Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل أنسجة الجهاز العصبي المركزي والسحايا المرتبطة به لتحليل المصب للخلايا المناعية

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

تقدم هذه الورقة بروتوكولين محسنين لفحص الخلايا المناعية المقيمة والمشتقة من المحيط داخل الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك الدماغ والحبل الشوكي والسحايا. يساعد كل من هذه البروتوكولات على التأكد من وظيفة وتكوين الخلايا التي تشغل هذه المقصورات في ظل حالة مستقرة وظروف التهابية.

Abstract

يتكون الجهاز العصبي المركزي (CNS) من الدماغ والحبل الشوكي وتحيط به السحايا ، وهي طبقات غشائية تعمل كحاجز بين المحيط والجهاز العصبي المركزي. الجهاز العصبي المركزي هو موقع متخصص في المناعة ، وفي ظروف الحالة المستقرة ، يكون الامتياز المناعي أكثر وضوحا في حمة الجهاز العصبي المركزي. في المقابل ، تؤوي السحايا مجموعة متنوعة من الخلايا المقيمة ، بما في ذلك الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية. أثناء الحالات الالتهابية الناجمة عن إصابة الجهاز العصبي المركزي ، أو المناعة الذاتية ، أو العدوى ، أو حتى التنكس العصبي ، قد تدخل الخلايا المناعية المشتقة من المحيط إلى الحمة وتستقر داخل السحايا. يعتقد أن هذه الخلايا تؤدي إجراءات مفيدة وضارة أثناء التسبب في مرض الجهاز العصبي المركزي. على الرغم من هذه المعرفة ، غالبا ما يتم تجاهل السحايا عند تحليل حجرة الجهاز العصبي المركزي ، لأن طرق استخراج أنسجة الجهاز العصبي المركزي التقليدية تحذف الطبقات السحائية. يقدم هذا البروتوكول طريقتين متميزتين للعزل السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي للفئران (أي الدماغ والحبل الشوكي والسحايا) المناسبة للتحليل النهائي عبر تقنيات الخلية الواحدة والكيمياء الهيستولوجية المناعية وطرق التهجين في الموقع. توفر الطرق الموصوفة تحليلا شاملا لأنسجة الجهاز العصبي المركزي ، وهي مثالية لتقييم النمط الظاهري والوظيفة وتوطين الخلايا التي تشغل حجرة الجهاز العصبي المركزي في ظل ظروف الاستتباب وأثناء التسبب في المرض.

Introduction

الجهاز العصبي المركزي (CNS) هو موقع متخصص في المناعة. يعتبر النسيج البرنشيمي للجهاز العصبي المركزي ، باستثناء مساحة السائل الدماغي الشوكي والسحايا والأوعية الدموية ، تقليديا على أنه موقع متميز مناعيا1،2،3،4،5 وهو خال نسبيا من الخلايا المناعية خلال ظروف الاستتباب 2،6،7. في المقابل ، فإن السحايا ، التي تتكون من طبقات الجافية والعنكبوتية والحنون ، هي مكونات حاسمة في حجرة الجهاز العصبي المركزي ، وتشارك بنشاط في المراقبة المناعية التماثلية والعمليات الالتهابية أثناء التسبب في المرض3،6،7،8. خلال ظروف الحالة المستقرة ، تدعم السحايا العديد من الخلايا الخافرة المناعية ، بما في ذلك الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC) ، والبلاعم ، والخلايا المتغصنة (DC) ، والخلايا البدينة ، والخلايا التائية ، وبدرجة أقل ، الخلايا البائية9،10،11.

السحايا عبارة عن هياكل شديدة الأوعية الدموية وتحتوي على أوعية لمفاوية توفر اتصالا لمفائيا بين الجهاز العصبي المركزي ومحيطه8،12،13،14. في الحالات الالتهابية الناجمة عن إصابة الجهاز العصبي المركزي ، أو الالتهابات ، أو المناعة الذاتية ، أو حتى التنكس العصبي ، تتسلل الخلايا المناعية المشتقة من المحيط إلى الحمة وتغير المشهد المناعي داخل السحايا. بعد تسلل الخلايا ، قد تمثل السحايا مكانا وظيفيا للخلايا المناعية المشتقة من المحيط ، مما يعزز تراكم الخلايا المناعية ، وتنشيط الخلايا المناعية المحلية ، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل في حجرة الجهاز العصبي المركزي. لوحظ التهاب سحائي بارز في أمراض متعددة تؤثر على الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك التصلب المتعدد (MS) 15،16،17،18،19 ، السكتة الدماغية 20،21 ، إصابة معقمة 22،23 (أي إصابة الحبل الشوكي وإصابات الدماغ الرضحية) ، الصداع النصفي 24 ، والعدوى الميكروبية 25،26 ،27,28,29. وبالتالي ، فإن توصيف الخلايا المقيمة والخلايا المناعية المشتقة محيطيا في المقصورة السحائية أمر ضروري لفهم دور هذه الخلايا أثناء ظروف الحالة المستقرة والتسبب في المرض.

يعد استخراج الدماغ والحبل الشوكي والسحايا من الجمجمة والأجسام الفقرية أمرا صعبا من الناحية الفنية ويستغرق وقتا طويلا. لا توجد حاليا تقنيات متاحة للاستخراج السريع للدماغ مع سلامة جميع طبقات السحايا الثلاث. في حين أن استئصال الصفيحة الفقرية ينتج مورفولوجيا ممتازة لأنسجة الحبل الشوكي ويحافظ على الطبقات السحائية ، إلا أنه يستغرق وقتا طويلا للغاية ومعقدا30,31. على العكس من ذلك ، فإن طرق الاستخراج التقليدية مثل إزالة الدماغ من الجمجمة والبثق الهيدروليكي للحبل الشوكي تسهل الاستخراج السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي ، ولكن يتم فقدان كل من السحايا العنكبوتية والجافية بهذه التقنيات30,31. يؤدي إغفال طبقات الجافية والعنكبوتية أثناء العزل التقليدي لأنسجة الدماغ والحبل الشوكي إلى تحليل غير مكتمل للخلايا داخل حجرة الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي ، فإن تحديد التقنيات الجديدة التي تركز على الاستخراج السريع لأنسجة الجهاز العصبي المركزي مع السحايا السليمة أمر بالغ الأهمية للتحليل الأمثل لحجرة الجهاز العصبي المركزي.

تقدم هذه المخطوطة طريقتين للاستخراج السريع للدماغ والحبل الشوكي والسحايا من الفئران، مما يسهل التحليل النهائي للخلايا المقيمة والخلايا المناعية المشتقة من الأطراف في حمة الجهاز العصبي المركزي والسحايا. تركز هذه البروتوكولات المحسنة على 1) عزل معلقات الخلية الواحدة للتحليل النهائي و 2) تحضير الأنسجة للمعالجة النسيجية. يسمح الحصول على معلقات أحادية الخلية من الدماغ وأنسجة الحبل الشوكي والسحايا الجافية والعنكبوتية32 بالتحليل المتزامن للخلايا الموجودة في كل من المقصورات المتنية والسحائية. يمكن استخدام معلقات الخلية الواحدة في تطبيقات مختلفة ، بما في ذلك مقايسات زراعة الخلايا لأداء التحفيز في المختبر 33 ، والبقعة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISpot) 28،34،35 ، وقياس التدفق الخلوي36،33 ، والخلية الواحدة 37 أو النسخ السائب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتوكول الأمثل لإزالة الكلس من الأدمغة الكاملة والحبل الشوكي مع الجماجم السليمة أو الأعمدة الفقرية ، على التوالي ، يسمح بإزالة الكلس بلطف من العظام المحيطة ، وترك السحايا سليمة والحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. تسمح هذه الطريقة بالتحديد الانتقائي للبروتينات أو الحمض النووي الريبي باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) أو تقنيات التهجين في الموقع (ISH) داخل كل من المساحات المتنية والسحائية. قد يوفر توصيف النمط الظاهري وحالة التنشيط وتوطين الخلايا المقيمة والخلايا المناعية المشتقة طرفيا داخل الجهاز العصبي المركزي معلومات أساسية لفهم كيفية مساهمة أنواع الخلايا الفردية في حجرة الجهاز العصبي المركزي في الاتزان الداخلي والتسبب في المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تستخدم جميع الأعمال الحيوانية البروتوكولات التي تمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في كلية جيزل للطب في دارتموث.

1. معالجة عينات الدماغ والحبل الشوكي لإزالة الكلس

  1. عزل عينات الدماغ والحبل الشوكي
    1. القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق CO2 . تأكد من أن معدل تدفق CO2 يحل محل 10٪ -30٪ من حجم القفص في الدقيقة.
    2. باستخدام الملقط ، ارفع عملية الخنجري ، واقطع جدار البطن بشكل جانبي أسفل القفص الصدري بالمقص مباشرة ، واسحب لأعلى لتجنب قطع الأوعية الدموية أو الأعضاء الكامنة. قطع من خلال الحجاب الحاجز بشكل جانبي.
    3. قطع القفص الصدري على طول الحواف الجانبية الموازية للرئتين حتى الترقوة. باستخدام ملقط ، ارفع القص وثبت القص بمرقئ. ضع المرقئ فوق الرأس لرفع القفص الصدري بعيدا وكشف القلب.
    4. باستخدام الملقط ، أمسك القلب بالقرب من قمته وقم بعمل شق في الأذين الأيمن للقلب لتوفير منفذ. أدخل إبرة 25 جم مع حقنة سعة 10 مل متصلة لإدارة 10 مل ببطء من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بالثلج البارد 1x في البطين الأيسر لاختراق الفأر عبر القلب.
      ملاحظة: يجب أن يحدث التروية أكثر من 4-5 دقائق حتى يتم تطهير الكبد من الدم. عادة ما يكون إجمالي 10 مل من 1x PBS كافيا للتروية ، ولكن يمكن استخدام المزيد إذا لزم الأمر. عادة ما يشير الكبد الصافي إلى التروية الكافية.
    5. باستخدام مقص حاد ، قم بإزالة الرأس عن طريق قطع الرأس (الشكل 1 ؛ 1). قم بعمل شق في خط الوسط في الجلد (الشكل 1 ؛ 2) واقلب الجلد فوق العينين لتحرير الجمجمة.
    6. قطع عظم الأنف لتحرير الفك السفلي من الجمجمة (الشكل 1 ؛ 3). قم بإزالة الفك السفلي واللسان والعينين. قطع على طول الجوانب الجانبية للجمجمة لتحرير الأنسجة على طول الصماخ السمعي الخارجي (الشكل 1 ؛ 4). تقليم لإزالة جميع الجلد الزائد والعضلات والأنسجة التي تراكب الجمجمة.
    7. افصل القفص الصدري عن العمود الفقري عن طريق القطع بالتوازي مع العمود الفقري بمقص حاد (الشكل 1 ؛ 5 و 6). قم بعمل قطع صغير في منطقة أسفل الظهر لعزل العمود الفقري (الشكل 1 ؛ 7). قم بقص وإزالة أي عضلات متبقية على طول العمود الفقري لكشف الفقرات (الشكل 1 ؛ 8).
      ملاحظة: تعد إزالة الأنسجة الزائدة من العمود الفقري والجمجمة ضرورية للحصول على اختراق كاف لمحلول إزالة الكلس المثبت بارافورمالدهيد (PFA) وحمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA).
  2. ما بعد التثبيت وإزالة الكلس والحفظ بالتبريد
    1. باستخدام الملقط ، ضع الدماغ مع الجمجمة السليمة أو العمود الفقري في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من 4٪ PFA. ضع الأنابيب على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل للتثبيت الكافي.
      ملاحظة: لتجنب التثبيت الزائد للأنسجة ، لا تتجاوز 72 ساعة من التثبيت. يتم تمديد أوقات التثبيت لعينات العظام قبل إزالة الكلس. التثبيت الكافي سيحمي الأنسجة من آثار إزالة الكلس ويضمن مورفولوجيا الأنسجة بشكل أفضل.
    2. شطف الدماغ أو الحبل الشوكي عن طريق إزالة الأنسجة من 4 ٪ PFA مع ملقط ووضع الأنسجة في أنبوب 14 مل يمكن التخلص منه مع 10 مل من 1x PBS لمدة 5 دقائق. نقل الدماغ أو الحبل الشوكي إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع 10 مل من 10٪ EDTA (درجة الحموضة = 7.2-7.4).
      ملاحظة: إن استخدام أنبوب أكبر يحتوي على 10 مل من EDTA يمنح EDTA مساحة تلامس أكبر مع الأنسجة ويسرع عملية إزالة الكلس.
    3. تحقق يوميا مما إذا كان العظم ناعما ومرنا: قم بإزالة الأنسجة من محلول EDTA بالملقط ، وضعها على طبق بتري ، واختبر نعومة العظام برفق بإبرة 25 جرام. إذا اخترقت الإبرة العظم بسهولة ، تكتمل عملية إزالة الكلس.
    4. قم بإزالة الأنسجة من محلول EDTA وانقل الدماغ أو الحبل الشوكي إلى أنبوب سعة 14 مل يمكن التخلص منه يحتوي على 10 مل من 1x PBS واغسله لمدة 10 دقائق. كرر الغسيل.
      ملاحظة: عادة ما يستغرق إزالة الكلس 2-3 أيام. يجب تغيير المحلول كل 2-3 أيام إذا لم يتم إزالة الكلس من العظم بشكل كاف. ومع ذلك ، فإن الحضانة المطولة في EDTA بعد إزالة الكلس من العظم يمكن أن تلحق الضرر بمورفولوجيا الأنسجة.
    5. تحضير 10٪ و 20٪ و 30٪ محاليل السكروز عن طريق إضافة السكروز إلى 1x PBS. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 10٪ سكروز ، أضف 10 جم من السكروز وارفع الحجم إلى 100 مل باستخدام 1x PBS معقم. قم بتخزين المحلول في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
      ملاحظة: محاليل السكروز عرضة لنمو الكائنات الحية الدقيقة ، لذلك لا ينبغي تخزين العينات لفترات طويلة من الزمن في هذه المحاليل.
    6. قم بإزالة المنديل من 1x PBS ، ضعه في 10 مل من محلول السكروز 10٪ وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية. دع المنديل يجلس لمدة 24 ساعة أو حتى يغرق في قاع الأنبوب.
    7. كرر هذه العملية ، وانقل الأنسجة إلى محلول السكروز بنسبة 20٪ أولا وأخيرا إلى محلول السكروز بنسبة 30٪. اترك الأنسجة تغرق في 30٪ سكروز (24 ساعة على الأقل) وانتقل إلى تضمين الأنسجة.
  3. تضمين الأنسجة وتجميدها
    1. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الأنسجة من السكروز بنسبة 30٪ ، وضعها على طبق بتري ، وقم بإمالة الطبق للتخلص من أي محلول سكروز زائد على الأنسجة. باستخدام مشرط ، وقطع الأنسجة إلى شرائح المطلوبة.
    2. قم بإنشاء طبقة رقيقة من مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في الجزء السفلي من cryomold وضع قطعة (قطع) الأنسجة في القالب. قم بتغطية الأنسجة بالكامل بمركب OCT ، مع ضمان عدم وجود فقاعات.
    3. قم بتجميد الكتل بسرعة عن طريق التمرير فوق النيتروجين السائل38 أو وضع الكتل على ملاط الأيزوبروبانول / الثلج الجاف بنسبة 100٪39 حتى تصبح الكتلة معتمة. لف قوالب التبريد بورق الألمنيوم وقم بتخزين الكتل عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. انقل الكتل إلى -20 درجة مئوية قبل التقسيم.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند تقسيم وتنفيذ بروتوكولات الأنسجة على الأدمغة منزوعة الكلس حيث قد تفقد طبقات الجمجمة والسحائية إذا تم التعامل مع الأقسام تقريبا.

2. تحضير أنسجة السحايا والجهاز العصبي المركزي لتلطيخ التدفق الخلوي

  1. استخراج غطاء الجمجمة والدماغ
    1. باستخدام مقص حاد ، قم بإزالة الرأس عن طريق قطع الرأس (الشكل 2 أ ؛ 1). باستخدام المقص ، قم بعمل شق في خط الوسط في الجلد (الشكل 2 أ ؛ 2) واقلب الجلد فوق العينين لتحرير الجمجمة.
    2. ضع المقص داخل الثقبة الكبرى وابدأ في قطع الجمجمة بشكل جانبي على طول القشرة باتجاه البصلة الشمية ، مع إبقاء الشقوق فوق الصماخ السمعي الخارجي والفك السفلي (الشكل 2 أ ؛ 3). قم بإجراء نفس الجروح على الجانب الآخر ، مع التقاء الجروح في البصلة الشمية لتحرير غطاء الجمجمة من الدماغ (الشكل 2 أ ؛ 3).
    3. باستخدام الملقط ، قشر غطاء الجمجمة للخلف وضع غطاء الجمجمة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسط RPMI البارد المكمل ب 25 mM HEPES. الحفاظ على الأنبوب على الجليد.
    4. باستخدام ملقط منحني ، ضع الملقط أسفل قاعدة الدماغ ، وارفعه لتحرير الدماغ من غطاء الجمجمة. ضع الدماغ في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من RPMI البارد المكمل ب 25 مللي متر HEPES. احتفظ بالأنبوب على الثلج حتى المعالجة.
  2. استخراج العمود الفقري وأنسجة الحبل الشوكي
    1. باستخدام ملقط ومقص حاد ، افصل القفص الصدري عن العمود الفقري عن طريق القطع بالتوازي مع العمود الفقري (الشكل 2 أ ؛ 4 و 5). قم بعمل قطع صغير في منطقة أسفل الظهر لعزل العمود الفقري (الشكل 2 أ ؛ 6). تقليم وإزالة أي عضلات متبقية على طول العمود الفقري لكشف الفقرات (الشكل 2 أ ؛ 7).
    2. ضع المقص الجراحي الدقيق الإضافي داخل العمود الفقري واقطعه على طول الحافة الجانبية للعمود (الشكل 2 ج). اقطع الحافة الجانبية المقابلة تماما لتقسيم العمود الفقري إلى جزء أمامي وخلفي.
      ملاحظة: سيبقى الحبل الشوكي متصلا بالعمود الفقري.
    3. باستخدام الملقط ، قم بتقشير الحبل الشوكي ببطء وبعناية من العمود الفقري وضع الأنسجة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من RPMI البارد مع 25 mM HEPES. انقل الأجزاء الأمامية والخلفية من العمود الفقري إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من RPMI البارد مع 25 مللي متر HEPES.
  3. إزالة السحايا لإعداد معلقات أحادية الخلية
    1. باستخدام الملقط ، قم بإزالة غطاء الجمجمة من وسائط RPMI. باستخدام ملقط حاد (# 7 ملقط ؛ جدول المواد) ، سجل حول الحافة الخارجية لغطاء الجمجمة (الشكل 2 ب) وقشر السحايا بعيدا عن حافة غطاء الجمجمة ، وكشط لإزالة السحايا الجافية والعنكبوتية. ضع السحايا على طبق بتري.
      ملاحظة: إزالة السحايا من كل من الدماغ والحبل الشوكي يتطلب الممارسة. إذا واجه المستخدم صعوبة في استخراج السحايا ، فاستخدم مجهر تشريح للمساعدة في الإزالة.
    2. قم بإزالة العمود الفقري من الأنبوب. باستخدام ملقط حاد ، سجل حول حواف العمود الفقري لتحرير السحايا وتقشير السحايا من حافة الفقرة باستخدام ملقط منحني. ضع السحايا على طبق بتري.
    3. ضع مصفاة شبكية من النايلون في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. حرك السحايا إلى المصفاة وأضف 3 مل من RPMI مع 25 mM HEPES. باستخدام المكبس من حقنة 5 مل ، قم بطحن الأنسجة والوسائط من خلال المصفاة.
    4. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، اغسل المصفاة ب 2 إلى 3 مل إضافية من وسائط RPMI / HEPES حتى تمر جميع الأنسجة المرئية عبر المصفاة.
      ملاحظة: للحصول على أرقام خلايا كافية لتحليل التدفق الخلوي ، قد يلزم تجميع السحايا من متعددة معا. في هذه التجربة (الشكل 3 والشكل 4) ، تم تجميع سحايا الدماغ والحبل الشوكي من 4-5 فئران معا. إذا تم تجميع العينات ، فستكون هناك حاجة إلى وسائط إضافية لطحن الأنسجة من خلال مصفاة شبكة النايلون لمنع ارتفاع درجة حرارة الأنسجة.
    5. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، انقل الخلايا والوسائط إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، اغسل الأنبوب المخروطي سعة 50 مل ب 5 مل من الوسائط لجمع أي خلايا متبقية. أجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا.
    6. باستخدام ماصة باستور مع فراغ ، قم بنضح المادة الطافية مع الحرص على تجنب حبيبات الخلية وإعادة تعليق الخلايا في حجم ومخزن مؤقت مناسبين.
    7. لحساب التعليق أحادي الخلية ، قم بتخفيف حجم صغير من الخلايا (أي 5-10 ميكرولتر) باستخدام صبغة استبعاد التريبان الزرقاء (تخفيف 1:10) و RPMI. أضف 10 ميكرولتر من التخفيف إلى مقياس الدم.
    8. عد الخلايا كما هو موضح سابقا40,41 ، بمتوسط شبكتين مربعتين على الأقل من 16 للتأكد من دقتها.
      ملاحظة: في الشكل 3 ، على سبيل المثال ، تم إعادة تعليق الخلايا المجمعة والحبيبية من السحايا في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (1x PBS مع 1٪ FBS) لتلطيخ سطح المصب. تم تخفيف الخلايا 1:10 للعد (5 خلايا ميكرولتر ، 5 ميكرولتر تريبان أزرق ، 40 ميكرولتر RPMI). نتج عن هذا التخفيف ما بين 50-100 خلية لكل 16 شبكة مربعة ، مما يضمن عد خلايا أكثر دقة لأن الخلايا ليست كثيفة جدا ومتداخلة ولا متناثرة جدا. كان عدد الخلايا النواة من سحايا الدماغ والحبل الشوكي المجمعة لكل فأر على النحو التالي: بالنسبة للسحايا من الفئران المعالجة الوهمية = 100000-150000 خلية وللسحايا من الفئران التي يسببها فيروس التهاب الدماغ والنخاع الناجم عن فيروس ثيلر (TMEV-IDD) الفئران = 300000-350000 خلية. يختلف عدد الخلايا اعتمادا على دقة الجمع والمعالجة وما إذا كان الالتهاب السحائي موجودا.
    9. انتقل إلى تقنية الخلية الواحدة المطلوبة مثل سطح FACS (الشكل 3)14،36،42،43،44 ، بروتوكولات التلوين داخل الخلايا 33،45 ، التحفيز في المختبر ، مقايسات زراعة الخلايا 33،46،47 ، مقايسة ELISPOT28،34،35 ، والسائبة أو الخلية المفردة علم النسخ37,48.
      ملاحظة: احتفظ بجميع الأنابيب على الثلج بين خطوات المعالجة.
  4. تحضير معلقات أحادية الخلية لأنسجة الدماغ والحبل الشوكي
    1. انقل أنسجة الدماغ أو الحبل الشوكي مع الوسائط إلى الجزء العلوي من طبق بتري 100 مم عن طريق سكب الأنسجة والوسائط من الأنبوب. باستخدام ملقط ، انقل الأنسجة إلى أسفل طبق بتري. فرم الدماغ أو الحبل الشوكي ناعما بشفرة حلاقة معقمة. باستخدام شفرة الحلاقة ، انقل المنديل المفروم إلى أسفل اللوحة عن طريق الكشط لجمع الأنسجة.
      ملاحظة: بالنسبة لبروتوكول الهضم الأنزيمي أدناه ، يمكن تجميع ما يصل إلى حبلين نخاعيين معا للمعالجة. يجب معالجة العقول بشكل فردي.
    2. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، أضف 3 مل من RPMI المكمل بمصل عجل الجنين بنسبة 10٪ (FCS) إلى طبق بتري. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، ماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الأنسجة في الوسائط ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
      ملاحظة: إذا كان تطبيق المصب هو تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أو السائبة أو زراعة الخلايا ، فيجب اختبار الكثير من FCS لضمان عدم تنشيط الخلايا قبل التحليل. بدلا من ذلك ، يمكن معالجة الخلايا باستخدام 1x PBS مع 0.04٪ BSA بدلا من RPMI مع 10٪ FCS.
    3. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، اغسل طبق بتري ب 2 مل إضافية من الوسائط لجمع أي أنسجة متبقية ونقلها إلى أنبوب مخروطي الحجم الإجمالي 5 مل. احتفظ بالأنابيب على الثلج بين خطوات المعالجة.
    4. باستخدام ماصة ، أعد تعليق مسحوق كولاجيناز I في وسائط Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) للحصول على التركيز المطلوب (أي 100 مجم / مل). أضف كولاجيناز من النوع الأول إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على عينة الأنسجة المفرومة للحصول على التركيز النهائي المطلوب (أي 50 ميكرولتر لكل 1 مجم / مل).
      ملاحظة: ستزيد التركيزات العالية من الكولاجيناز من غلة الخلايا ولكنها يمكن أن تشق علامات سطح الخلية. لذلك ، يجب معايرة كميات كولاجيناز I لتحديد التركيز الأمثل اللازم للحصول على أكبر عدد من الخلايا القابلة للحياة مع جميع علامات سطح الخلية المطلوبة سليمة. على سبيل المثال ، تم اختبار كولاجيناز I بتركيزات نهائية تبلغ 0.5 مجم / مل ، و 1 مجم / مل ، و 2 مجم / مل على عينات واحدة من الدماغ أو الحبل الشوكي. تم تحديد صلاحية الخلية باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق وتم تقييم علامات سطح الخلية CD45 و CD19 و CD4 بواسطة قياس التدفق الخلوي. أسفر تركيز 1 مجم / مل من كولاجيناز I عن أعلى عدد من الخلايا الحية مع الاحتفاظ بجميع علامات سطح الخلية ذات الأهمية. وبالتالي ، تم استخدام هذا التركيز لمزيد من التجارب التي تفحص هذه الأنواع من الخلايا.
    5. أعد تعليق مسحوق DNase I برفق باستخدام 0.15 M كلوريد الصوديوم إلى تركيز المخزون المطلوب. أضف DNase I المعاد تعليقه إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على عينة الأنسجة المفرومة للحصول على تركيز نهائي قدره 20 وحدة / مل.
      ملاحظة: تختلف عقود DNase I حسب وحدات النشاط لكل مل. سيتغير التركيز الذي سيتم إضافته إلى عينة الأنسجة بناء على وحدات نشاط قارورة المخزون لكل ملليلتر. التركيز النهائي المطلوب لكل عينة هو 20 وحدة / مل.
    6. ضع الأنابيب في رف أنبوبي في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة 40 دقيقة. اقلب الأنابيب كل 15 دقيقة لخلط الأنسجة جيدا مع الإنزيمات. بعد الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من 0.1 M EDTA (الرقم الهيدروجيني = 7.2) إلى كل أنبوب للحصول على تركيز نهائي قدره 0.01 M EDTA واحتضان لمدة 5 دقائق إضافية لتعطيل الكولاجيناز.
    7. باستخدام ماصة مصلية 10 مل ، أضف 9 مل من RPMI المكمل ب 10٪ FCS لكل أنبوب ليصل حجم كل أنبوب إلى ~ 14.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. باستخدام ماصة باستور مع فراغ ، نضح الطافي مع الحرص على عدم لمس بيليه الخلية.
    8. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، أضف 3 مل من محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ إلى الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات الخلية. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، أضف وسائط RPMI 10٪ FCS إضافية لرفع الحجم النهائي إلى 10 مل وإعادة تعليق حبيبات الخلية لإنشاء طبقة محلول متدرجة الكثافة متساوية التوتر بنسبة 30٪.
      ملاحظة: قم بإعداد وسط تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ مسبقا ، والقسمة ، وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. لتحضير محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ ، قم بتخفيف وسائط تدرج الكثافة (جدول المواد) باستخدام المخزن المؤقت لتخفيف وسائط تدرج الكثافة. قم بإعداد المخزن المؤقت لتخفيف وسائط تدرج الكثافة (80.0 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 3.0 جم / لتر KCl ؛ 0.73 جم / لتر Na 2 HP0 4 ، 0.20 جم / لتر KH2HP04 ؛ 20.0جم / لتر جلوكوز) وقم بتعقيم المرشح باستخدام نظام مرشح فراغ. اصنع محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ عن طريق خلط جزء واحد من المخزن المؤقت لتخفيف تدرج الكثافة ووسائط تدرج الكثافة المكونة من 9 أجزاء. تخلط جيدا.
    9. اقلب واخلط كل أنبوب جيدا قبل إضافة محلول التدرج متساوي التوتر بنسبة 70٪ من المخزون. أدخل ماصة مصلية سعة 1 مل تحتوي على 1 مل من محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 70٪ في قاع الأنبوب. ببطء تحت 1 مل من الحل ، مع الحرص على عدم صنع فقاعات. قم بإزالة الماصة المصلية ببطء من الأنبوب ، مع الحرص على عدم إزعاج التدرج.
      ملاحظة: بالنسبة للطبقة السفلية بنسبة 70٪ ، يجب تخفيف محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ إلى 70٪ باستخدام وسائط RPMI (على سبيل المثال ، 7 مل من محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 100٪ و 3 مل من وسائط RPMI مختلطة جيدا). بالإضافة إلى ذلك ، يعد إنشاء طبقة أساسية نظيفة وغير مضطربة بنسبة 70٪ أمرا ضروريا لإزالة حطام المايلين وللحصول على معلقات نقية أحادية الخلية عند واجهة التدرج بعد الطرد المركزي.
    10. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية بدون فرامل. نضح المادة الطافية ، بما في ذلك طبقة حطام المايلين حتى يبقى 2-3 مل في الأنبوب ، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة الخلية. احصد طبقة الخلية بين تدرج الكثافة 30/70٪ باستخدام ماصة 1 مل وانقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.
    11. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، أضف وسائط RPMI 10٪ FCS لرفع الحجم النهائي إلى 15 مل. جهاز طرد مركزي 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: خلال هذه الخطوة ، يمكن تجميع طبقات الخلايا من أنبوبين إذا لزم الأمر. لا تجمع أكثر من أنبوبين وإلا فلن تتراكم الخلايا بسبب تركيز وسائط التدرج عالي الكثافة.
    12. نضح الطافع بعناية حتى لا يزعج بيليه الخلية. إعادة تعليق الخلايا في حجم / مخزن مؤقت مناسب لحساب الخلايا باستخدام مقياس الدم (على سبيل المثال ، إعادة تعليق الحبل الشوكي الفردي في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لتلطيخ سطح المصب) (الشكل 3).
    13. باستخدام ماصة سعة 1 مل ، انقل معلقات الخلية إلى أعلى أنبوب أعلى المرشح (جدول المواد) واسمح للخلايا بالتصفية إلى أسفل الأنبوب لإزالة أي حطام مايلين متبقي.
    14. باستخدام صبغة استبعاد التريبان الزرقاء ، قم بتخفيف الخلايا وحسابها على مقياس الدم عن طريق متوسط شبكتين مربعتين على الأقل من 16 دقة40,41.
    15. تابع تقنية تحليل الخلية الواحدة المطلوبة.
      ملاحظة: باستخدام أشكال مختلفة من الكولاجين (أي D ، النوع الأول ، النوع الثاني ، النوع الرابع) ، الخلايا المناعية ، الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 3) ، الخلايا النجمية ، الخلايا المحيطة ، الخلايا البطانية49 ، والخلايا العصبية50 يمكن عزلها بكفاءة. كان عدد الخلايا النواة التي تم الحصول عليها للنتائج على النحو التالي باستخدام إنزيم كولاجيناز I المعاير: الدماغ الكامل المعالج بالوهمية = 500000-600000 خلية. دماغ TMEV-IDD الكامل = 800000-1000000 خلية ؛ الحبل الشوكي الكامل المعالج بالوهمية = 150,000-200,000 خلية ؛ الحبل الشوكي الكامل TMEV-IDD = 300,000-400,000. سيختلف عدد الخلايا اعتمادا على دقة الجمع والمعالجة وما إذا كان التهاب الجهاز العصبي المركزي موجودا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هدفت هذه التجربة التمثيلية إلى تحديد كمية الخلايا البائية والتائية ووصف توطين الخلايا البائية والتائية في مقصورات الجهاز العصبي المركزي السحائية والمتني في ظروف الاستتباب وكذلك في نموذج MS التدريجي للفئران (أي TMEV-IDD). تم تحفيز TMEV-IDD في إناث الفئران SJL البالغة من العمر 5 أسابيع عن طريق العدوى داخل الجمجمة بوحدات تشكيل اللويحات 5 × 106 (PFU) من TMEV BeAn كما هو موضح سابقا29.

قيمت الدراسة الحالية الخلايا البائية والتائية في السحايا والدماغ والحبل الشوكي أثناء TMEV-IDD المزمن في اليوم 120 بعد الإصابة. تم استخدام الفئران المعالجة بالخداع المتطابقة مع العمر كعناصر تحكم. تألفت الدراسة من تجربتين. ركز الأول على الحصول على معلقات أحادية الخلية لتقييم التدفق الخلوي ، وهي تقنية راسخة لتحليل وقياس تكوين الخلية من خلال تقييم سطح الخلية و / أو المستضدات داخل الخلايا (n = 4 معالجة بالخداع ؛ n = 5 TMEV-IDD). ركزت التجربة الثانية على وصف توطين الخلايا البائية والتائية في حجرة الجهاز العصبي المركزي من خلال استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية على أنسجة الدماغ والحبل الشوكي منزوعة الكلس (ن = 3 معالجة وهمية ؛ ن = 8 TMEV-IDD).

بعد عزل معلقات الخلية الواحدة من الدماغ والحبل الشوكي والسحايا المجمعة (الدماغ والحبل الشوكي) من TMEV-IDD والفئران المعالجة بالوهمية ، تم تطبيق بروتوكول تلطيخ السطح على جميع العينات. لفترة وجيزة ، تم تحضين معلقات الخلية الواحدة بصبغة استبعاد قابلة للتثبيت (780) لمدة 15 دقيقة ، وغسلها ، وسدها بكتلة Fc في وجود مصل الفأر لمدة 15 دقيقة ، وملطخة بأجسام مضادة مترافقة لعلامات سطح الخلية ، بما في ذلك CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5)، CD19 (1D3; PE-CF594)، وCD4 (GK1.5; PE) لمدة 30 دقيقة كما هو موضح سابقا28,29. ثم تم غسل الخلايا وتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي28,29. تم إجراء بوابات الجدوى كما هو موضح سابقا28. تم تقييم تعبير CD45 لتمييز الخلايا المناعية المتسللة المشتقة من CD45 hi المحيطية (P1) من CD45lo microglia (P2) و CD45- الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن في الدماغ والحبل الشوكي (P3; الشكل 3 أ). في الفئران المعالجة بالوهمية ، كان هناك عدد قليل من خلايا CD45hi في الحبل الشوكي وأنسجة المخ. في السحايا ، تم تطبيق نفس قطع البوابات لتعبير CD45 hi المستخدم لبيانات الدماغ والحبل الشوكي لتحديدالخلايا المناعية CD45hi (P1; الشكل 3 ج) واستبعاد الخلايا غير المناعية الموجودة في السحايا (أي الخلايا الليفية والخلايا البطانية). في الفئران المعالجة بالوهمية ، كان هناك عدد قليلمن خلايا CD45 hi (<0.1٪) في السحايا. من بينالخلايا المناعية عالية CD45 في أنسجة الجهاز العصبي المركزي TMEV-IDD ، تم تحديد الخلايا البائية والخلايا التائية CD4 من خلال التعبير السطحي ل CD19 و CD4 ، على التوالي (الشكل 3B - D). في جميع أنسجة الجهاز العصبي المركزي TMEV-IDD ، لوحظت نسب متزايدة من الخلايا المناعية CD45hi مقارنة بالفئران المعالجة بالوهمية (الشكل 4A). خلال TMEV-IDD المزمن ، كانت النسبة المئوية للخلايا البائية بينالخلايا المناعية CD45 hi في الدماغ والحبل الشوكي أعلى مقارنة بالمقصورة السحائية (الشكل 4B).

لتحديد توطين الخلايا البائية والخلايا التائية داخل حجرة الجهاز العصبي المركزي أثناء TMEV-IDD المزمن ، تم تقييم الأدمغة منزوعة الكلس والحبل الشوكي باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية باستخدام بروتوكول التلوين الموصوف سابقا29. تم ترسيم السحايا والأوعية الدموية باستخدام laminin ، وهو مكون غشاء قاعدي29,51 و ER-TR7 ، علامة خلية شبكية للخلايا الليفية52,53. أثناء الاستخراج التقليدي للدماغ من غطاء الجمجمة ، كانت طبقة الحنون سليمة ، ولكن تم استبعاد الطبقات السحائية المتبقية (الشكل 5 أ). في الحبل الشوكي ، أدى البثق الهيدروليكي إلى عدم وجود جميع طبقات السحائية (البيانات غير معروضة). في كل من الأدمغة منزوعة الكلس والحبل الشوكي ، كانت جميع طبقات السحائية سليمة (الشكل 5 ب). لفحص توطين الخلايا البائية والتائية في TMEV-IDD المزمن ، تم استخدام تعبير IgG لتحديد توطين الخلايا البائية ذات النمطالمتماثل 29 ، وتم استخدام CD3 لتصور جميع الخلايا التائية29. كشف تلطيخ IgG مع ER-TR7 أن خلايا IgG + B ذات التبديل المتماثل كانت موجودة في حمة الجهاز العصبي المركزي والسحايا (الشكل 6A). احتوت المجاميع الخلوية داخل السحايا ER-TR7 + على خلايا IgG + B متعددة وخلايا CD3 + T (الشكل 6B).

تظهر النتائج التمثيلية نسبا عالية من كل من الخلايا البائية والخلايا التائية في المقصورات المتنية والسحائية في الفئران المزمنة TMEV-IDD على عكس الفئران المعالجة الوهمية المتطابقة مع العمر. أظهر تحليل IHC كذلك أنه في أنسجة TMEV-IDD ، كانت الخلايا البائية والخلايا التائية مشتتة في الحمة ، ولكنها كانت مرتبطة ارتباطا وثيقا في السحايا ، وشكلت مجاميع التهابية. في مرضى التصلب المتعدد التقدمي ، ترتبط المجاميع الالتهابية السحائية بإصابة الأنسجة المجاورة ونتائج المرض الأسوأ. في TMEV-IDD المزمن ، قد يترافق وجود الخلايا البائية والخلايا التائية المستمرة في حجرة الجهاز العصبي المركزي والتجميع في السحايا مع إصابة الأنسجة وتطور المرض. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم كيفية تأثير الالتهاب السحائي مقابل المتني على إزالة الميالين والتنكس العصبي والإعاقة السريرية.

Figure 1
الشكل 1: عزل الأدمغة والحبل الشوكي لإزالة الكلس. تشير الخطوط الزرقاء المنقطة إلى الجروح التي تم إجراؤها لعزل الدماغ بجمجمة سليمة (جروح 1-4) وعمود فقري (جروح 5-8). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: عزل الأدمغة والحبل الشوكي والسحايا لتقنيات الخلية الواحدة. (أ) تشير الخطوط الزرقاء المنقطة إلى الجروح التي تم إجراؤها لعزل غطاء الجمجمة مع السحايا والدماغ السليمين (الجروح 1-3) والعمود الفقري (الجروح 5-7). يتم إجراء قطع جانبي 3 على جانبي الجمجمة. (ب) يشير الخط الأزرق إلى الشق الذي تم إجراؤه لتسجيل وإزالة السحايا في غطاء الجمجمة والجروح التي تم إجراؤها في العمود الفقري (كلا الجانبين الجانبيين) لعزل الحبل الشوكي والسحايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد الخلايا المناعية المتسللة CD45 hi في أنسجة الجهاز العصبي المركزي. (أ) استراتيجية البوابات لتحديد الخلايا المناعية المتسللة CD45 hi (P1) ، و CD45lo microglia (P2) ، و CD45- oligodendrocytes ، الخلايا النجمية ، والخلايا العصبية بين إجمالي الخلايا الحية في الحبل الشوكي من الفئران المعالجة بالشام (الحمراء) أو TMEV-IDD (الزرقاء). تم الكشف عن الحد الأدنى من خلايا CD45hi في الأدمغة والحبل الشوكي المعالجين بالوهم. (ب) استراتيجية البوابات لتحديد خلايا CD19 + B وخلايا CD4 + T بين الخلايا المناعية المتسللة CD45 hi (P1) في فئران TMEV-IDD. كانت استراتيجيات البوابات متشابهة لأنسجة المخ والحبل الشوكي. (ج) استراتيجية البوابات لتحديد خلاياCD45 hi (P1) في السحايا للفئران المعالجة بالوهمية (الحمراء) والمزمنة TMEV-IDD (الأزرق). (د) استراتيجية البوابات لتحديد الخلايا البائية CD19 + والخلايا التائية CD4 + بين الخلايا المناعية المتسللة CD45 hi (P1) في سحايا الفئران TMEV-IDD المزمنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: زادتالخلايا المناعية CD45 hi والخلايا البائية CD19 + في أنسجة الجهاز العصبي المركزي في TMEV-IDD المزمن. تظهر ملخصات الرسوم البيانية الشريطية لبيانات قياس التدفق الخلوي التي تم الحصول عليها من السحايا والدماغ والحبل الشوكي المعالجة بالوهمية أو TMEV-IDD النسب المئوية للخلايا المناعية المتسللة CD45 hi (A) أو النسب المئوية لخلايا CD19 + B (B). بالنسبة لأنسجة TMEV-IDD ، تم الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي من خمسة فئران ، مع معالجة الحبل الشوكي والأدمغة بشكل فردي ، بينما تم تجميع السحايا للتحليل. بالنسبة للفئران المعالجة بالوهم، تم الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي من أربعة فئران، مع معالجة الحبل الشوكي والأدمغة بشكل فردي، في حين تم تجميع السحايا للتحليل. يتم عرض بيانات الحبل الشوكي والأدمغة كمتوسط ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: طبقات السحايا السليمة في الأدمغة والحبل الشوكي منزوع الكلس. (أ) تم تقييم الأدمغة المستخرجة من غطاء الجمجمة أو (ب) الأدمغة منزوعة الكلس مع الجماجم السليمة والأعمدة الفقرية من الفئران المزمنة TMEV-IDD ل DAPI (أزرق) ، وعلامات سحائية لامينين (أخضر) ، و ER-TR7 (أحمر). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: كان تراكم الخلايا المناعية واضحا في السحايا أثناء اضطرابات المفصل الفاوي طويل الأمد المزمنة (TMEV-IDD). (أ) تم فحص الأعمدة الفقرية منزوعة الكلسم من الفئران المزمنة TMEV-IDD لوجود IgG (أخضر) لتحديد الخلايا المناعية ذات النمط المتماثل في الحمة وفي السحايا ER-TR7 + (الأحمر). (B) تم تلطيخ الخلايا التائية CD3 + (الخضراء) والخلايا البائية ذات النمط المتماثل IgG + (الحمراء) مع السحايا ER-TR7 + لتقييم التوطين داخل أنسجة الحبل الشوكي. تبرز الأسهم البيضاء الخلايا البائية والتائية داخل السحايا. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. تحدد المربعات البيضاء المساحات المحددة للصور المقتصصة (يمين؛ شريط القياس = 10 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تعد طرق تقييم التركيب الخلوي في حجرة الجهاز العصبي المركزي أثناء التوازن والمرض ضرورية لفهم الحالات الفسيولوجية والمرضية للجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، على الرغم من أنها تعمل كحاجز مهم في الجهاز العصبي المركزي وتضم مجموعة متنوعة من الخلايا المناعية ، غالبا ما يتم حذف السحايا من التحليل لأن العديد من طرق استخراج الأنسجة التقليدية للدماغ والحبل الشوكي لا تسمح بجمع هذه الأغشية. هذا الإغفال هو قيد حاسم في تقدم فهمنا للتكوين الخلوي ووظيفة السحايا ودورها في الحالة المستقرة والظروف الالتهابية. كشفت الدراسات الحديثة أن كلا من الخلايا المناعية المقيمة والمشتقة من المحيط الموجودة في المقصورة السحائية تلعب دورا أساسيا في الحفاظ على التوازن في الجهاز العصبي المركزي ، وكذلك في دفع التسبب في أمراض الجهاز العصبي المركزي. تؤكد هذه الدراسات على الحاجة إلى تحليل ليس فقط المقصورة المتنية ولكن أيضا الطبقات السحائية المحيطة. تسمح البروتوكولات الموصوفة هنا بالعزل السريع للدماغ والحبل الشوكي مع الحفاظ على السحايا ، مما يتيح في النهاية إجراء تحليل شامل لحجرة الجهاز العصبي المركزي باستخدام كل من الدراسات النسيجية وأحادية الخلية. تركز النتائج التمثيلية على تقييم الخلايا المناعية في حجرة الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، يمكن تكييف البروتوكولات لتحليل الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا النجمية أو الخلايا العصبية أو الخلايا المحيطة أو الخلايا البطانية أو الخلايا المقيمة الأخرى في الجهاز العصبي المركزي.

تتمثل الخطوة الحاسمة في الطرق الموصوفة في الاستخراج الدقيق للأنسجة ، وهو أمر ضروري لعزل معلقات الخلية الواحدة النقية من الدماغ والحبل الشوكي والسحايا وللحصول على أنسجة الجهاز العصبي المركزي إما بجماجم سليمة أو أعمدة فقرية ، مما يسمح بمورفولوجيا الأنسجة عالية الجودة. إن ممارسة تقنية الحصول على معلقات أحادية الخلية هي مفتاح استخراج الأنسجة بنجاح لأنها لن تعزز نقاء العينة فحسب ، بل ستحسن أيضا إنتاجية الخلايا للتطبيقات النهائية. وبالمثل ، فإن الممارسة في عزل أنسجة الجهاز العصبي المركزي ذات الجماجم السليمة أو الأعمدة الفقرية لإزالة الأنسجة الزائدة المحيطة بالعظام بشكل كاف هي خطوة أساسية تضمن تثبيتا أفضل للأنسجة وإزالة الكلس والحفظ بالتبريد ، وكلها مكونات حاسمة للحصول على أقسام الأنسجة ذات التشكل عالي الجودة وأهداف المستضد السليمة.

أحد قيود بروتوكولنا لعزل المعلقات أحادية الخلية من السحايا هو أنه يركز على الحصول على السحايا الجافية والعنكبوتية32,54 مع حذف عزل الحنون ، الذي يظل مرتبطا بالدماغ أو الحبل الشوكي عبر عمليات الخلايا النجمية. على الرغم من أن الخلايا الموجودة في الأم الحنون هي عنصر أساسي في المقصورة السحائية ، فقد تقرر استبعاد الأم الحنون أثناء إعداد تعليق الخلية الواحدة بسبب مقدار الوقت الطويل اللازم لعزلهابشكل كاف 55. وبالمثل ، يركز البروتوكول فقط على الحصول على السحايا في الجزء العلوي من الجمجمة ويستبعد عزل السحايا الغازية في الدماغ والضفيرة المشيمية. يمكن إجراء جمع السحايا الغازية والضفيرة المشيمية وفقا للبروتوكولات المنشورة سابقا55 ، على الرغم من أنها تستغرق وقتا طويلا. في كلتا الحالتين ، كان اختيار حذف جزء من الطبقات السحائية بسبب مقدار الوقت الذي يتطلبه عزلها. يعد توقيت البروتوكول المستخدم لإعداد المعلقات أحادية الخلية المطلوبة للتطبيقات النهائية مثل قياس التدفق الخلوي ومقايسات زراعة الخلايا وتسلسل الحمض النووي الريبي (RNAseq) أمرا بالغ الأهمية لتحسين صلاحية الخلية وجودة البيانات. لذلك ، اعتمادا على سؤال البحث المحدد ، يجب تحقيق توازن بين وقت عزل العينة والدقة في استخراج السحايا. في البروتوكول الحالي ، يتم الحصول فقط على مستحضرات تعليق خلية واحدة من السحايا الجافية والعنكبوتية ، مما يحد من القدرة على استقراء النتائج لكامل سحايا الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، إذا تم استخدام هذه الطرق بالاقتران مع تحليل IHC أو ISH لأقسام الأنسجة الكاملة مع الطبقات الثلاث من السحايا ، يمكن اكتساب فهم أكثر شمولا للديناميكيات الخلوية والجزيئية في المقصورات المتنية والسحائية.

هناك قيد آخر للبروتوكول وهو انخفاض عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من السحايا الجافية والعنكبوتية ، خاصة أثناء ظروف الاستتباب. ومع ذلك ، إذا تم اعتبار أعداد الخلايا في الحبل الشوكي أو الدماغ أو السحايا منخفضة جدا لتحليل مجموعة خلايا مستهدفة معينة ، فيمكن تحديد الحد الأدنى لعدد الخلايا المطلوب لهذا التحليل عن طريق تقدير العدد الإجمالي للأحداث المطلوبة لدقة معينة (على سبيل المثال ، معامل الاختلاف بنسبة 5٪) كما هو موضح في الأدبيات السابقة المتخصصة في تحليل الأحداث النادرة56. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الحسابات لتحديد ما إذا كان يجب تجميع عينات من متعددة من أجل الحصول على أعداد خلايا كافية لتحليل عدد الخلايا محل الاهتمام.

توفر الطرق الموصوفة تقدما أساسيا في التحقيق في الديناميات الخلوية داخل حجرة الجهاز العصبي المركزي من خلال توسيع التحليلات لتشمل المقصورة السحائية المهملة بشكل شائع. تسمح هذه البروتوكولات بالاستخراج الفردي للدماغ والحبل الشوكي والسحايا الجافية والعنكبوتية لتوليد معلقات أحادية الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح بروتوكول إزالة الكلس بالتحليلات النسيجية لأقسام الأنسجة التي تتكون من أنسجة الدماغ أو الحبل الشوكي بما في ذلك الطبقات السحائية الثلاث. يوفر استخدام EDTA عملية إزالة الكلس بطيئة ولكن لطيفة ، وهو الأنسب للعينات التي تتطلب مورفولوجيا أنسجة عالية الجودة (على سبيل المثال ، IHC و ISH). يستخدم البروتوكول درجة حموضة تتراوح بين 7.2 و 7.4 لإبطاء معدل إزالة الكلس وضمان الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة السليمة ، وهي ميزة واضحة على الأحماض القوية والضعيفة (على سبيل المثال ، حمض الهيدروكلوريك وحمض ثلاثي كلورو أسيتيك) ، والتي لها وقت أقصر لإزالة الكلس ، ولكنها تؤثر على جودة مورفولوجيا الأنسجة.

يجب أن تركز الطرق المستقبلية التي تسعى إلى عزل معلقات الخلية الواحدة من السحايا على تطوير بروتوكولات لتقصير الوقت اللازم لعزل طبقة البيلة تماما عن أنسجة الجهاز العصبي المركزي والسحايا الغازية في الدماغ. لن يؤدي الحصول على المركب الكامل للطبقات السحائية الثلاث إلى زيادة عدد الخلايا لأي تحليل فحسب ، بل سيوفر أيضا تقييما أكثر شمولا للخلايا المناعية المقيمة والمتسللة التي تحتل السحايا ، والتي تحيط بالجهاز العصبي المركزي. في الوقت نفسه ، يجب أن تسعى البروتوكولات المستقبلية التي تركز على تحضير الأدمغة والحبل الشوكي منزوع الكلس إلى تحديد عوامل جديدة تهدف إلى تسريع إزالة الكلس من الأنسجة مع الحفاظ على جودة مورفولوجيا الأنسجة. ومع ذلك ، إجمالا ، يمكن أن توفر التطبيقات النهائية التي تحلل معلقات الخلية المفردة للجهاز العصبي المركزي بما في ذلك السحايا المزدوجة والعنكبوتية ، والتي يتم إجراؤها بالاقتران مع تحليل شامل لقسم الأنسجة ، فهما مفصلا للنمط الظاهري للخلية ووظيفتها وتوطينها داخل حجرة الجهاز العصبي المركزي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون موظفي مركز الطب المقارن والبحوث (CCMR) في دارتموث على رعايتهم الخبيرة للفئران المستخدمة في هذه الدراسات. قام صندوق بورنشتاين للأبحاث بتمويل هذا البحث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, Pt 10 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, Pt 9 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019).
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 159، السحايا، الجهاز العصبي المركزي، إزالة الكلس، الكيمياء الهيستولوجية المناعية، تعليق الخلية الواحدة، الخلايا المناعية، الفئران
عزل أنسجة الجهاز العصبي المركزي والسحايا المرتبطة به لتحليل المصب للخلايا المناعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, … More

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter