Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

Bu makale, beyin, omurilik ve meninksler dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi içindeki yerleşik ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerini incelemek için optimize edilmiş iki protokol sunmaktadır. Bu protokollerin her biri, kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında bu bölmeleri işgal eden hücrelerin işlevini ve bileşimini belirlemeye yardımcı olur.

Abstract

Merkezi sinir sistemi (MSS) beyin ve omurilikten oluşur ve çevre ile CNS arasında bir bariyer görevi gören zarlı tabakalar olan meninksler tarafından sarılır. CNS, immünolojik olarak uzmanlaşmış bir bölgedir ve kararlı durum koşullarında, bağışıklık ayrıcalığı en çok CNS parankiminde belirgindir. Buna karşılık, meninksler, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çok çeşitli yerleşik hücreler barındırır. CNS hasarı, otoimmünite, enfeksiyon ve hatta nörodejenerasyon ile tetiklenen enflamatuar durumlar sırasında, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri parankima girebilir ve meninksler içinde ikamet edebilir. Bu hücrelerin CNS hastalığı patogenezi sırasında hem yararlı hem de zararlı eylemler gerçekleştirdiği düşünülmektedir. Bu bilgiye rağmen, CNS bölmesini analiz ederken meninksler genellikle göz ardı edilir, çünkü geleneksel CNS doku ekstraksiyon yöntemleri meningeal tabakaları atlar. Bu protokol, tek hücreli teknikler, immünohistokimya ve in situ hibridizasyon yöntemleri ile aşağı akış analizi için uygun olan murin CNS dokularının (yani beyin, omurilik ve meninksler) hızlı izolasyonu için iki farklı yöntem sunar. Açıklanan yöntemler, homeostatik koşullar altında ve hastalık patogenezi sırasında CNS bölmesini işgal eden hücrelerin fenotipini, işlevini ve lokalizasyonunu değerlendirmek için ideal olan CNS dokularının kapsamlı bir analizini sağlar.

Introduction

Merkezi sinir sistemi (CNS) immünolojik olarak özelleşmiş bir bölgedir. CNS parankimi, BOS boşluğu, meninksler ve vaskülatür hariç, klasik olarak bağışıklık ayrıcalıklı bir bölge 1,2,3,4,5 olarak görülür ve homeostatik koşullar 2,6,7 sırasında nispeten bağışıklık hücrelerinden yoksundur. Buna karşılık, dura, araknoid ve pia tabakalarından oluşan meninksler, hastalık patogenezisırasında homeostatik immün sürveyans ve enflamatuar süreçlere aktif olarak katılan CNS bölmesinin önemli bileşenleridir 3,6,7,8. Kararlı durum koşulları sırasında, meninksler, doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC), makrofajlar, dendritik hücreler (DC), mast hücreleri, T hücreleri ve daha az ölçüde B hücreleri 9,10,11 dahil olmak üzere çok sayıda immün sentinel hücreyi destekler.

Meninksler oldukça vaskülarize yapılardır ve CNS ile çevresi arasında lenfatik bir bağlantı sağlayan lenfatik damarlar içerir 8,12,13,14. CNS hasarı, enfeksiyonlar, otoimmünite ve hatta nörodejenerasyonun neden olduğu enflamatuar durumlarda, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri parankimmaya sızar ve meninksler içindeki bağışıklık manzarasını değiştirir. Hücre infiltrasyonunu takiben, meninksler, periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücreleri için fonksiyonel bir nişi temsil edebilir, bağışıklık hücresi agregasyonunu, lokal bağışıklık hücresi aktivasyonunu ve CNS bölmesinde uzun süreli sağkalımı teşvik edebilir. Multipl skleroz (MS) dahil olmak üzere CNS'yi etkileyen birçok hastalıkta belirgin meningeal inflamasyon gözlenir.15,16,17,18,19, inme 20,21, steril yaralanma 22,23 (yani, omurilik yaralanması ve travmatik beyin hasarı), migren 24 ve mikrobiyal enfeksiyon 25,26,27,28,29. Bu nedenle, meningeal kompartmandaki yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş immün hücrelerin karakterizasyonu, bu hücrelerin kararlı durum koşulları ve hastalık patogenezi sırasındaki rolünü anlamak için gereklidir.

Kafatası ve omur gövdelerinden beyin, omurilik ve meninkslerin çıkarılması teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. Şu anda, üç meningeal tabakanın tümü bozulmadan beynin hızlı bir şekilde çıkarılması için herhangi bir teknik bulunmamaktadır. Laminektomi mükemmel omurilik dokusu morfolojisi sağlarken ve meningeal tabakaları korurken, hem son derece zaman alıcı hem de karmaşıktır30,31. Tersine, beynin kafatasından çıkarılması ve omuriliğin hidrolik ekstrüzyonu gibi daha geleneksel ekstraksiyon yöntemleri, CNS dokusunun hızlı bir şekilde çıkarılmasını kolaylaştırır, ancak bu tekniklerle hem araknoid hem de dural meninksler kaybolur30,31. Beyin ve omurilik dokularının konvansiyonel izolasyonu sırasında dura ve araknoid tabakaların ihmal edilmesi, CNS bölmesindeki hücrelerin eksik bir analizine neden olur. Bu nedenle, sağlam meninksli CNS dokularının hızlı ekstraksiyonuna odaklanan yeni tekniklerin tanımlanması, CNS bölmesinin optimal analizi için çok önemlidir.

Bu el yazması, farelerden beyin, omurilik ve meninkslerin hızlı bir şekilde çıkarılması için iki yöntem sunarak, CNS parankimi ve meninkslerinde yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerinin aşağı akış analizini kolaylaştırır. Bu optimize edilmiş protokoller, 1) aşağı akış analizi için tek hücreli süspansiyonların izole edilmesine ve 2) dokuların histolojik işleme için hazırlanmasına odaklanır. Beyinden, omurilik dokusundan ve dural ve araknoid meninkslerden tek hücreli süspansiyonların elde edilmesi32, hem parankimal hem de meningeal bölmelerde bulunan hücrelerin aynı anda analizine izin verir. Tek hücreli süspansiyonlar, in vitro stimülasyon 33, enzime bağlı immünospot (ELISpot)28,34,35, akış sitometrisi 36,33 ve tek hücreli 37 veya toplu transkriptomik gerçekleştirmek için hücre kültürü testleri dahil olmak üzere farklı uygulamalarda kullanılabilir. Ek olarak, sırasıyla sağlam kafatasları veya vertebral sütunlarla tüm beyinlerin ve omuriliklerin dekalsifikasyonu için optimize edilmiş protokol, meninksleri sağlam bırakarak ve doku morfolojisini koruyarak çevredeki kemiğin nazikçe dekalsifikasyonuna izin verir. Bu yöntem, hem parankimal hem de meningeal boşluklarda immünohistokimya (IHC) veya in situ hibridizasyon (ISH) teknikleri kullanılarak proteinlerin veya RNA'nın seçici olarak tanımlanmasına izin verir. CNS içindeki yerleşik hücrelerin ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerinin fenotipinin, aktivasyon durumunun ve lokalizasyonunun karakterizasyonu, CNS bölmesindeki bireysel hücre tiplerinin homeostaz ve hastalık patogenezine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için gerekli bilgileri sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları, Dartmouth'daki Geisel Tıp Okulu'ndaki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilen ve onaylanan protokolleri kullanır.

1. Dekalsifikasyon için beyin ve omurilik örneklerinin işlenmesi

  1. Beyin ve omurilik örneklerinin izole edilmesi
    1. Fareyi CO2 inhalasyonu yoluyla ötenazi yapın. CO2 akış hızının dakikada kafes hacminin %10-30'unu değiştirdiğinden emin olun.
    2. Forseps kullanarak, ksifoid işlemini kaldırın ve karın duvarını göğüs kafesinin hemen altında yanal olarak makasla kesin, alttaki kan damarlarını veya organları kesmemek için yukarı çekin. Diyaframı yanal olarak kesin.
    3. Göğüs kafesini köprücük kemiğine kadar akciğerlere paralel yan kenarlar boyunca kesin. Forseps kullanarak sternumu kaldırın ve sternumu bir hemostat ile sıkıştırın. Göğüs kafesini kaldırmak ve kalbi açığa çıkarmak için kanama durdurucuyu başın üzerine yerleştirin.
    4. Forseps kullanarak, kalbi tepesine yakın bir yerde kavrayın ve bir çıkış sağlamak için kalbin sağ atriyumunda bir kesi yapın. Fareyi transkardiyal olarak perfüze etmek için sol ventriküle 10 mL buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) yavaşça uygulamak için 10 mL şırınga takılı 25 G'lik bir iğne yerleştirin.
      NOT: Perfüzyon, karaciğer kandan temizlenene kadar 4-5 dakika içinde gerçekleşmelidir. Perfüzyon için genellikle toplam 10 mL 1x PBS yeterlidir, ancak gerekirse daha fazlası kullanılabilir. Berrak bir karaciğer genellikle yeterli perfüzyonu gösterir.
    5. Keskin bir makas kullanarak, kafayı keserek çıkarın (Şekil 1; 1). Deride orta hat kesisi yapın (Şekil 1; 2) ve kafatasını serbest bırakmak için cildi gözlerin üzerine çevirin.
    6. Mandibulayı kafatasından ayırmak için burun kemiğinden kesin (Şekil 1; 3). Mandibulayı, dili ve gözleri çıkarın. Dış işitsel meatus boyunca dokuyu serbest bırakmak için kafatasının lateral yönleri boyunca kesin (Şekil 1; 4). Kafatasını kaplayan tüm fazla deri, kas ve dokuyu çıkarmak için kesin.
    7. Keskin makasla omurgaya paralel keserek göğüs kafesini omurgadan ayırın (Şekil 1; 5 ve 6). Omurgayı izole etmek için alt bel bölgesinde küçük bir kesi yapın (Şekil 1; 7). Omurları ortaya çıkarmak için omurga boyunca kalan kasları kesin ve çıkarın (Şekil 1; 8).
      NOT: Fiksatif paraformaldehit (PFA) ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) dekalsifikasyon tamponunun yeterli penetrasyonunu elde etmek için omurga ve kafatasından fazla dokunun çıkarılması gereklidir.
  2. Fiksasyon sonrası, dekalsifikasyon ve kriyoprezervasyon
    1. Forseps kullanarak, beyni sağlam kafatası veya omurilik ile 10 mL% 4 PFA içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Yeterli sabitleme için tüpleri en az 48 saat boyunca 4 °C'ye yerleştirin.
      NOT: Dokunun aşırı sabitlenmesini önlemek için, 72 saatlik fiksasyonu aşmayın. Dekalsifikasyondan önce kemik örnekleri için fiksasyon süreleri uzar. Yeterli fiksasyon, dokuyu dekalsifikasyonun etkilerinden koruyacak ve daha iyi doku morfolojisi sağlayacaktır.
    2. Dokuyu forseps ile% 4 PFA'dan çıkararak ve dokuyu 5 dakika boyunca 10 mL 1x PBS ile tek kullanımlık 14 mL'lik bir tüpe yerleştirerek beyni veya omuriliği durulayın. Beyni veya omuriliği 10 mL% 10 EDTA (pH = 7.2-7.4) içeren 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
      NOT: 10 mL EDTA'lı daha büyük bir tüp kullanmak, EDTA'ya doku ile daha büyük bir temas alanı sağlar ve dekalsifikasyon sürecini hızlandırır.
    3. Kemiğin yumuşak ve esnek olup olmadığını günlük olarak kontrol edin: dokuyu EDTA solüsyonundan forseps ile çıkarın, bir Petri kabına yerleştirin ve kemik yumuşaklığını 25 G'lik bir iğne ile nazikçe test edin. İğne kemiğe kolayca nüfuz ederse, dekalsifikasyon işlemi tamamlanmıştır.
    4. Dokuyu EDTA solüsyonundan çıkarın ve beyni veya omuriliği 10 mL 1x PBS içeren 14 mL'lik tek kullanımlık bir tüpe aktarın ve 10 dakika yıkayın. Yıkamayı tekrarlayın.
      NOT: Dekalsifikasyon genellikle 2-3 gün sürer. Kemik henüz yeterince kireçten arındırılmamışsa, çözelti her 2-3 günde bir değiştirilmelidir. Bununla birlikte, kemik dekalsifiye edildikten sonra EDTA'da uzun süreli inkübasyon, doku morfolojisine zarar verebilir.
    5. 1x PBS'ye sükroz ekleyerek %10, %20 ve %30 sükroz çözeltileri hazırlayın. Örneğin,% 10 sükroz için 10 g sükroz ekleyin ve steril 1x PBS kullanarak hacmi 100 mL'ye getirin. Solüsyonu 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
      NOT: Sükroz çözeltileri mikroorganizma büyümesine eğilimlidir, bu nedenle numuneler bu çözeltilerde uzun süre saklanmamalıdır.
    6. Dokuyu 1x PBS'den çıkarın, 10 mL% 10 sükroz çözeltisine koyun ve 4 ° C'de saklayın. Dokuyu 24 saat veya tüpün dibine batana kadar bekletin.
    7. Dokuyu önce %20 sükroz çözeltisine ve son olarak %30 sükroz çözeltisine taşıyarak bu işlemi tekrarlayın. Dokunun %30 sükroz (en az 24 saat) içinde batmasına izin verin ve doku gömmeye devam edin.
  3. Doku gömme ve dondurma
    1. Forseps kullanarak, dokuyu %30 sükrozdan çıkarın, bir Petri kabına yerleştirin ve doku üzerindeki fazla sükroz çözeltisinden kurtulmak için tabağı eğin. Bir neşter kullanarak, dokuyu istenen parçalara kesin.
    2. Kriyokalıbın dibinde ince bir optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği tabakası oluşturun ve doku parçalarını/parçalarını kalıba yerleştirin. Dokuyu tamamen OCT bileşiği ile kaplayın ve kabarcık olmadığından emin olun.
    3. Sıvı nitrojen38 üzerine gelerek veya blokları blok opak olana kadar %100 izopropanol/kuru buz bulamacı39 üzerine yerleştirerek blokları hızlı bir şekilde dondurun. Kriyokalıpları alüminyum folyoya sarın ve uzun süreli saklama için blokları -80 °C'de saklayın. Kesitlerden önce blokları -20 °C'ye taşıyın.
      NOT: Bölümler kabaca ele alınırsa kafatası ve meningeal tabakalar kaybolabileceğinden, kalsifiye beyinlerde histoloji protokollerini kesitlerken ve uygularken dikkatli olunmalıdır.

2. Akım sitometri boyaması için meninkslerin ve CNS dokularının hazırlanması

  1. Kafatası kapağının ve beynin çıkarılması
    1. Keskin makas kullanarak kafayı keserek çıkarın (Şekil 2A; 1). Makas kullanarak ciltte orta hat kesisi yapın (Şekil 2A; 2) ve kafatasını serbest bırakmak için cildi gözlerin üzerine çevirin.
    2. Makası foramen magnanın içine yerleştirin ve kafatasını korteksler boyunca koku soğancığına doğru yanal olarak kesmeye başlayın, kesileri dış işitsel meatus ve mandibulanın üzerinde tutun (Şekil 2A; 3). Kafatası kapağını beyinden kurtarmak için koku soğancığında buluşan kesiklerle aynı kesikleri karşı tarafta gerçekleştirin (Şekil 2A; 3).
    3. Forseps kullanarak, kafatası kapağını geri soyun ve kafatası kapağını, 25 mM HEPES ile desteklenmiş 5 mL soğuk RPMI ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Tüpü buz üzerinde tutun.
    4. Kavisli forseps kullanarak, forsepsleri beynin tabanının altına yerleştirin ve beyni kafatası kapağından kurtarmak için kaldırın. Beyni, 25 mM HEPES ile desteklenmiş 5 mL soğuk RPMI içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. İşlenene kadar tüpü buz üzerinde tutun.
  2. Omurga ve omurilik dokusunun çıkarılması
    1. Forseps ve keskin makas kullanarak omurgaya paralel keserek göğüs kafesini omurgadan ayırın (Şekil 2A; 4 ve 5). Vertebral kolonu izole etmek için alt bel bölgesinde küçük bir kesi yapın (Şekil 2A; 6). Omurları ortaya çıkarmak için omurga boyunca kalan kasları kesin ve çıkarın (Şekil 2A; 7).
    2. Ekstra ince cerrahi makası omur kolonunun içine yerleştirin ve kolonun yan kenarı boyunca kesin (Şekil 2C). Vertebral kolonu ön ve arka kısma bölmek için karşı yan kenarı tamamen kesin.
      NOT: Omurilik, vertebral kolona bağlı kalacaktır.
    3. Forseps kullanarak, omuriliği vertebral kolondan yavaşça ve dikkatlice soyun ve dokuyu 25 mM HEPES ile 5 mL soğuk RPMI içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Omurganın ön ve arka kısımlarını 25 mM HEPES ile 5 mL soğuk RPMI içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  3. Tek hücreli süspansiyonları hazırlamak için meninkslerin çıkarılması
    1. Forseps kullanarak, kafatası kapağını RPMI ortamından çıkarın. Keskin forseps kullanma (#7 forseps; Malzeme Tablosu), kafatası başlığının dış kenarını çizin (Şekil 2B) ve meninksleri kafatası kapağının kenarından soyun, dural ve araknoid meninksleri çıkarmak için kazıyın. Meninksleri bir Petri kabına yerleştirin.
      NOT: Meninkslerin hem beyinden hem de omurilikten çıkarılması pratik gerektirir. Kullanıcı meninksleri çıkarmakta zorluk çekiyorsa, çıkarmaya yardımcı olması için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
    2. Vertebral kolonu tüpten çıkarın. Keskin forseps kullanarak, meninksleri serbest bırakmak için vertebral kolonun kenarlarından çile atın ve kavisli forseps kullanarak meninksleri omurun kenarından soyun. Meninksleri bir Petri kabına yerleştirin.
    3. 50 mL'lik konik bir tüpe naylon ağ süzgeci yerleştirin. Meninksleri süzgecin içine taşıyın ve 25 mM HEPES ile desteklenmiş 3 mL RPMI ekleyin. 5 mL'lik bir şırıngadaki pistonu kullanarak, dokuyu ve ortamı süzgeçten geçirin.
    4. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, tüm görünür doku süzgeçten geçene kadar süzgeci 2 ila 3 mL ek RPMI/HEPES ortamı ile yıkayın.
      NOT: Akış sitometrik analizi için yeterli hücre sayısı elde etmek için, birden fazla hayvandan alınan meninkslerin bir araya getirilmesi gerekebilir. Bu deneyde (Şekil 3 ve Şekil 4), 4-5 farenin beyin ve omurilik meninksleri bir araya getirildi. Numuneler bir araya getirilirse, dokunun aşırı ısınmasını önlemek için dokuyu naylon ağ süzgecinden öğütmek için ek ortam gerekecektir.
    5. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, hücreleri ve ortamı 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, kalan hücreleri toplamak için 50 mL'lik konik tüpü 5 mL ortamla yıkayın. Hücreleri peletlemek için 450 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
    6. Vakumlu bir Pasteur pipeti kullanarak, hücre peletinden kaçınmaya ve hücreleri uygun bir hacim ve tamponda yeniden süspanse etmeye dikkat ederek süpernatanı aspire edin.
    7. Tek hücreli süspansiyonu saymak için, tripan mavisi dışlama boyası (1:10 seyreltme) ve RPMI kullanarak hücrelerin küçük bir hacmini (yani 5-10 μL) seyreltin. Hemositometreye 10 μL seyreltme ekleyin.
    8. Hücreleri daha önce açıklandığı gibisayın 40,41, doğruluk için en az iki 16 kare ızgaranın ortalamasını alın.
      NOT: Şekil 3'te, örneğin, meninkslerden havuzlanmış, peletlenmiş hücreler, aşağı akış yüzey boyama için 250 μL floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponunda (% 1 FBS ile 1x PBS) yeniden süspanse edildi. Hücreler sayım için 1:10 oranında seyreltildi (5 μL hücre, 5 μL tripan mavisi, 40 μL RPMI). Bu seyreltme, 16 kare ızgara başına 50-100 hücre arasında sonuç verdi ve hücreler ne çok yoğun ve üst üste binen ne de çok seyrek olduğu için daha doğru hücre sayımı sağladı. Fare başına havuzlanmış beyin ve omurilik meninkslerinden elde edilen çekirdekli hücre sayıları aşağıdaki gibidir: Sahte tedavi farelerinden alınan meninksler için = 100.000-150.000 hücre ve Theiler'in murin ensefalomiyelit virüsüne bağlı demiyelinizan hastalıktan (TMEV-IDD) meninksler için fareler = 300.000-350.000 hücre. Hücre sayımları, toplama, işleme ve meningeal inflamasyonun mevcut olup olmadığına bağlı olarak değişecektir.
    9. FACS yüzeyi (Şekil 3)14,36,42,43,44, hücre içi boyama protokolleri 33,45, in vitro stimülasyon, hücre kültürü deneyleri 33,46,47, ELISPOT testi 28,34,35 ve toplu veya tek hücreli gibi istenen tek hücreli tekniğe geçin transkriptomik 37,48.
      NOT: İşlem adımları arasında tüm tüpleri buz üzerinde tutun.
  4. Beyin ve omurilik dokusunun tek hücreli süspansiyonlarının hazırlanması
    1. Beyin veya omurilik dokusunu besiyeri ile birlikte 100 mm'lik Petri kabının tepesine, doku ve besiyerini tüpten dökerek aktarın. Forseps kullanarak, dokuyu Petri kabının dibine taşıyın. Beyni veya omuriliği steril bir tıraş bıçağıyla ince bir şekilde kıyın. Jiletli bıçağı kullanarak, dokuyu toplamak için kıyılmış mendili kazıyarak plakanın dibine taşıyın.
      NOT: Aşağıdaki enzimatik sindirim protokolü için, en fazla iki omurilik işlenmek üzere bir araya getirilebilir. Beyinler ayrı ayrı işlenmelidir.
    2. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, Petri kabına %10 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş 3 mL RPMI ekleyin. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, ortamdaki dokuyu yeniden süspanse etmek ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
      NOT: Aşağı akış uygulaması tek hücreli veya toplu RNA dizileme analizi veya hücre kültürü ise, hücrelerin analizden önce aktive edilmediğinden emin olmak için FCS lotları test edilmelidir. Alternatif olarak, hücreler %10 FCS'li RPMI yerine %0,04 BSA'lı 1x PBS kullanılarak işlenebilir.
    3. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, kalan dokuyu toplamak için Petri kabını ek 2 mL ortamla yıkayın ve toplam 5 mL hacim için konik bir tüpe aktarın. İşlem adımları arasında tüpleri buz üzerinde tutun.
    4. Bir pipet kullanarak, istenen konsantrasyonu (yani 100 mg / mL) elde etmek için Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ortamında kollajenaz I tozunu yeniden süspanse edin. İstenen nihai konsantrasyonu elde etmek için kıyılmış doku örneğini içeren konik tüpe kollajenaz tip I ekleyin (ör., 1 mg / mL için 50 μL).
      NOT: Daha yüksek kollajenaz konsantrasyonları hücre verimini artıracaktır ancak hücre yüzeyi belirteçlerini parçalayabilir. Bu nedenle, gerekli tüm hücre yüzeyi belirteçleri bozulmadan en yüksek sayıda canlı hücre elde etmek için gereken optimal konsantrasyonu belirlemek için kollajenaz I lotları titre edilmelidir. Örneğin, kollajenaz I, tek beyin veya omurilik örneklerinde 0.5 mg / mL, 1 mg / mL ve 2 mg / mL'lik nihai konsantrasyonlarda test edildi. Hücre canlılığı, tripan mavisi dışlama yöntemi kullanılarak belirlendi ve hücre yüzey belirteçleri CD45, CD19 ve CD4, akış sitometrisi ile değerlendirildi. 1 mg / mL kollajenaz konsantrasyonu, ilgilenilen tüm hücre yüzeyi belirteçlerini korurken en yüksek canlı hücre sayısını verdi. Bu nedenle, bu konsantrasyon, bu hücre tiplerini inceleyen daha ileri deneyler için kullanıldı.
    5. DNase I tozunu 0.15 M sodyum klorür kullanarak istenen stok konsantrasyonuna kadar nazikçe yeniden süspanse edin. 20 U/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için yeniden süspanse edilmiş DNaz I'i kıyılmış doku örneğini içeren konik tüpe ekleyin.
      NOT: DNaz I lotları, mL başına aktivite birimlerine göre değişir. Doku örneğine eklenecek konsantrasyon, stok şişesinin mililitre başına aktivite birimlerine bağlı olarak değişecektir. Numune başına istenen nihai konsantrasyon 20 U/mL'dir.
    6. Tüpleri 37 °C su banyosunda bir tüp rafına yerleştirin ve 40 dakika inkübe edin. Dokuyu enzimlerle iyice karıştırmak için tüpleri her 15 dakikada bir ters çevirin. İnkübasyondan sonra, 0.01 M EDTA'lık bir nihai konsantrasyon için her tüpe 500 μL 0.1 M EDTA (pH = 7.2) ekleyin ve kollajenazı etkisiz hale getirmek için 5 dakika daha inkübe edin.
    7. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, her tüpün hacmini ~ 14.5 mL'ye getirmek için her tüpe% 10 FCS ile desteklenmiş 9 mL RPMI ekleyin. 450 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Vakumlu bir Pasteur pipeti kullanarak, hücre peletine dokunmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire edin.
    8. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, hücre peletini içeren tüpe 3 mL% 100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, nihai hacmi 10 mL'ye getirmek için ek RPMI %10 FCS ortamı ekleyin ve %30'luk bir stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi katmanı oluşturmak için hücre peletini yeniden süspanse edin.
      NOT: %100 stok izotonik yoğunluk gradyan ortamını önceden hazırlayın, alikot yapın ve 4 aya kadar 3 °C'de saklayın. %100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisini hazırlamak için, yoğunluk gradyan ortamını (Malzeme Tablosu) yoğunluk gradyan medya seyreltme tamponu ile seyreltin. Yoğunluk gradyanlı ortam seyreltme tamponunu (80,0 g/L NaCl, 3,0 g/L KCl; 0,73 g/L Na2HP0 4, 0,20 g/L KH2HP04; 20,0 g/L glikoz) hazırlayın ve bir vakum filtre sistemi kullanarak filtreyle sterilize edin. 1 kısım yoğunluk gradyan seyreltme tamponu ve 9 kısım yoğunluk gradyan ortamını karıştırarak %100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisini yapın. İyice karıştırın.
    9. %70 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi altlığını eklemeden önce her bir tüpü ters çevirin ve iyice karıştırın. Tüpün dibine 1 mL% 70 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi içeren 1 mL'lik bir serolojik pipet yerleştirin. Kabarcık yapmamaya dikkat ederek 1 mL çözeltinin altına yavaşça yerleştirin. Serolojik pipeti yavaşça tüpten çıkarın, gradyanı bozmamaya dikkat edin.
      NOT: %70 altlık için, %100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi, RPMI ortamı kullanılarak %70'e seyreltilmelidir (yani, 7 mL %100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi ve 3 mL RPMI ortamı iyice karıştırılır). Ek olarak, miyelin kalıntılarının uzaklaştırılması ve santrifüjlemeyi takiben gradyan arayüzünde saf tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için temiz, bozulmamış %70'lik bir altlık oluşturmak çok önemlidir.
    10. 800 x g'da 4 °C'de frensiz 30 dakika santrifüjleyin. Miyelin kalıntı tabakası da dahil olmak üzere süpernatanı, hücre tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek tüpte 2-3 mL kalana kadar aspire edin. 1 mL'lik bir pipet kullanarak hücre katmanını %30/70 yoğunluk gradyanı arasında toplayın ve 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
    11. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, son hacmi 15 mL'ye getirmek için RPMI% 10 FCS ortamı ekleyin. 450 x g'yi 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Bu adım sırasında, gerekirse iki tüpten hücre katmanları bir araya getirilebilir. İkiden fazla tüpü bir araya getirmeyin, aksi takdirde yüksek yoğunluklu gradyan ortam konsantrasyonu nedeniyle hücreler pelet olmaz.
    12. Hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatanı dikkatlice aspire edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak için hücreleri uygun bir hacimde/tamponda yeniden süspanse edin (örneğin, aşağı akış yüzey boyaması için 250 μL FACS tamponunda tek bir omuriliği yeniden süspanse edin) (Şekil 3).
    13. 1 mL'lik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonlarını bir filtre üst tüpünün (Malzeme Tablosu) üstüne aktarın ve kalan miyelin kalıntılarını gidermek için hücrelerin tüpün altına kadar filtrelemesine izin verin.
    14. Tripan mavisi dışlama boyasını kullanarak, doğruluk40,41 için en az iki 16 kare ızgaranın ortalamasını alarak bir hemositometredeki hücreleri seyreltin ve sayın.
    15. İstenilen tek hücreli analiz tekniği ile devam edin.
      NOT: Çeşitli kollajenaz formları (yani, D, tip I, tip II, tip IV), bağışıklık hücreleri, mikroglia (Şekil 3), astrositler, perisitler, endotel hücreleri49 ve nöronlar50 kullanılarak verimli bir şekilde izole edilebilir. Sonuçlar için elde edilen çekirdekli hücre sayımları, titre edilmiş kollajenaz I enzimi kullanılarak aşağıdaki gibidir: Tüm sahte tedavi edilmiş beyin = 500.000-600.000 hücre; Tüm TMEV-IDD beyni = 800.000–1.000.000 hücre; Tüm sahte tedavi edilmiş omurilik = 150.000-200.000 hücre; Tüm TMEV-IDD omuriliği = 300.000–400.000. Hücre sayımları, toplama, işleme ve CNS iltihabının mevcut olup olmadığına bağlı olarak değişecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu temsili deney, B ve T hücrelerini ölçmeyi ve homeostatik koşullarda meningeal ve parankimal CNS kompartmanlarında B ve T hücresi lokalizasyonunu tanımlamayı ve ayrıca bir murin progresif MS modelinde (yani, TMEV-IDD) tanımlamayı amaçladı. TMEV-IDD, 5 haftalık dişi SJL farelerinde, daha önce tarif edildiği gibi TMEV BeAn'ın 5 x 106 plak oluşturan birimi (PFU) ile intrakraniyal enfeksiyon ile indüklenmiştir29.

Bu çalışmada, enfeksiyondan sonraki 120. günde kronik TMEV-IDD sırasında meninksler, beyin ve omurilikteki B ve T hücreleri değerlendirildi. Yaşa uygun sahte muamele görmüş fareler kontrol olarak kullanıldı. Çalışma iki deneyden oluşmuştur. Birincisi, hücre yüzeyini ve / veya hücre içi antijenleri (n = 4 sahte tedavi edilmiş; n = 5 TMEV-IDD) değerlendirerek hücre bileşimini analiz etmek ve ölçmek için iyi kurulmuş bir teknik olan akış sitometrik değerlendirmesi için tek hücreli süspansiyonlar elde etmeye odaklandı. İkinci deney, dekalsifiye beyin ve omurilik dokularında immünohistokimyayı kullanarak CNS bölmesinde B ve T hücre lokalizasyonunu tanımlamaya odaklandı (n = 3 sahte tedavi; n = 8 TMEV-IDD).

Beyin, omurilik ve havuzlanmış meninkslerden (beyin ve omurilik) tek hücreli süspansiyonların TMEV-IDD ve sahte muamele görmüş farelerden izole edilmesinin ardından, tüm örneklere bir yüzey boyama protokolü uygulandı. Kısaca, tek hücreli süspansiyonlar, 15 dakika boyunca sabitlenebilir bir canlılık dışlama boyası (780) ile inkübe edildi, yıkandı, 15 dakika boyunca fare serumu varlığında Fc bloğu ile bloke edildi ve CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3; PE-CF594) ve CD4 (GK1.5; PE) daha önce açıklandığı gibi30 dakika boyunca 28,29. Hücreler daha sonra yıkandı ve bir akış sitometresi28,29 kullanılarak analiz edildi. Canlılık kapısı daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir28. CD45 ekspresyonu, CD45hi periferik kaynaklı sızan immün hücreleri (P1) CD45lo mikroglia (P2) ve CD45- nöronları, astrositler ve beyin ve omurilikteki oligodendrositlerden (P3; Şekil 3A). Sahte tedavi edilen farelerde, omurilik ve beyin dokusunda birkaç CD45hi hücresi mevcuttu. Meninkslerde, CD45 hi immün hücrelerini tanımlamak için beyin ve omurilik verileri için kullanılan CD45hi ekspresyonu için aynı geçit kesme işlemi uygulandı (P1; Şekil 3C) ve meninkslerde bulunan immün olmayan hücreleri (yani fibroblastlar, endotel hücreleri) hariç tutun. Sahte tedavi edilen farelerde, meninkslerde birkaç CD45hi hücresi (% <0.1) mevcuttu. TMEV-IDD CNS dokularındaki CD45hi immün hücreler arasında, sırasıyla CD19 ve CD4'ün yüzey ekspresyonu ile B hücreleri ve CD4 T hücreleri tanımlandı (Şekil 3B-D). Tüm TMEV-IDD CNS dokularında, sahte tedavi edilen farelere kıyasla CD45hi immün hücrelerinin yüzdelerinde artış gözlenmiştir (Şekil 4A). Kronik TMEV-IDD sırasında, beyin ve omurilikteki CD45hi immün hücreleri arasındaki B hücrelerinin yüzdesi meningeal kompartmana göre daha yüksekti (Şekil 4B).

Kronik TMEV-IDD sırasında CNS bölmesindeki B hücrelerinin ve T hücrelerinin lokalizasyonunu belirlemek için, dekalsifiye beyinler ve omurilikler, daha önce tarif edilen boyama protokolü kullanılarak immünohistokimya kullanılarak değerlendirildi29. Meninksler ve vaskülatür, bir bazal membran bileşeni olanlaminin 29,51 ve bir fibroblast retiküler hücre belirteci olan ER-TR752,53 kullanılarak ayrıldı. Konvansiyonel olarak kafatası başlığından beyin ekstraksiyonu sırasında pia tabakası sağlamdı, ancak geri kalan meningeal tabakalar dışlandı (Şekil 5A). Omurilikte, hidrolik ekstrüzyon tüm meningeal tabakaların yokluğuna neden oldu (veriler gösterilmemiştir). Hem dekalsifiye beyinlerde hem de omuriliklerde tüm meningeal tabakalar sağlamdı (Şekil 5B). Kronik TMEV-IDD'de B ve T hücre lokalizasyonunu incelemek için, izotip anahtarlamalı B hücrelerininlokalizasyonunu belirlemek için IgG ekspresyonu 29 ve tüm T hücrelerini görselleştirmek için CD3kullanıldı 29. IgG'nin ER-TR7 ile birlikte boyanması, CNS parankiminde ve meninkslerde izotip anahtarlamalı IgG + B hücrelerinin bulunduğunu ortaya çıkardı (Şekil 6A). ER-TR7+ meninksleri içindeki hücresel agregatlar, çoklu IgG + B hücreleri ve CD3 + T hücreleri içeriyordu (Şekil 6B).

Temsili sonuçlar, yaşa uygun sahte tedavi edilen farelerin aksine, kronik TMEV-IDD farelerinde parankimal ve meningeal bölmelerde hem B hücrelerinin hem de T hücrelerinin yüksek yüzdelerini göstermektedir. IHC analizi ayrıca TMEV-IDD dokusunda, B hücrelerinin ve T hücrelerinin parankimde dağıldığını, ancak meninkslerde yakından ilişkili olduğunu ve inflamatuar agregatlar oluşturduğunu göstermiştir. İlerleyici MS hastalarında, meningeal inflamatuar agregatlar komşu doku hasarı ve daha kötü hastalık sonuçları ile ilişkilidir. Kronik TMEV-IDD'de, SSS bölmesinde kalıcı B hücresi ve T hücresi varlığı ve meninkslerde agregasyon, doku hasarı ve hastalığın ilerlemesi ile ilişkili olabilir. Meningeal ve parankimal inflamasyonun demiyelinizasyonu, nörodejenerasyonu ve klinik sakatlığı nasıl etkilediğini anlamak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Figure 1
Şekil 1: Dekalsifikasyon için beyinleri ve omurilikleri izole etme. Mavi noktalı çizgiler, beyni sağlam kafatası (kesik 1-4) ve vertebral kolon (kesik 5-8) ile izole etmek için yapılan kesikleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Tek hücreli teknikler için beyinleri, omurilikleri ve meninksleri izole etme. (A) Mavi noktalı çizgiler, kafatası başlığını sağlam meninksler ve beyin (kesik 1-3) ve vertebral kolon (kesik 5-7) ile izole etmek için yapılan kesikleri gösterir. Kafatasının her iki tarafında lateral kesim 3 yapılır. (B) Mavi çizgi, kafatası başlığındaki meninksleri çentiklemek ve çıkarmak için yapılan kesiyi ve omurilik ve meninksleri izole etmek için vertebral kolonda (her iki yan taraf) yapılan kesikleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: CNS dokularında CD45hi infiltre eden bağışıklık hücrelerinin tanımlanması. (A) CD45hi sızan bağışıklık hücrelerinin (P1), CD45lo mikroglia (P2) ve CD45- oligodendrositlerin, astrositlerin ve nöronların sahte muamele görmüş (kırmızı) veya TMEV-IDD (mavi) farelerden alınan omurilikteki toplam canlı hücreler arasında tanımlanması için geçit stratejisi. Sahte tedavi edilen beyinlerde ve omuriliklerde minimal CD45hi hücreleri tespit edildi. (B) TMEV-IDD farelerinde CD45yüksek sızan bağışıklık hücreleri (P1) arasında CD19 + B hücrelerini ve CD4 + T hücrelerini tanımlamak için geçit stratejisi. Geçit stratejileri beyin ve omurilik dokusu için benzerdi. (C) Sahte tedavi edilmiş (kırmızı) ve kronik TMEV-IDD farelerinin (mavi) meninkslerinde CD45hi hücrelerini (P1) tanımlamak için geçit stratejisi. (D) Kronik TMEV-IDD farelerinin meninkslerinde CD45hi infiltre eden bağışıklık hücreleri (P1) arasında CD19 + B hücrelerini ve CD4 + T hücrelerini tanımlamak için geçit stratejisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Kronik TMEV-IDD'de CNS dokularında CD45yüksek immün hücreler ve CD19 + B hücreleri artmıştır. Sahte tedavi edilmiş veya TMEV-IDD meninkslerinden, beyin ve omuriliklerden elde edilen akış sitometrisi verilerinin çubuk grafik özetleri, CD45hi sızan bağışıklık hücrelerinin (A) yüzdelerini veya CD19 + B hücrelerinin (B) yüzdelerini gösterir. TMEV-IDD dokuları için, omurilik ve beyinler ayrı ayrı işlenen beş fareden akış sitometrisi verileri elde edilirken, meninksler analiz için bir araya getirildi. Sahte muamele edilen fareler için, dört fareden akış sitometrisi verileri elde edildi, omurilikler ve beyinler ayrı ayrı işlenirken, meninksler analiz için bir araya getirildi. Omurilikler ve beyinler için veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Dekalsifiye beyin ve omuriliklerde sağlam meningeal tabakalar. (A) Kafatası başlığından çıkarılan beyinler veya (B) kronik-TMEV-IDD farelerden sağlam kafatasları ve vertebral kolonları olan dekalsifiye beyinler DAPI (mavi), meningeal belirteçler laminin (yeşil) ve ER-TR7 (kırmızı) açısından değerlendirildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Kronik TMEV-IDD sırasında meninkslerde immün hücre agregasyonu belirgindi. (A) Kronik-TMEV-IDD farelerinden alınan kalsifiye vertebral kolonlar, parankimde ve ER-TR7+ meninkslerinde (kırmızı) izotip anahtarlamalı bağışıklık hücrelerini tanımlamak için IgG (yeşil) varlığı açısından incelendi. (B) Omurilik dokusu içindeki lokalizasyonu değerlendirmek için CD3+ T hücreleri (yeşil) ve IgG+ izotip anahtarlamalı B hücreleri (kırmızı) ER-TR7+ meninksleri ile boyandı. Beyaz oklar, meninksler içindeki B ve T hücrelerini vurgular. Ölçek çubuğu = 50 μm. Beyaz kutular, kırpılmış görüntüler için seçilen alanları tanımlar (sağda; ölçek çubuğu= 10 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Homeostaz ve hastalık sırasında CNS bölmesindeki hücresel bileşimi değerlendirme yöntemleri, CNS'nin fizyolojik ve patolojik durumlarını anlamak için gereklidir. Bununla birlikte, CNS'de önemli bir bariyer görevi görmesine ve çeşitli bağışıklık hücrelerini barındırmasına rağmen, beyin ve omurilik için birçok geleneksel doku ekstraksiyon yöntemi bu zarların toplanmasına izin vermediğinden, meninksler genellikle analizden çıkarılır. Bu ihmal, meninkslerin hücresel bileşimi ve işlevi ile kararlı durum ve enflamatuar koşullardaki rolü hakkındaki anlayışımızın ilerlemesinde kritik bir sınırlamadır. Son çalışmalar, meningeal kompartmanda bulunan hem yerleşik hem de periferik olarak türetilmiş immün hücrelerin, CNS'de homeostazın korunmasında ve ayrıca CNS hastalığı patogenezinin yönlendirilmesinde önemli bir rol oynadığını ortaya koymuştur. Bu çalışmalar sadece parankimal kompartmanı değil, aynı zamanda çevredeki meningeal tabakaları da analiz etme ihtiyacını vurgulamaktadır. Burada tarif edilen protokoller, beyin ve omuriliklerin hızlı bir şekilde izole edilmesine izin verirken, meninksleri korur ve sonuçta hem histolojik hem de tek hücreli çalışmaları kullanarak CNS bölmesinin kapsamlı bir aşağı akış analizini mümkün kılar. Temsili sonuçlar, CNS bölmesindeki bağışıklık hücrelerini değerlendirmeye odaklanır; bununla birlikte, protokoller mikroglia, astrositler, nöronlar, perisitler, endotel hücreleri veya diğer CNS yerleşik hücrelerini analiz etmek için uyarlanabilir.

Açıklanan yöntemlerdeki kritik bir adım, hem beyin, omurilik ve meninkslerden saf tek hücreli süspansiyonları izole etmek hem de yüksek kaliteli doku morfolojisine izin veren, sağlam kafatasları veya vertebral sütunlara sahip CNS dokuları elde etmek için gerekli olan dokunun dikkatli bir şekilde çıkarılmasıdır. Tek hücreli süspansiyonlar elde etme tekniğini uygulamak, başarılı bir doku ekstraksiyonunun anahtarıdır, çünkü bu sadece numunenin saflığını arttırmakla kalmayacak, aynı zamanda sonraki uygulamalar için hücre verimini de artıracaktır. Benzer şekilde, kemiği çevreleyen fazla dokuyu yeterince çıkarmak için sağlam kafatasları veya vertebral kolonları olan CNS dokularının izolasyonunda uygulama, dokunun daha iyi fiksasyonunu, dekalsifikasyonunu ve kriyoprezervasyonunu sağlayan önemli bir adımdır, yüksek kaliteli morfoloji ve sağlam antijen hedeflerine sahip doku kesitleri elde etmek için tüm önemli bileşenler.

Tek hücreli süspansiyonları meninkslerden izole etme protokolümüzün bir sınırlaması, astrosit süreçleri yoluyla beyne veya omuriliğe bağlı kalan pia'nın izolasyonunu ihmal ederken, dural ve araknoid meninksler32,54 elde etmeye odaklanmasıdır. Pia materde bulunan hücreler meningeal kompartmanın önemli bir bileşeni olmasına rağmen, pia mater'i yeterince izole etmek için gereken uzun süre nedeniyle tek hücreli süspansiyon hazırlığı sırasında pia materin dışlanmasına karar verildi55. Benzer şekilde, protokol sadece kafatasının üst kısmında meninkslerin elde edilmesine odaklanır ve beyinde ve koroid pleksusta invaziv meninkslerin izolasyonunu hariç tutar. İnvazivan meninkslerin ve koroid pleksusun toplanması, zaman alıcı bir prosedür olmasına rağmen, daha önce yayınlanmış protokollere55 göre gerçekleştirilebilir. Her iki durumda da, meningeal tabakaların bir kısmını atlama seçimi, onları izole etmek için gereken süreden kaynaklanıyordu. Akış sitometrisi, hücre kültürü tahlilleri ve RNA dizilimi (RNAseq) gibi aşağı akış uygulamaları için gerekli olan tek hücreli süspansiyonları hazırlamak için kullanılan protokolün zamanlaması, hücre canlılığını ve veri kalitesini iyileştirmek için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, spesifik araştırma sorusuna bağlı olarak, numune izolasyon süresi ile meninkslerin çıkarılmasındaki eksiksizlik arasında bir denge kurulmalıdır. Mevcut protokolde, dura ve araknoid meninkslerden sadece tek hücreli süspansiyon preparatları elde edilir, bu da sonuçları CNS meninkslerinin tamamına tahmin etme yeteneğini sınırlar. Bununla birlikte, bu yöntemler, üç meninks tabakası ile tüm doku kesitlerinin IHC veya ISH analizi ile birlikte kullanılırsa, parankimal ve meningeal kompartmanlardaki hücresel ve moleküler dinamiklerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılması sağlanabilir.

Protokolün bir diğer sınırlaması, özellikle homeostatik koşullarda dural ve araknoid meninkslerden elde edilen düşük hücre sayılarıdır. Bununla birlikte, omurilik, beyin veya beyin zarlarındaki hücre sayılarının belirli bir hedef hücre popülasyonunun analizi için çok düşük olduğu kabul edilirse, bu analiz için gereken minimum hücre sayısı, belirli bir kesinlik için gereken toplam olay sayısı tahmin edilerek belirlenebilir (örneğin, nadir olay analizinde uzmanlaşmış önceki literatürde açıklandığı gibi, %5 varyasyon katsayısı)56. Bu hesaplamalar daha sonra, ilgilenilen hücre popülasyonunu analiz etmek için yeterli hücre sayısı elde etmek için birden fazla hayvandan alınan örneklerin bir araya getirilmesi gerekip gerekmediğini belirlemek için kullanılabilir.

Açıklanan yöntemler, analizleri yaygın olarak ihmal edilen meningeal bölmeyi içerecek şekilde genişleterek CNS bölmesi içindeki hücresel dinamiklerin araştırılmasında önemli bir ilerleme sağlar. Bu protokoller, tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak için beyin, omurilik ve dural ve araknoid meninkslerin bireysel olarak çıkarılmasına izin verir. Ek olarak, dekalsifikasyon protokolü, üç meningeal tabakayı içeren beyin veya omurilik dokusunu içeren doku kesitlerinin histolojik analizlerine izin verir. EDTA'nın kullanılması, yüksek kaliteli doku morfolojisinin gerekli olduğu numuneler için en uygun olan yavaş ama nazik bir dekalsifikasyon işlemi sağlar (ör., IHC ve ISH). Protokol, dekalsifikasyon hızını yavaşlatmak ve sağlam doku morfolojisinin korunmasını sağlamak için 7.2-7.4'lük bir pH kullanır, güçlü ve zayıf asitlere göre açık bir avantaj (ör., hidroklorik asit ve trikloroasetik asit), daha kısa bir dekalsifikasyon süresine sahip, ancak doku morfolojisinin kalitesini etkiler.

Tek hücreli süspansiyonları meninkslerden izole etmeyi amaçlayan gelecekteki yöntemler, piyal tabakayı CNS dokularından ve beyindeki invaziv meninkslerden tamamen izole etmek için gereken süreyi kısaltmak için protokoller geliştirmeye odaklanmalıdır. Üç meningeal tabakanın tam kompleksinin elde edilmesi, herhangi bir analiz için sadece hücre sayısını arttırmakla kalmayacak, aynı zamanda CNS'yi çevreleyen meninksleri işgal eden yerleşik ve sızan bağışıklık hücrelerinin daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlayacaktır. Aynı zamanda, dekalsifiye beyinlerin ve omuriliklerin hazırlanmasına odaklanan gelecekteki protokoller, doku morfolojisinin kalitesini korurken doku dekalsifikasyonunu hızlandırmayı amaçlayan yeni ajanları tanımlamaya çalışmalıdır. Bununla birlikte, kapsamlı doku kesiti analizi ile birlikte gerçekleştirilen, ikili ve araknoid meninksler dahil olmak üzere CNS tek hücreli süspansiyonlarını analiz eden aşağı akış uygulamaları, CNS bölmesindeki hücre fenotipi, işlevi ve lokalizasyonunun ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar, Dartmouth'daki Karşılaştırmalı Tıp ve Araştırma Merkezi (CCMR) personeline, bu çalışmalar için kullanılan farelere gösterdikleri uzman bakım için teşekkür eder. Bornstein Araştırma Fonu bu araştırmayı finanse etti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, Pt 10 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, Pt 9 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019).
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 159 meninksler merkezi sinir sistemi dekalsifikasyon immünohistokimya tek hücreli süspansiyon immün hücreler fareler
İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, … More

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter