exponera kotorna (Figur 2A; 7).
    2. Placera den extra fina kirurgiska saxen i ryggraden och klipp längs kolonnens sidokant (Figur 2C). Skär den motsatta sidokanten helt för att dela kotpelaren i en främre och bakre del.
      OBS: Ryggmärgen kommer att förbli fäst vid ryggraden.
    3. Använd en pincett, dra långsamt och försiktigt bort ryggmärgen från ryggraden och placera vävnaden i ett 15 ml koniskt rör som innehåller 5 ml kall RPMI med 25 mM HEPES. Överför de främre och bakre delarna av ryggraden till en 15 ml konisk slang som innehåller 5 ml kall RPMI med 25 mM HEPES.
  3. Avlägsnande av hjärnhinnorna för att bereda encellssuspensioner
    1. Ta bort dödskallelocket från RPMI-mediet med en pincett. Använda vass pincett (#7 pincett; Materialförteckning), skåra runt den yttre kanten av skallskålen (figur 2B) och dra bort hjärnhinnorna från kanten av skallskålen, skrapa för att avlägsna dural- och araknoidalhinnorna. Lägg hjärnhinnorna på en petriskål.
      OBS: Avlägsnande av hjärnhinnorna från både hjärnan och ryggmärgen kräver övning. Om användaren upplever svårigheter att extrahera hjärnhinnorna, använd ett dissekerande mikroskop för att hjälpa till med borttagningen.
    2. Ta bort ryggraden från röret. Använd en vass pincett, skåra runt kanterna på ryggraden för att frigöra hjärnhinnorna och dra bort hjärnhinnorna från kanten av kotan med hjälp av en böjd pincett. Lägg hjärnhinnorna på en petriskål.
    3. Placera en nylonnätsil i ett 50 ml koniskt rör. Flytta hjärnhinnorna till silen och tillsätt 3 ml RPMI kompletterat med 25 mM HEPES. Använd kolven från en 5 ml spruta och mal vävnaden och mediet genom silen.
    4. Använd en 5 ml serologisk pipett och tvätta silen med ytterligare 2 till 3 ml RPMI/HEPES-media tills all synlig vävnad har passerat genom silen.
      OBS: För att erhålla adekvata celltal för flödescytometrisk analys kan hjärnhinnor från flera djur behöva poolas tillsammans. I detta experiment (Figur 3 och Figur 4) slogs hjärn- och ryggmärgshjärnhinnorna från 4–5 möss samman. Om proverna poolas kommer ytterligare media att krävas för att slipa vävnaden genom nylonnätsilen för att förhindra överhettning av vävnaden.
    5. Använd en 10 ml serologisk pipett och överför cellerna och mediet till ett nytt 15 ml koniskt rör. Använd en 10 ml serologisk pipett och tvätta det 50 ml koniska röret med 5 ml media för att samla upp eventuella kvarvarande celler. Centrifugera vid 450 x g i 5 minuter vid 4 °C för att pelletera cellerna.
    6. Använd en Pasteur-pipett med vakuum, aspirera supernatanten och var noga med att undvika cellpelleten och återsuspendera cellerna i lämplig volym och buffert.
    7. För att räkna encellssuspensionen, späd en liten volym av cellerna (dvs. 5–10 μL) med trypanblått uteslutningsfärgämne (1:10 utspädning) och RPMI. Tillsätt 10 μl av spädningen till hemocytometern.
    8. Räkna cellerna som tidigare beskrivits40,41, med ett genomsnitt av minst två 16 kvadratiska rutnät för noggrannhet.
      OBS: I figur 3, till exempel, återsuspenderades poolade, pelleterade celler från hjärnhinnorna i 250 μL fluorescensaktiverad cellsorteringsbuffert (FACS) (1x PBS med 1 % FBS) för nedströms ytfärgning. Cellerna späddes 1:10 för räkning (5 μL celler, 5 μL trypanblått, 40 μL RPMI). Denna utspädning gav mellan 50–100 celler per 16 kvadratiska rutnät, vilket säkerställer en mer exakt cellräkning eftersom cellerna varken är för täta och överlappande eller för glesa. Antalet kärnförsedda celler från poolade hjärn- och ryggmärgshjärnhinnor per mus var följande: För hjärnhinnor från möss med skenbehandling = 100 000–150 000 celler och för hjärnhinnor från möss med murint encefalomyelitvirusinducerad demyeliniserande sjukdom (TMEV-IDD) = 300 000–350 000 celler. Cellantalet kommer att variera beroende på precisionen i insamlingen, bearbetningen och om meningeal inflammation är närvarande.
    9. Fortsätt till önskad encellsteknik, t.ex. en FACS-yta (figur 3)14,36,42,43,44, intracellulära färgningsprotokoll 33,45, in vitro-stimulering, cellodlingsanalyser 33,46,47, ELISPOT-analys 28,34,35 och bulk- eller encelliga transkriptomik37,48.
      OBS: Håll alla rör på is mellan bearbetningsstegen.
  4. Beredning av encellssuspensioner av hjärn- och ryggmärgsvävnad
    1. Överför hjärn- eller ryggmärgsvävnaden med media till toppen av 100 mm petriskålen genom att hälla vävnaden och mediet från röret. Använd en pincett och flytta vävnaden till botten av petriskålen. Finhacka hjärnan eller ryggmärgen med ett sterilt rakblad. Använd rakbladet och flytta den malda vävnaden till botten av plattan genom att skrapa för att samla ihop vävnaden.
      OBS: För det enzymatiska matsmältningsprotokollet nedan kan upp till två ryggmärgar slås samman för bearbetning. Hjärnor bör bearbetas individuellt.
    2. Använd en 5 ml serologisk pipett och tillsätt 3 ml RPMI kompletterat med 10 % fetalt kalvserum (FCS) till petriskålen. Använd en 10 ml serologisk pipett, pipettera upp och ner för att återsuspendera vävnaden i mediet och överför till ett 15 ml koniskt rör.
      OBS: Om nedströmsapplikationen är encells- eller bulk-RNA-sekvenseringsanalys eller cellodling, bör FCS-partier testas för att säkerställa att cellerna inte aktiveras före analys. Alternativt kan celler bearbetas med 1x PBS med 0,04 % BSA istället för RPMI med 10 % FCS.
    3. Använd en 10 ml serologisk pipett, tvätta petriskålen med ytterligare 2 ml media för att samla upp eventuell kvarvarande vävnad och överför till ett koniskt rör för en total volym på 5 ml. Håll rören på is mellan bearbetningsstegen.
    4. Använd en pipett och återsuspendera kollagenas I-pulvret i Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) media för att uppnå önskad koncentration (dvs. 100 mg/ml). Tillsätt kollagenas typ I till det koniska röret som innehåller det malda vävnadsprovet för att erhålla önskad slutlig koncentration (dvs. 50 μL för 1 mg/ml).
      OBS: Högre koncentrationer av kollagenas ökar cellutbytet men kan klyva cellytemarkörer. Därför bör kollagenas I-partier titreras för att bestämma den optimala koncentration som behövs för att erhålla det högsta antalet livskraftiga celler med alla nödvändiga cellytemarkörer intakta. Till exempel testades kollagenas I vid slutliga koncentrationer på 0,5 mg/ml, 1 mg/ml och 2 mg/ml på enstaka hjärn- eller ryggmärgsprover. Cellviabiliteten bestämdes med hjälp av trypanblå uteslutningsmetoden och cellytemarkörerna CD45, CD19 och CD4 bedömdes med flödescytometri. En koncentration på 1 mg/ml kollagenas I gav det högsta antalet levande celler samtidigt som alla cellytemarkörer av intresse bibehölls. Således användes denna koncentration för ytterligare experiment för att undersöka dessa celltyper.
    5. Återsuspendera försiktigt DNase I-pulver med 0,15 M natriumklorid till önskad stamkoncentration. Tillsätt det omsuspenderade DNas I till det koniska röret som innehåller det malda vävnadsprovet för att erhålla en slutlig koncentration på 20 E/ml.
      OBS: DNase I-partier varierar beroende på aktivitetsenheter per ml. Koncentrationen som ska tillsättas till vävnadsprovet kommer att ändras baserat på injektionsflaskans aktivitetsenheter per milliliter. Den slutliga önskade koncentrationen per prov är 20 U/ml.
    6. Lägg rören i ett rörställ i ett 37 °C vattenbad och inkubera i 40 minuter. Vänd rören var 15:e minut för att noggrant blanda vävnaden med enzymerna. Efter inkubationen tillsätts 500 μl 0,1 M EDTA (pH = 7,2) till varje rör för en slutlig koncentration av 0,01 M EDTA och inkuberas i ytterligare 5 minuter för att inaktivera kollagenas.
    7. Använd en 10 ml serologisk pipett och tillsätt 9 ml RPMI kompletterat med 10 % FCS till varje rör för att få volymen på varje rör till ~14,5 ml. Centrifugera vid 450 x g i 5 minuter vid 4 °C. Använd en Pasteur-pipett med vakuum och aspirera supernatanten och var försiktig så att du inte vidrör cellpelleten.
    8. Använd en 5 ml serologisk pipett och tillsätt 3 ml 100 % isoton densitetsgradientlösning till röret som innehåller cellpelleten. Använd en 10 ml serologisk pipett, tillsätt ytterligare RPMI 10 % FCS-media för att få den slutliga volymen till 10 ml och återsuspendera cellpelleten för att skapa ett 30 % lager isoton densitetsgradientlösningsskikt.
      OBS: Förbered det 100 % buljongformiga isotoniska densitetsgradientmediet i förväg, alikvot och förvara vid 4 °C i upp till 3 månader. För att bereda den 100 % stamisotona gradientlösningen, späd densitetsgradientmediet (materialtabell) med utspädningsbuffert för densitetsgradientmedia. Bered utspädningsbufferten för densitetsgradientmediet (80,0 g/L NaCl, 3,0 g/L KCl; 0,73 g/L Na 2 HP0 4, 0,20 g/L KH2HP04;20,0 g/L glukos) och sterilisera filtret med ett vakuumfiltersystem. Gör den 100 % stamisotona densitetsgradientlösningen genom att blanda 1 del densitetsgradientutspädningsbuffert och 9 delar densitetsgradientmedium. Blanda väl.
    9. Vänd upp och ner och blanda varje rör väl innan du tillsätter 70 % lager isotonisk densitetsgradientlösningsunderlag. Sätt in en 1 ml serologisk pipett som innehåller 1 ml 70 % isoton densitetsgradientlösning i botten av röret. Blötlägg långsamt 1 ml av lösningen, var försiktig så att du inte gör bubblor. Ta långsamt bort den serologiska pipetten från röret, var försiktig så att du inte stör lutningen.
      ANM.: För 70 % underlag bör 100 % stamlösning med isoton densitetsgradient spädas till 70 % med hjälp av RPMI-media (dvs. 7 ml 100 % stamlösning med isoton densitetsgradient och 3 ml RPMI-media blandat väl). Dessutom är det viktigt att skapa ett rent, ostört 70 % underlag för att avlägsna myelinrester och för att erhålla rena encellssuspensioner vid gradientgränssnittet efter centrifugering.
    10. Centrifugera vid 800 x g i 30 minuter vid 4 °C utan broms. Aspirera supernatanten, inklusive myelinresterskiktet, tills 2–3 ml finns kvar i röret, var noga med att inte störa celskiktet. Skörda celskiktet mellan 30/70 % densitetsgradienten med en 1 ml pipett och överför till ett nytt 15 ml koniskt rör.
    11. Använd en 10 ml serologisk pipett och tillsätt RPMI 10 % FCS-media för att få den slutliga volymen till 15 ml. Centrifugera 450 x g i 5 minuter vid 4 °C.
      OBS: Under detta steg kan celllager från två rör poolas vid behov. Poola inte mer än två rör, annars kommer cellerna inte att pelletera på grund av en koncentration av gradientmedia med hög densitet.
    12. Aspirera supernatanten försiktigt för att inte störa cellpelleten. Återsuspendera cellerna i en lämplig volym/buffert för att räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer (t.ex. återsuspendera en enda ryggmärg i 250 μl FACS-buffert för ytfärgning nedströms) (figur 3).
    13. Använd en 1 ml pipett, överför cellsuspensionerna till toppen av ett filtertopprör (materialtabell) och låt cellerna filtrera till botten av röret för att avlägsna eventuellt kvarvarande myelinskräp.
    14. Späd och räkna cellerna på en hemocytometer med hjälp av trypanblått uteslutningsfärgämne genom att beräkna medelvärdet av minst två 16 kvadratiska rutnät för noggrannhet40,41.
    15. Fortsätt med önskad encellsanalysteknik.
      OBS: Med hjälp av olika former av kollagenas (dvs. D, typ I, typ II, typ IV), immunceller, mikroglia (figur 3), astrocyter, pericyter, endotelceller49 och neuroner50 kan alla effektivt isoleras. Antalet kärnförsedda celler som erhölls för resultaten var följande med hjälp av enzymet titrerat kollagenas I: Hela skenbehandlade hjärnor = 500 000–600 000 celler; Hela TMEV-IDD-hjärnan = 800 000–1 000 000 celler; Hel skenbehandlad ryggmärg = 150 000–200 000 celler; Hela TMEV-IDD ryggmärg = 300 000–400 000. Cellantalet kommer att variera beroende på precisionen i insamlingen, bearbetningen och om CNS-inflammation är närvarande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta representativa experiment syftade till att kvantifiera B- och T-celler och beskriva B- och T-cellslokalisering i meningeala och parenkymala CNS-kompartment under homeostatiska förhållanden samt i en musprogressiv MS-modell (dvs. TMEV-IDD). TMEV-IDD inducerades hos 5 veckor gamla SJL-honmöss genom intrakraniell infektion med 5 x 106 plackbildande enheter (PFU) av TMEV BeAn som tidigare beskrivits29.

I den aktuella studien utvärderades B- och T-celler i hjärnhinnorna, hjärnan och ryggmärgen under kronisk TMEV-IDD dag 120 efter infektion. Åldersmatchade skenbehandlade möss användes som kontroller. Studien bestod av två experiment. Den första fokuserade på att erhålla encellssuspensioner för flödescytometrisk bedömning, en väletablerad teknik för att analysera och kvantifiera cellsammansättning genom att utvärdera cellyteantigener och/eller intracellulära antigener (n = 4 skenbehandlade; n = 5 TMEV-IDD). Det andra experimentet fokuserade på att beskriva B- och T-cellslokalisering i CNS-kompartmentet genom att använda immunhistokemi på avkalkad hjärn- och ryggmärgsvävnad (n = 3 skenbehandlad; n = 8 TMEV-IDD).

Efter isolering av encellssuspensioner från hjärna, ryggmärg och poolade hjärnhinnor (hjärna och ryggmärg) från TMEV-IDD och skenbehandlade möss, tillämpades ett ytfärgningsprotokoll på alla prover. Kortfattat inkuberades encellssuspensioner med en fixerbar viabilitetsuteslutningsfläck (780) i 15 minuter, tvättades, blockerades med Fc-block i närvaro av musserum i 15 minuter och färgades med konjugerade antikroppar för cellytemarkörer, inklusive CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3; PE-CF594) och CD4 (GK1.5; PE) i 30 min som tidigare beskrivits28,29. Cellerna tvättades sedan och analyserades med hjälp av en flödescytometer28,29. Lönsamhetsgrind genomfördes som tidigare beskrivits28. CD45-uttryck bedömdes särskilja CD45hi-perifert härledda infiltrerande immunceller (P1) från CD45 lo-mikroglia (P2) och CD45-neuroner, astrocyter och oligodendrocyter i hjärnan och ryggmärgen (P3; Figur 3A). Hos simulerade möss fanns få CD45hi-celler i ryggmärgen och hjärnvävnaden. I hjärnhinnorna tillämpades samma grind-cut-off för CD45hi-uttryck som används för hjärn- och ryggmärgsdata för att identifiera CD45hi-immunceller (P1; Figur 3C) och exkludera icke-immuna celler som finns i hjärnhinnorna (dvs. fibroblaster, endotelceller). Hos simulerade möss fanns få CD45hi-celler (<0,1 %) i hjärnhinnorna. Bland CD45 hi-immunceller i TMEV-IDD CNS-vävnader identifierades B-celler och CD4 T-celler genom ytuttryck av CD19 respektive CD4 (Figur 3B-D). I alla TMEV-IDD CNS-vävnader observerades en ökad andel CD45hi-immunceller jämfört med simulerade möss (Figur 4A). Vid kronisk TMEV-IDD var andelen B-celler bland CD45hi-immunceller i hjärnan och ryggmärgen högre jämfört med hjärnhinnekompartmentet (Figur 4B).

För att identifiera lokaliseringen av B-celler och T-celler i CNS-kompartmentet under kronisk TMEV-IDD utvärderades avkalkade hjärnor och ryggmärg med hjälp av immunhistokemi med hjälp av det färgningsprotokoll som tidigare beskrivits29. Hjärnhinnorna och kärlen avgränsades med hjälp av laminin, en basalmembrankomponent29,51 och ER-TR7, en fibroblast retikulär cellmarkör52,53. Vid konventionell extraktion av hjärnan från skallskålen var piaskiktet intakt, men de återstående hjärnhinnelagren uteslöts (Figur 5A). I ryggmärgen resulterade hydraulisk extrudering i frånvaro av alla meningeala skikt (data visas inte). I både avkalkade hjärnor och ryggmärg var alla hjärnhinneskikt intakta (Figur 5B). För att undersöka B- och T-cellslokalisering vid kronisk TMEV-IDD användes IgG-uttryck för att bestämma lokaliseringen av isotypswitchade B-celler 29, och CD3 användes för att visualisera alla T-celler29. Färgning av IgG med ER-TR7 visade att isotypswitchade IgG+ B-celler fanns i CNS-parenkymet och hjärnhinnorna (Figur 6A). Cellulära aggregat inom ER-TR7+-hjärnhinnorna innehöll flera IgG+ B-celler och CD3+ T-celler (figur 6B).

De representativa resultaten visar höga andelar av både B-celler och T-celler i parenkymala och meningeala kompartment hos kroniska TMEV-IDD-möss i motsats till åldersmatchade skenbehandlade möss. IHC-analys visade vidare att i TMEV-IDD-vävnad var B-celler och T-celler spridda i parenkymet, men var nära associerade i hjärnhinnorna och bildade inflammatoriska aggregat. Hos patienter med progressiv MS är hjärnhinneinflammationsaggregat associerade med intilliggande vävnadsskada och sämre sjukdomsutfall. Vid kronisk TMEV-IDD kan kvarstående förekomst av B- och T-celler i CNS-kompartmentet och aggregering i hjärnhinnorna vara förknippad med vävnadsskada och sjukdomsprogression. Ytterligare studier behövs för att förstå hur meningeal kontra parenkymal inflammation påverkar demyelinisering, neurodegeneration och klinisk funktionsnedsättning.

Figure 1
Figur 1: Isolering av hjärnor och ryggmärg för avkalkning. Blå prickade linjer indikerar snitt som gjorts för att isolera hjärnan med intakt skalle (snitt 1-4) och kotpelare (snitt 5-8). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Isolering av hjärnor, ryggmärg och hjärnhinnor för encellstekniker. (A) Blå streckade linjer indikerar snitt som gjorts för att isolera skallskålen med intakta hjärnhinnor och hjärna (snitt 1-3) och kotpelare (snitt 5-7). Lateralt snitt 3 görs på båda sidor av skallen. (B) Blå linje indikerar snitt som görs för att skära och ta bort hjärnhinnorna i skallskålen och de snitt som görs i ryggraden (båda sidosidorna) för att isolera ryggmärgen och hjärnhinnorna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Identifiering av CD45hi-infiltrerande immunceller i CNS-vävnader. (A) Regleringsstrategi för identifiering av CD45hi-infiltrerande immunceller (P1), CD45lo mikroglia (P2) och CD45-oligodendrocyter, astrocyter och neuroner bland totalt antal levande celler i ryggmärgen från skenbehandlade (röda) eller TMEV-IDD (blå) möss. Minimalt med CD45hi-celler upptäcktes i skenbehandlade hjärnor och ryggmärg. (B) Gating-strategi för att identifiera CD19+ B-celler och CD4+ T-celler bland CD45hi-infiltrerande immunceller (P1) i TMEV-IDD-möss. Regleringsstrategierna var likartade för hjärn- och ryggmärgsvävnad. (C) Regleringsstrategi för identifiering av CD45hi-celler (P1) i hjärnhinnorna hos skenbehandlade (röda) och kroniska TMEV-IDD-möss (blå). (D) Gating-strategi för att identifiera CD19+ B-celler och CD4+ T-celler bland CD45hi-infiltrerande immunceller (P1) i hjärnhinnorna hos kroniska TMEV-IDD-möss. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: CD45 hi-immunceller och CD19+ B-celler ökade i CNS-vävnader vid kronisk TMEV-IDD. Stapeldiagramsammanfattningar av flödescytometridata erhållna från skenbehandlade eller TMEV-IDD-hjärnhinnor, hjärna och ryggmärg visar procentandelar av CD45 hi-infiltrerande immunceller (A) eller procentandelar CD19+ B-celler (B). För TMEV-IDD-vävnader erhölls flödescytometridata från fem möss, där ryggmärg och hjärna bearbetades individuellt, medan hjärnhinnorna poolades för analys. För simulerade möss erhölls flödescytometridata från fyra möss, där ryggmärg och hjärna bearbetades individuellt, medan hjärnhinnorna poolades för analys. Data för ryggmärg och hjärna visas som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Intakta hjärnhinnelager i avkalkade hjärnor och ryggmärg. (A) Hjärnor extraherade från skallkapseln eller (B) avkalkade hjärnor med intakta skallar och kotpelare från kroniska-TMEV-IDD-möss utvärderades med avseende på DAPI (blå), meningeala markörer laminin (grön) och ER-TR7 (röd). Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Aggregering av immunceller var tydlig i hjärnhinnorna vid kronisk TMEV-IDD. (A) Avkalkade kotpelare från möss med kronisk TMEV-IDD undersöktes med avseende på förekomst av IgG (grönt) för att identifiera isotypomkopplade immunceller i parenkymet och i ER-TR7+-hjärnhinnorna (rött). (B) CD3+ T-celler (gröna) och IgG+ isotypswitchade B-celler (röda) samfärgades med ER-TR7+-hjärnhinnor för att bedöma lokalisering i ryggmärgsvävnaden. Vita pilar markerar B- och T-celler i hjärnhinnorna. Skalstapel = 50 μm. Vita rutor avgränsar områden som valts för beskurna bilder (höger; skalstreck = 10 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoder för att utvärdera den cellulära sammansättningen i CNS-facket under homeostas och sjukdom är avgörande för att förstå de fysiologiska och patologiska tillstånden i CNS. Men trots att de fungerar som en viktig barriär i CNS och hyser en mängd olika immunceller, utelämnas hjärnhinnorna ofta från analys eftersom många konventionella vävnadsextraktionsmetoder för hjärnan och ryggmärgen inte tillåter insamling av dessa membran. Detta utelämnande är en kritisk begränsning i utvecklingen av vår förståelse av hjärnhinnornas cellulära sammansättning och funktion och dess roll i steady state och inflammatoriska tillstånd. Nyligen genomförda studier visade att både inhemska och perifert härledda immunceller som finns i meningealkompartmentet spelar en viktig roll för att upprätthålla homeostas i CNS, såväl som för att driva CNS-sjukdomspatogenesen. Dessa studier betonar behovet av att analysera inte bara det parenkymala facket utan även de omgivande hjärnhinneskikten. Protokollen som beskrivs här möjliggör snabb isolering av hjärna och ryggmärg samtidigt som hjärnhinnorna bevaras, vilket i slutändan möjliggör en omfattande nedströmsanalys av CNS-facket med hjälp av både histologiska och encellsstudier. De representativa resultaten fokuserar på att bedöma immunceller i CNS-facket; Protokollen kan dock anpassas för att analysera mikroglia, astrocyter, neuroner, pericyter, endotelceller eller andra CNS-residenta celler.

Ett kritiskt steg i de beskrivna metoderna är den noggranna extraktionen av vävnaden, vilket är nödvändigt både för att isolera rena encellssuspensioner från hjärna, ryggmärg och hjärnhinnor och för att erhålla CNS-vävnader med antingen intakta skallar eller ryggrader, vilket möjliggör vävnadsmorfologi av hög kvalitet. Att öva på tekniken för att erhålla encellssuspensioner är nyckeln till en framgångsrik vävnadsextraktion eftersom det inte bara kommer att förbättra provets renhet utan också förbättra cellutbytet för nedströmsapplikationer. På samma sätt är övning i isolering av CNS-vävnader med intakta skallar eller ryggrader för att på ett adekvat sätt avlägsna överflödig vävnad som omger benet ett viktigt steg som säkerställer bättre fixering, avkalkning och kryokonservering av vävnaden, alla avgörande komponenter för att erhålla vävnadssnitt med högkvalitativ morfologi och intakta antigenmål.

En begränsning i vårt protokoll för att isolera encellssuspensioner från hjärnhinnorna är att det fokuserar på att erhålla dural- och araknoidalhjärnhinnor32,54 samtidigt som man utelämnar isoleringen av pia, som förblir fäst vid hjärnan eller ryggmärgen via astrocytprocesser. Även om cellerna i pia mater är en viktig komponent i meningealkompartmentet, beslutades det att utesluta pia mater under beredningen av encellssuspensionen på grund av den långa tid som krävs för attisolera den på ett adekvat sätt. På samma sätt fokuserar protokollet endast på att erhålla hjärnhinnor i den övre delen av kraniet och utesluter isolering av de invaginerande hjärnhinnorna i hjärnan och plexus choroideus. Insamling av invaginaterande hjärnhinnor och plexus choroideus kan utföras enligt tidigare publicerade protokoll55, även om det är en tidskrävande procedur. I båda fallen berodde valet att utelämna en del av hjärnhinnelagren på den tid det tar att isolera dem. Tidpunkten för det protokoll som används för att framställa encellssuspensioner som krävs för nedströmstillämpningar såsom flödescytometri, cellodlingsanalyser och RNA-sekvensering (RNAseq) är avgörande för att förbättra cellviabiliteten och datakvaliteten. Beroende på den specifika forskningsfrågan bör därför en balans uppnås mellan provisoleringstiden och noggrannheten i extraktionen av hjärnhinnorna. I det nuvarande protokollet erhålls endast encelliga suspensionspreparat från dura- och araknoidalhinnorna, vilket begränsar möjligheten att extrapolera resultaten till hela CNS-hjärnhinnorna. Men om dessa metoder används i kombination med IHC- eller ISH-analys av hela vävnadssnitt med de tre skikten av hjärnhinnor, kan en mer grundlig förståelse av den cellulära och molekylära dynamiken i parenkymala och meningeala kompartment vinnas.

En annan begränsning i protokollet är det låga cellantalet som erhålls från dural- och araknoidalhjärnhinnorna, särskilt under homeostatiska förhållanden. Om cellantalet i ryggmärgen, hjärnan eller hjärnhinnorna bedöms vara för lågt för analys av en viss målcellspopulation, kan det minimala cellantal som krävs för analysen bestämmas genom att uppskatta det totala antalet händelser som krävs för en given precision (t.ex. 5 % variationskoefficient) enligt beskrivningen i tidigare litteratur som specialiserat sig på analys av sällsynta händelser56. Dessa beräkningar kan sedan användas för att avgöra om prover från flera djur måste poolas för att få tillräckligt med cellantal för att analysera den aktuella cellpopulationen.

De beskrivna metoderna ger ett viktigt framsteg i undersökningen av den cellulära dynamiken i CNS-kompartmentet genom att utvidga analyserna till att omfatta det ofta försummade meningeala facket. Dessa protokoll möjliggör individuell extraktion av hjärnan, ryggmärgen och de durala och araknoidala hjärnhinnorna för att generera encellssuspensioner. Dessutom möjliggör avkalkningsprotokollet histologiska analyser av vävnadssnitt som omfattar hjärn- eller ryggmärgsvävnad inklusive de tre meningeala lagren. Att använda EDTA ger en långsam men skonsam avkalkningsprocess, vilket är mest lämpligt för prover där högkvalitativ vävnadsmorfologi krävs (t.ex. IHC och ISH). Protokollet använder ett pH på 7,2–7,4 för att bromsa avkalkningshastigheten och säkerställa att intakt vävnadsmorfologi bibehålls, en klar fördel jämfört med starka och svaga syror (t.ex. saltsyra och triklorättiksyra), som har en kortare avkalkningstid, men påverkar kvaliteten på vävnadsmorfologin.

Framtida metoder som syftar till att isolera encellssuspensioner från hjärnhinnorna bör fokusera på att utveckla protokoll för att förkorta den tid som krävs för att grundligt isolera pialskiktet från CNS-vävnader och de invaginerande hjärnhinnorna i hjärnan. Att erhålla det fullständiga komplexet av de tre meningeala skikten kommer inte bara att öka cellantalet för alla analyser utan kommer också att ge en mer omfattande bedömning av de inneboende och infiltrerande immuncellerna som upptar hjärnhinnorna, som omsluter CNS. Samtidigt bör framtida protokoll som fokuserar på att förbereda avkalkade hjärnor och ryggmärg försöka identifiera nya medel som syftar till att påskynda vävnadsavkalkning samtidigt som kvaliteten på vävnadsmorfologin bevaras. Sammantaget kan dock nedströmsapplikationer som analyserar CNS-encellssuspensioner inklusive dubbla och araknoidala hjärnhinnor, utförda i kombination med omfattande vävnadssnittsanalys, ge en detaljerad förståelse för cellfenotyp, funktion och lokalisering i CNS-facket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar personalen vid Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) i Dartmouth för deras expertvård av mössen som användes för dessa studier. Bornsteins forskningsfond har finansierat denna forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, Pt 10 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, Pt 9 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019).
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 159 hjärnhinnor centrala nervsystemet avkalkning immunhistokemi encellssuspension immunceller möss
Isolering av vävnader i centrala nervsystemet och tillhörande hjärnhinnor för nedströmsanalys av immunceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, … More

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter