Summary
이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.
Abstract
중추신경계(CNS)는 뇌와 척수로 구성되어 있으며 말초와 중추신경계 사이의 장벽 역할을 하는 막층인 수막으로 둘러싸여 있습니다. CNS는 면역학적으로 특화된 부위이며, 정상 상태 조건에서 면역 특권은 CNS 실질에서 가장 분명합니다. 대조적으로, 수막에는 선천성 및 적응 면역 세포를 포함한 다양한 상주 세포가 있습니다. CNS 손상, 자가면역, 감염 또는 신경변성에 의해 유발되는 염증 상태에서 말초 유래 면역 세포가 실질에 들어가 수막 내에 거주할 수 있습니다. 이 세포는 CNS 질병 발병 기간 동안 유익한 작용과 해로운 작용을 모두 수행하는 것으로 생각됩니다. 이러한 지식에도 불구하고, 수막은 종종 CNS 구획을 분석할 때 간과되는데, 이는 종래의 CNS 조직 추출 방법이 수막층을 생략하기 때문이다. 이 프로토콜은 단일 세포 기술, 면역조직화학 및 현장 혼성화 방법을 통한 다운스트림 분석에 적합한 쥐 CNS 조직(즉, 뇌, 척수 및 수막)의 신속한 분리를 위한 두 가지 고유한 방법을 제시합니다. 설명된 방법은 항상성 조건 및 질병 발병 기전 동안 CNS 구획을 차지하는 세포의 표현형, 기능 및 국소화를 평가하는 데 이상적인 CNS 조직의 포괄적인 분석을 제공합니다.
Introduction
중추신경계(CNS)는 면역학적으로 특화된 부위입니다. 중추신경계 실질은 뇌척수액 공간, 수막 및 혈관계를 제외하고, 고전적으로 면역-특권 부위 1,2,3,4,5로 간주되며, 항상성 상태 동안 면역 세포가 상대적으로 없다 2,6,7. 대조적으로, 경막층, 거미층, 피아층으로 구성된 수막은 중추신경계 구획의 중요한 구성 요소로, 질병 발병기전동안 항상성 면역 감시 및 염증 과정에 적극적으로 참여합니다 3,6,7,8. 정상 상태 조건에서 수막은 선천성 림프 세포(ILC), 대식세포, 수지상 세포(DC), 비만 세포, T 세포 및 그보다 덜하지만 B 세포를 포함한 수많은 면역 감시 세포를 지원합니다 9,10,11.
수막은 고도로 혈관화된 구조이며 CNS와 그 주변 사이에 림프 연결을 제공하는 림프관을 포함합니다 8,12,13,14. CNS 손상, 감염, 자가면역 또는 신경변성에 의해 유발된 염증성 상태에서 말초 유래 면역 세포가 실질에 침투하여 수막 내의 면역 환경을 변경합니다. 세포 침윤 후, 수막은 말초 유래 면역 세포에 대한 기능적 틈새를 나타낼 수 있으며, 면역 세포 응집, 국소 면역 세포 활성화 및 CNS 구획에서의 장기 생존을 촉진할 수 있습니다. 두드러진 수막 염증은 다발성 경화증 (MS) 15,16,17,18,19, 뇌졸중 20,21, 무균 손상 22,23 (즉, 척수 손상 및 외상성 뇌 손상), 편두통 24 및 미생물 감염 25,26,27,28,29. 따라서, 수막 구획에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 특성화는 정상 상태 및 질병 발병 기전 동안 이러한 세포의 역할을 이해하는 데 필수적입니다.
두개골과 척추체에서 뇌, 척수 및 수막을 추출하는 것은 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 현재 세 개의 수막층이 모두 손상되지 않은 상태에서 뇌를 빠르게 추출할 수 있는 기술은 없습니다. 추궁 절제술은 우수한 척수 조직 형태를 산출하고 수막층을 보존하지만 시간이 많이 걸리고 복잡합니다30,31. 반대로, 두개골에서 뇌를 제거하고 척수를 수압 압출하는 것과 같은 보다 전통적인 추출 방법은 CNS 조직의 빠른 추출을 용이하게 하지만 이러한 기술로 거미주막과 경막 수막이 모두 손실됩니다(30,31). 뇌 및 척수 조직의 기존 분리 동안 경막 및 지주막 층의 누락은 CNS 구획 내의 세포에 대한 불완전한 분석을 초래합니다. 따라서 수막이 손상되지 않은 CNS 조직의 빠른 추출에 초점을 맞춘 새로운 기술의 식별은 CNS 구획의 최적 분석에 매우 중요합니다.
이 원고는 생쥐에서 뇌, 척수 및 수막을 신속하게 추출하는 두 가지 방법을 제시하여 CNS 실질 및 수막에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 다운스트림 분석을 용이하게 합니다. 이러한 최적화된 프로토콜은 1) 다운스트림 분석을 위한 단일 세포 현탁액 분리 및 2) 조직학적 처리를 위한 조직 준비에 중점을 둡니다. 뇌, 척수 조직, 경막 및 지주막 수막(32)으로부터 단세포 현탁액을 얻는 것은 실질 및 수막 구획 둘 다에 상주하는 세포의 동시 분석을 가능하게 한다. 단일 세포 현탁액은 시험관 내 자극 33, 효소 결합 면역스팟(ELISpot)28,34,35, 유세포 분석(36,33) 및 단일 세포 37 또는 벌크 전사체학을 수행하기 위한 세포 배양 분석을 포함한 다양한 응용 분야에서 사용할 수 있습니다. 또한, 두개골 또는 척추가 각각 손상되지 않은 전체 뇌 및 척수의 석회질 제거를 위해 최적화된 프로토콜은 주변 뼈의 부드러운 석회화를 허용하여 수막을 온전하게 유지하고 조직 형태를 보존합니다. 이 방법을 사용하면 실질 및 수막 공간 모두에서 면역조직화학(IHC) 또는 제자리 혼성화(ISH) 기술을 사용하여 단백질 또는 RNA를 선택적으로 식별할 수 있습니다. CNS 내에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 표현형, 활성화 상태 및 국소화의 특성화는 CNS 구획의 개별 세포 유형이 항상성 및 질병 발병기전에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 필수적인 정보를 제공할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 작업은 다트머스에 있는 Geisel School of Medicine의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토하고 승인한 프로토콜을 사용합니다.
1. 석회질 제거를 위한 뇌 및 척수 샘플 처리
- 뇌 및 척수 샘플 분리
- CO2 흡입을 통해 마우스를 안락사시킵니다. CO2 유량이 분당 케이지 부피의 10%–30%를 대체하는지 확인하십시오.
- 집게를 사용하여 검상돌기를 들어 올리고 흉곽 바로 아래 복벽을 가위로 옆으로 자르고 밑에 있는 혈관이나 기관이 절단되지 않도록 위로 당깁니다. 다이어프램을 측면으로 자릅니다.
- 쇄골까지 폐와 평행한 측면 가장자리를 따라 흉곽을 자릅니다. 집게를 사용하여 흉골을 들어 올리고 지혈제로 흉골을 고정하십시오. 지혈제를 머리 위에 올려 흉곽을 들어 올리고 심장을 노출시킵니다.
- 집게를 사용하여 심장의 정점 근처를 잡고 심장의 우심방을 절개하여 출구를 제공합니다. 10mL 주사기가 부착된 25G 바늘을 삽입하여 10mL의 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 좌심실에 천천히 투여하여 마우스를 심근으로 관류합니다.
참고: 간에서 혈액이 제거될 때까지 4-5분에 걸쳐 관류가 이루어져야 합니다. 총 10mL의 1x PBS는 일반적으로 관류에 충분하지만 필요한 경우 더 많이 사용할 수 있습니다. 깨끗한 간은 일반적으로 적절한 관류를 나타냅니다. - 날카로운 가위를 사용하여 목을 베어 머리를 제거하십시오 (그림 1, 1). 피부에 정중선을 절개하고(그림 1; 2) 피부를 눈 위로 뒤집어 두개골을 제거합니다.
- 두개골에서 하악을 분리하기 위해 비강 뼈를 자릅니다 (그림 1, 3). 하악골, 혀, 눈을 제거합니다. 두개골의 측면을 따라 절단하여 외이를 따라 조직을 분리합니다(그림 1; 4). 두개골을 덮고 있는 과도한 피부, 근육 및 조직을 모두 제거하기 위해 다듬습니다.
- 날카로운 가위로 척추와 평행하게 절단하여 흉곽을 척추에서 분리합니다(그림 1, 5 및 6). 척추를 분리하기 위해 요추 아래쪽 부위를 작게 절개합니다(그림 1, 7). 척추를 따라 남아 있는 근육을 다듬고 제거하여 척추를 노출시킵니다(그림 1; 8).
알림: 고정성 파라포름알데히드(PFA) 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 석회질 제거 완충액의 적절한 침투를 얻으려면 척추와 두개골에서 과도한 조직을 제거하는 것이 필요합니다.
- 사후 고정, 석회화 제거 및 냉동 보존
- 겸자를 사용하여 두개골 또는 척추가 손상되지 않은 뇌를 15mL의 4% PFA가 들어 있는 4mL의 원추형 튜브에 넣습니다. 적절한 고정을 위해 튜브를 최소 48시간 동안 4°C에 두십시오.
알림: 조직의 과도한 고정을 방지하려면 고정 시간이 72시간을 초과하지 마십시오. 석회질 제거 전에 뼈 표본에 대한 고정 시간이 연장됩니다. 적절한 고정은 석회질 제거의 영향으로부터 조직을 보호하고 더 나은 조직 형태를 보장합니다. - 집게로 4% PFA에서 조직을 제거하고 1x PBS 10mL가 든 일회용 14mL 튜브에 5분 동안 조직을 넣어 뇌 또는 척수를 헹굽니다. 뇌 또는 척수를 10% EDTA 10mL(pH = 7.2–7.4)가 포함된 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
알림: 10mL의 EDTA가 있는 더 큰 튜브를 사용하면 EDTA가 조직과 더 큰 접촉 면적을 확보하고 석회질 제거 과정을 가속화할 수 있습니다. - 뼈가 부드럽고 유연한지 매일 확인하십시오 : 집게로 EDTA 용액에서 조직을 제거하고 페트리 접시에 놓고 25G 바늘로 뼈의 부드러움을 부드럽게 테스트하십시오. 바늘이 뼈를 쉽게 관통하면 석회질 제거 과정이 완료됩니다.
- EDTA 용액에서 조직을 제거하고 뇌 또는 척수를 1x PBS 10mL가 들어 있는 14mL 일회용 튜브로 옮기고 10분 동안 세척합니다. 세탁을 반복하십시오.
알림: 석회질 제거는 일반적으로 2-3일이 걸립니다. 뼈가 아직 적절하게 석회질되지 않은 경우 2-3일마다 용액을 교체해야 합니다. 그러나 뼈가 석회질된 후 EDTA에서 장기간 배양하면 조직 형태가 손상될 수 있습니다. - 1x PBS에 자당을 첨가하여 10%, 20% 및 30% 자당 용액을 준비합니다. 예를 들어, 10 % 자당의 경우, 10g의 자당을 첨가하고 멸균 된 1x PBS를 사용하여 부피를 100mL로 가져옵니다. 용액을 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.
알림: 자당 용액은 미생물이 성장하기 쉬우므로 samples는 이러한 용액에 장기간 보관해서는 안 됩니다. - 1x PBS로부터 조직을 제거하고, 이를 10% 수크로오스 용액 10 mL에 넣고, 4°C에서 보관한다. 조직을 24시간 동안 또는 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 그대로 두십시오.
- 이 과정을 반복하여 조직을 먼저 20% 자당 용액으로 옮기고 마지막으로 30% 자당 용액으로 옮깁니다. 조직이 30% 자당(최소 24시간)에 가라앉도록 하고 조직 포매를 진행합니다.
- 겸자를 사용하여 두개골 또는 척추가 손상되지 않은 뇌를 15mL의 4% PFA가 들어 있는 4mL의 원추형 튜브에 넣습니다. 적절한 고정을 위해 튜브를 최소 48시간 동안 4°C에 두십시오.
- 조직 포매 및 동결
- 집게를 사용하여 30% 자당에서 조직을 제거하고 페트리 접시에 놓고 접시를 기울여 조직에 있는 과도한 자당 용액을 제거합니다. 메스를 사용하여 조직을 원하는 부분으로 자릅니다.
- 극저온 몰드의 바닥에 최적 절단 온도 (OCT) 화합물의 얇은 층을 만들고 조직 조각을 금형에 넣습니다. OCT 화합물로 조직을 완전히 덮어 기포가 없는지 확인합니다.
- 블록이 불투명해질 때까지 액체 질소(38 ) 위로 마우스를 가져가거나 블록을 100% 이소프로판올/드라이아이스 슬러리(39 )에 설정하여 블록을 급속 동결시킨다. 극저온 몰드를 알루미늄 호일로 감싸고 장기 보관을 위해 블록을 -80 °C에서 보관합니다. 절단하기 전에 블록을 -20°C로 이동합니다.
참고: 석회질 제거된 뇌에 대해 조직학 프로토콜을 절개하고 수행할 때 절편을 대략적으로 다루면 두개골과 수막층이 손실될 수 있으므로 주의해야 합니다.
2. 유세포 염색을 위한 수막 및 CNS 조직의 제조
- 두개골 캡과 뇌 추출
- 날카로운 가위를 사용하여 목을 베어 머리를 제거하십시오 (그림 2A, 1). 가위를 사용하여 피부에 정중선을 절개하고(그림 2A; 2) 피부를 눈 위로 뒤집어 두개골을 제거합니다.
- 가위를 구멍 마그나 안에 놓고 피질을 따라 후각 구근을 향해 측면으로 두개골을 절단하기 시작하여 절개 부위를 외이도와 하악 위에 유지합니다(그림 2A, 3). 뇌에서 두개골 캡을 제거하기 위해 후각 구근에서 만나는 절단과 함께 반대쪽에서도 동일한 절단을 수행합니다(그림 2A; 3).
- 집게를 사용하여 두개골 캡을 벗기고 25mM HEPES가 보충된 5mL의 차가운 RPMI 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 두개골 캡을 넣습니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
- 구부러진 집게를 사용하여 집게를 뇌 기저부 아래에 놓고 들어 올려 두개골 캡에서 뇌를 제거합니다. 25mM HEPES가 보충된 5mL의 저온 RPMI가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 뇌를 넣습니다. 처리 될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
- 척추 및 척수 조직을 추출하는 단계
- 집게와 날카로운 가위를 사용하여 척추와 평행하게 절단하여 흉곽을 척추에서 분리합니다(그림 2A, 4 및 5). 척추를 분리하기 위해 요추 아래쪽 부위를 작게 절개합니다(그림 2A, 6). 척추를 따라 남아 있는 근육을 다듬고 제거하여 척추를 노출시킵니다(그림 2A, 7).
- 척추 안에 매우 미세한 수술용 가위를 놓고 기둥의 측면 가장자리를 따라 자릅니다(그림 2C). 반대쪽 측면 가장자리를 완전히 잘라 척추를 앞쪽과 뒤쪽으로 나눕니다.
알림: 척수는 척추에 부착된 상태로 유지됩니다. - 집게를 사용하여 척추에서 척수를 천천히 조심스럽게 떼어내고 25mM HEPES가 포함된 5mL의 차가운 RPMI가 들어 있는 15mL 원추형 튜브에 조직을 넣습니다. 척추의 앞쪽 및 뒤쪽 부분을 25mM HEPES가 있는 5mL의 차가운 RPMI가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 수막을 제거하여 단세포 현탁액 준비
- 집게를 사용하여 RPMI 미디어에서 두개골 캡을 제거합니다. 날카로운 집게(#7 집게; 재료 표), 두개골 캡의 바깥쪽 가장자리(그림 2B)를 점포하고 두개골 캡 가장자리에서 수막을 떼어내고 긁어 경막 및 거미 수막을 제거합니다. 수막을 페트리 접시에 놓습니다.
알림: 뇌와 척수에서 수막을 제거하려면 연습이 필요합니다. 사용자가 수막을 추출하는 데 어려움을 겪는 경우 해부 현미경을 사용하여 제거를 돕습니다. - 튜브에서 척추를 제거하십시오. 날카로운 집게를 사용하여 척추 가장자리 주위를 점핑하여 수막을 풀고 구부러진 집게를 사용하여 척추 가장자리에서 수막을 벗겨냅니다. 수막을 페트리 접시에 놓습니다.
- 나일론 메쉬 스트레이너를 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 수막을 여과기로 옮기고 25mM HEPES가 보충된 RPMI 3mL를 추가합니다. 5mL 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 조직과 배지를 분쇄합니다.
- 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 눈에 보이는 모든 조직이 스트레이너를 통과할 때까지 추가로 2-3mL의 RPMI/HEPES 배지로 스트레이너를 세척합니다.
참고: 유세포 분석을 위한 적절한 세포 수를 얻으려면 여러 동물의 수막을 함께 풀링해야 할 수 있습니다. 이 실험(그림 3 및 그림 4)에서는 4-5마리의 마우스의 뇌와 척수 수막을 함께 풀링했습니다. 샘플이 풀링되면 조직의 과열을 방지하기 위해 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 조직을 분쇄하기 위해 추가 매체가 필요합니다. - 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포와 배지를 새로운 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 50mL 원뿔형 튜브를 5mL의 배지로 세척하여 남아 있는 세포를 수집합니다. 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다.
- 진공이 있는 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 피하기 위해 조심스럽게 상청액을 흡인하고 적절한 부피와 완충액에 세포를 재현탁합니다.
- 단일 세포 현탁액을 계산하려면 트리판 블루 배제 염료(1:10 희석) 및 RPMI를 사용하여 소량의 세포(즉, 5–10μL)를 희석합니다. 희석액 10μL를 혈구계에 추가합니다.
- 앞에서 설명한 대로 셀 수를 세고40,41, 정확도를 위해 최소 2개의 16 정사각형 그리드를 평균화합니다.
참고: 그림 3에서, 예를 들어, 수막에서 풀링된 펠렛화된 세포를 다운스트림 표면 염색을 위해 250μL의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액(1% FBS가 포함된 1x PBS)에 재현탁했습니다. 계수를 위해 세포를 1:10으로 희석하였다(5 μL 세포, 5 μL 트립판 블루, 40 μL RPMI). 이 희석은 16개의 정사각형 그리드당 50-100개의 세포를 산출하여 세포가 너무 조밀하거나 겹치거나 너무 희박하지 않기 때문에 보다 정확한 세포 계수를 보장합니다. 마우스당 풀링된 뇌 및 척수 수막의 핵 세포 수는 다음과 같았다: 가짜 치료 마우스의 수막 = 100,000-150,000 세포 및 Theiler의 쥐 뇌척수염 바이러스 유발 탈수초성 질환(TMEV-IDD) 마우스의 수막 = 300,000-350,000 세포. 세포 수는 수집, 처리의 정밀도 및 수막 염증이 있는지 여부에 따라 달라집니다. - FACS 표면(그림 3)14,36,42,43,44, 세포내 염색 프로토콜 33,45, 시험관 내 자극, 세포 배양 분석 33,46,47, ELISPOT 분석 28,34,35 및 벌크 또는 단일 세포와 같은 원하는 단일 세포 기술로 진행합니다 전사체학 37,48.
알림: 처리 단계 사이에 모든 튜브를 얼음 위에 두십시오.
- 집게를 사용하여 RPMI 미디어에서 두개골 캡을 제거합니다. 날카로운 집게(#7 집게; 재료 표), 두개골 캡의 바깥쪽 가장자리(그림 2B)를 점포하고 두개골 캡 가장자리에서 수막을 떼어내고 긁어 경막 및 거미 수막을 제거합니다. 수막을 페트리 접시에 놓습니다.
- 뇌 및 척수 조직의 단세포 현탁액 준비
- 튜브에서 조직과 배지를 부어 미디어가 있는 뇌 또는 척수 조직을 100mm 페트리 접시 상단으로 옮깁니다. 집게를 사용하여 티슈를 페트리 접시의 바닥으로 옮깁니다. 멸균 면도날로 뇌 또는 척수를 잘게 다듬습니다. 면도날을 이용하여 다진 티슈를 긁어 접시 바닥으로 옮겨 티슈를 모은다.
참고: 아래 효소 소화 프로토콜의 경우 처리를 위해 최대 2개의 척수를 함께 모을 수 있습니다. 두뇌는 개별적으로 처리되어야 합니다. - 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 10% 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 RPMI 3mL를 페트리 접시에 추가합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 피펫을 사용하여 조직을 배지에 재현탁하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
참고: 다운스트림 응용 프로그램이 단일 세포 또는 벌크 RNA 시퀀싱 분석 또는 세포 배양인 경우 분석 전에 세포가 활성화되지 않도록 FCS 로트를 테스트해야 합니다. 대안적으로, 세포는 10% FCS를 갖는 RPMI 대신에 0.04% BSA를 갖는 1x PBS를 사용하여 처리될 수 있다. - 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 페트리 접시를 추가 2mL의 배지로 세척하여 잔류 조직을 수집하고 총 부피 5mL의 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 처리 단계 사이에 튜브를 얼음 위에 두십시오.
- 피펫을 사용하여 콜라게나제 I 분말을 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 배지에 재현탁하여 원하는 농도(즉, 100mg/mL)를 얻습니다. 다진 조직 샘플이 들어 있는 원뿔형 튜브에 콜라게나제 유형 I을 추가하여 원하는 최종 농도(즉, 1mg/mL의 경우 50μL)를 얻습니다.
참고: 콜라게나제의 농도가 높을수록 세포 수율이 증가하지만 세포 표면 마커가 절단될 수 있습니다. 따라서 콜라게나제 I 로트를 적정하여 필요한 모든 세포 표면 마커가 손상되지 않은 상태에서 가장 많은 수의 생존 세포를 얻는 데 필요한 최적 농도를 결정해야 합니다. 예를 들어, 콜라게나제 I은 단일 뇌 또는 척수 샘플에서 0.5mg/mL, 1mg/mL 및 2mg/mL의 최종 농도로 테스트되었습니다. 세포 생존율은 트립판 블루 배제 방법을 사용하여 결정되었고, 세포 표면 마커 CD45, CD19 및 CD4는 유세포 분석에 의해 평가되었다. 1mg/mL 농도의 콜라게나제 I은 관심 있는 모든 세포 표면 마커를 유지하면서 가장 높은 생세포 수를 산출했습니다. 따라서, 이 농도는 이들 세포 유형을 조사하는 추가 실험에 사용되었다. - 0.15M 염화나트륨을 사용하여 DNase I 분말을 원하는 스톡 농도로 부드럽게 재현탁합니다. 다진 조직 샘플이 들어 있는 원뿔형 튜브에 재현탁된 DNase I을 추가하여 20U/mL의 최종 농도를 얻습니다.
참고: DNase I 로트는 mL당 활성 단위에 따라 다릅니다. 조직 샘플에 첨가되는 농도는 밀리리터당 스톡 바이알의 활성 단위에 따라 변경됩니다. 샘플당 최종 원하는 농도는 20U/mL입니다. - 튜브를 37°C 수조의 튜브 랙에 넣고 40분 동안 배양합니다. 15분마다 튜브를 뒤집어 조직과 효소를 완전히 혼합합니다. 인큐베이션 후, 0.01 M EDTA의 최종 농도를 위해 0.1 M EDTA (pH = 7.2)의 500 μL를 각 튜브에 첨가하고 콜라게나제를 비활성화하기 위해 추가로 5 분 동안 인큐베이션한다.
- 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 10% FCS가 보충된 RPMI 9mL를 각 튜브에 추가하여 각 튜브의 부피를 ~14.5mL로 만듭니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다. 진공 상태에서 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 펠릿에 닿지 않도록 주의하면서 상층액을 흡인합니다.
- 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 3mL의 100% 스톡 등장 밀도 구배 용액을 세포 펠릿이 들어 있는 튜브에 추가합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 RPMI 10% FCS 배지를 추가하여 최종 부피를 10mL로 만들고 세포 펠릿을 재현탁하여 30% 스톡 등장 밀도 구배 용액 층을 만듭니다.
참고: 100% 스톡 등장성 밀도 구배 배지를 미리 준비하고 분취한 다음 최대 4개월 동안 3°C에서 보관합니다. 100% 스톡 등장성 밀도 구배 용액을 제조하기 위해, 밀도 구배 매질(Table of Materials)을 밀도 구배 매질 희석 완충액으로 희석한다. 밀도 구배 배지 희석 완충액(80.0g/L NaCl, 3.0g/L KCl, 0.73g/L Na2HP0 4, 0.20g/L KH2HP04, 20.0g/L 포도당)을 준비하고 진공 필터 시스템을 사용하여 필터 멸균합니다. 밀도 구배 희석 완충액의 1부와 밀도 구배 배지의 100부를 혼합하여 9% 스톡 등장성 밀도 구배 용액을 만듭니다. 잘 섞다. - 70% 스톡 등장 밀도 구배 용액 언더레이를 추가하기 전에 각 튜브를 잘 뒤집고 혼합합니다. 70% 스톡 등장 밀도 구배 용액 1mL가 들어 있는 혈청학적 피펫 1mL를 튜브 바닥에 삽입합니다. 거품이 생기지 않도록 주의하면서 용액 1mL를 천천히 밑에 깔아줍니다. 튜브에서 혈청 피펫을 천천히 제거하고 그라디언트를 방해하지 않도록주의하십시오.
참고: 70% 언더레이의 경우 RPMI 배지를 사용하여 100% 스톡 등장 밀도 구배 용액을 70%로 희석해야 합니다(즉, 100% 스톡 등장 밀도 구배 용액 7mL와 RPMI 배지 3mL가 잘 혼합됨). 또한 깨끗하고 방해받지 않는 70% 언더레이를 생성하는 것은 미엘린 잔해물을 제거하고 원심분리 후 그래디언트 계면에서 순수한 단일 세포 현탁액을 얻는 데 필수적입니다. - 브레이크 없이 4°C에서 30분 동안 800 x g 의 원심분리기. 세포층을 방해하지 않도록 주의하면서 2-3mL가 튜브에 남을 때까지 미엘린 파편 층을 포함한 상층액을 흡인합니다. 1mL 피펫을 사용하여 30/70% 밀도 구배 사이의 세포층을 수확하고 새로운 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 RPMI 10% FCS 배지를 추가하여 최종 부피를 15mL로 만듭니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 의 원심분리기.
알림: 이 단계에서 필요한 경우 두 튜브의 셀 레이어를 풀링할 수 있습니다. 두 개 이상의 튜브를 풀링하지 마십시오 또는 고밀도 구배 배지 농도로 인해 세포가 펠릿화되지 않습니다. - 세포 펠릿을 방해하지 않도록 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산하기 위해 적절한 부피/완충액에 세포를 재현탁합니다(예: 다운스트림 표면 염색을 위해 250μL의 FACS 완충액에 단일 척수를 재현탁)(그림 3).
- 1mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 필터 탑 튜브(재료 표)의 상단으로 옮기고 세포가 튜브의 하단으로 여과되도록 하여 남아 있는 미엘린 파편을 제거합니다.
- 트리판 블루 배제 염료를 사용하여 정확도40,41을 위해 최소 2개의 16 정사각형 그리드를 평균화하여 혈구계에서 세포를 희석하고 계수합니다.
- 원하는 단일 세포 분석 기법을 진행합니다.
참고: 다양한 형태의 콜라게나제(즉, D형, I형, II형, IV형)를 사용하여 면역 세포, 미세아교세포(그림 3), 성상교세포, 혈관주위세포, 내피 세포(49) 및 뉴런(50 )을 모두 효율적으로 분리할 수 있습니다. 결과에 대해 얻은 핵 세포 수는 적정 된 콜라게나제 I 효소를 사용하여 다음과 같았다 : 전체 가짜 처리 된 뇌 = 500,000-600,000 세포; 전체 TMEV-IDD 뇌 = 800,000-1,000,000 세포; 전체 가짜 치료 척수 = 150,000-200,000 세포; 전체 TMEV-IDD 척수 = 300,000–400,000. 세포 수는 수집, 처리의 정밀도 및 CNS 염증이 존재하는지 여부에 따라 달라집니다.
- 튜브에서 조직과 배지를 부어 미디어가 있는 뇌 또는 척수 조직을 100mm 페트리 접시 상단으로 옮깁니다. 집게를 사용하여 티슈를 페트리 접시의 바닥으로 옮깁니다. 멸균 면도날로 뇌 또는 척수를 잘게 다듬습니다. 면도날을 이용하여 다진 티슈를 긁어 접시 바닥으로 옮겨 티슈를 모은다.
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Representative Results
이 대표적인 실험은 B 및 T 세포를 정량화하고 항상성 상태뿐만 아니라 쥐 진행성 MS 모델(즉, TMEV-IDD)에서 수막 및 실질 CNS 구획에서 B 및 T 세포 국소화를 설명하는 것을 목표로 했습니다. TMEV-IDD는 앞서 기술된 바와 같이 TMEV BeAn의 5 x 106 플라크 형성 단위 (PFU)에 의한 두개내 감염에 의해 5주령 암컷 SJL 마우스에서 유도되었다(29).
본 연구는 감염 후 120일째에 만성 TMEV-IDD 동안 수막, 뇌 및 척수의 B 및 T 세포를 평가했습니다. 연령 일치 가짜 처리 마우스를 대조군으로 사용했습니다. 이 연구는 두 가지 실험으로 구성되었습니다. 첫 번째는 세포 표면 및/또는 세포내 항원(n = 4 가짜 처리, n = 5 TMEV-IDD)을 평가하여 세포 구성을 분석하고 정량화하는 잘 확립된 기술인 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 얻는 데 중점을 두었습니다. 두 번째 실험은 석회질 제거된 뇌 및 척수 조직에 대한 면역조직화학을 활용하여 CNS 구획에서 B 및 T 세포 국소화를 설명하는 데 중점을 두었습니다(n = 3 가짜 치료, n = 8 TMEV-IDD).
TMEV-IDD 및 가짜 처리된 마우스에서 뇌, 척수 및 풀링된 수막(뇌 및 척수)에서 단세포 현탁액을 분리한 후 표면 염색 프로토콜을 모든 샘플에 적용했습니다. 간략히 설명하면, 단세포 현탁액을 15분 동안 고정가능한 생존율 배제 염색 (780)과 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 15분 동안 마우스 혈청의 존재 하에 Fc 블록으로 차단하고, CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3; PE-CF594) 및 CD4(GK1.5; PE)를 30분 동안28,29 이전에 기술하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 유세포 분석기28,29를 사용하여 분석하였다. 생존력 게이팅은 앞서 기술한바와 같이 수행하였다 28. CD45 발현은 CD45lo 미세아교세포(P2) 및 CD45-뉴런, 성상교세포, 및 뇌 및 척수의 희소돌기아교세포로부터 CD45hi 말초 유래 침윤 면역 세포(P1)를 구별하는 것으로 평가되었다(P3; 그림 3A). 가짜 처리된 마우스에서, 척수 및 뇌 조직에 거의 CD45hi 세포가 존재하지 않았다. 수막에서, CD45hi 면역 세포를 식별하기 위해 뇌 및 척수 데이터에 사용된 CD45hi 발현에 대한 동일한 게이팅 컷오프를 적용하였다(P1; 그림 3C) 수막에 존재하는 비면역 세포(즉, 섬유아세포, 내피 세포)를 제외합니다. 가짜 처리된 마우스에서, 수막에는 CD45hi 세포(<0.1%)가 거의 존재하지 않았다. TMEV-IDD CNS 조직의 CD45hi 면역 세포 중에서 B 세포 및 CD4 T 세포는 각각 CD19 및 CD4의 표면 발현에 의해 확인되었습니다(그림 3B-D). 모든 TMEV-IDD CNS 조직에서, CD45hi 면역 세포의 증가된 백분율이 가짜 처리된 마우스에 비해 관찰되었다(도 4A). 만성 TMEV-IDD 동안, 뇌 및 척수의 CD45hi 면역 세포 중 B 세포의 백분율은 수막 구획에 비해 더 높았다(도 4B).
만성 TMEV-IDD 동안 CNS 구획 내에서 B 세포 및 T 세포의 국소화를 확인하기 위해, 석회질 제거된 뇌 및 척수를 이전에 기술된 염색 프로토콜을 사용하여 면역조직화학을 사용하여 평가하였다29. 수막과 맥관 구조는 기저막 성분29,51인 라미닌과 섬유아세포 망상 세포 마커인 ER-TR7 52,53을 사용하여 구분되었습니다. 두개골 캡에서 뇌를 추출하는 동안 피아 층은 손상되지 않았지만 나머지 수막 층은 제외되었습니다(그림 5A). 척수에서 수압 압출은 모든 수막층이 없는 결과를 낳았습니다(데이터는 표시되지 않음). 석회질이 제거된 뇌와 척수 모두에서 모든 수막층이 손상되지 않았습니다(그림 5B). 만성 TMEV-IDD에서 B 및 T 세포 국소화를 조사하기 위해, IgG 발현을 사용하여 이소형-전환된 B 세포 29의 국소화를 결정하고, CD3를 사용하여 모든 T 세포29를 시각화하였다. IgG를 ER-TR7과 함께 염색한 결과, 이소형 전환 IgG+ B 세포가 CNS 실질 및 수막에 존재한다는 것이 밝혀졌습니다(그림 6A). ER-TR7+ 수막 내의 세포 응집체에는 여러 IgG+ B 세포와 CD3+ T 세포가 포함되어 있습니다(그림 6B).
대표적인 결과는 연령이 일치하는 가짜 처리된 마우스와 대조적으로 만성 TMEV-IDD 마우스의 실질 및 수막 구획에서 B 세포 및 T 세포 모두의 높은 비율을 보여줍니다. IHC 분석은 TMEV-IDD 조직에서 B 세포와 T 세포가 실질에 분산되어 있지만 수막에서는 밀접하게 연관되어 염증성 응집체를 형성한다는 것을 추가로 입증했습니다. 진행성 다발성 경화증 환자에서 수막 염증 응집체는 인접 조직 손상 및 더 나쁜 질병 결과와 관련이 있습니다. 만성 TMEV-IDD에서, CNS 구획 내의 지속적인 B 세포 및 T 세포 존재 및 수막에서의 응집은 조직 손상 및 질환 진행과 관련될 수 있다. 수막 대 실질 염증이 탈수초화, 신경변성 및 임상적 장애에 어떤 영향을 미치는지 이해하려면 추가 연구가 필요합니다.
그림 1: 석회질 제거를 위한 뇌와 척수 분리. 파란색 점선은 손상되지 않은 두개골(1-4번 절단)과 척추(5-8번 절단)로 뇌를 분리하기 위해 만들어진 절단을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단세포 기술을 위한 뇌, 척수 및 수막 분리. (A) 파란색 점선은 수막과 뇌(1-3번 절단)와 척추(5-7번 절단)가 손상되지 않은 두개골 캡을 분리하기 위해 절단된 절단을 나타냅니다. 측면 절단 3은 두개골의 양쪽에 이루어집니다. (B) 파란색 선은 두개골 캡의 수막을 채취 및 제거하기 위해 절개한 절개와 척수와 수막을 분리하기 위해 척추(양쪽 측면)에 절개한 부분을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CNS 조직에서 CD45hi 침윤 면역 세포의 식별. (A) 가짜 처리된 (적색) 또는 TMEV-IDD (청색) 마우스로부터의 척수의 총 살아있는 세포 중에서 CD45 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 뉴런 (P1), CD45lo 미세아교세포(P2) 및 CD45-희소돌기아교세포, 성상교세포 및 뉴런의 동정을 위한 게이팅 전략. 최소 CD45hi 세포는 가짜 처리된 뇌와 척수에서 검출되었습니다. (B) TMEV-IDD 마우스에서 CD45hi 침윤 면역 세포(P1) 중 CD19+ B 세포 및 CD4+ T 세포를 식별하기 위한 게이팅 전략. 게이팅 전략은 뇌와 척수 조직에서 유사했습니다. (C) 가짜 처리된(빨간색) 및 만성 TMEV-IDD 마우스(파란색)의 수막에서 CD45hi 세포(P1)를 식별하기 위한 게이팅 전략. (D) 만성 TMEV-IDD 마우스의 수막에서 CD45hi 침윤 면역 세포(P1) 중 CD19+ B 세포 및 CD4+ T 세포를 식별하기 위한 게이팅 전략. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: CD45hi 면역 세포 및 CD19+ B 세포는 만성 TMEV-IDD에서 CNS 조직에서 증가했습니다. 막대 그래프 가짜 치료 또는 TMEV-IDD 수막, 뇌 및 척수에서 얻은 유세포 분석 데이터의 요약은 CD45hi 침윤 면역 세포의 백분율(A) 또는 CD19+ B 세포의 백분율(B)을 보여줍니다. TMEV-IDD 조직의 경우, 척수와 뇌를 개별적으로 처리 한 5 마리의 마우스에서 유세포 분석 데이터를 얻었고, 수막은 분석을 위해 풀링되었습니다. 가짜 처리 된 마우스의 경우, 척수와 뇌를 개별적으로 처리 한 4 마리의 마우스에서 유세포 분석 데이터를 얻었고, 수막은 분석을 위해 풀링되었습니다. 척수 및 뇌에 대한 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 석회질 제거된 뇌와 척수의 손상되지 않은 수막층. (A) 두개골 캡에서 추출한 뇌 또는 (B) 만성 TMEV-IDD 마우스의 두개골과 척추가 손상되지 않은 석회질 제거된 뇌를 DAPI(파란색), 수막 마커 라미닌(녹색) 및 ER-TR7(빨간색)에 대해 평가했습니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 만성 TMEV-IDD 동안 수막에서 면역 세포 응집이 분명했습니다. (A) 실질과 ER-TR7+ 수막(빨간색)에서 동형 전환 면역 세포를 식별하기 위해 Chronic-TMEV-IDD 마우스의 석회질 제거 척추를 IgG(녹색)의 존재 여부를 조사했습니다. (B) 척수 조직 내 국소화를 평가하기 위해 CD3+ T 세포(녹색) 및 IgG+ 이소형 전환 B 세포(빨간색)를 ER-TR7+ 수막과 함께 염색했습니다. 흰색 화살표는 수막 내의 B 및 T 세포를 강조 표시합니다. 스케일 바 = 50 μm. 흰색 상자는 잘라낸 이미지를 위해 선택한 영역을 나타냅니다(오른쪽, 축척 막대= 10μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
항상성 및 질환 동안 CNS 구획 내의 세포 조성을 평가하기 위한 방법은 CNS의 생리학적 및 병리학적 상태를 이해하는데 필수적이다. 그러나 CNS에서 중요한 장벽 역할을 하고 다양한 면역 세포를 수용함에도 불구하고 뇌와 척수에 대한 기존의 많은 조직 추출 방법이 이러한 막의 수집을 허용하지 않기 때문에 수막은 종종 분석에서 생략됩니다. 이러한 누락은 수막의 세포 구성과 기능, 정상 상태 및 염증 상태에서의 역할에 대한 이해를 높이는 데 중요한 한계입니다. 최근 연구에 따르면 수막 구획에 상주하는 상주 및 말초 유래 면역 세포는 모두 CNS의 항상성을 유지하고 CNS 질병 발병을 유도하는 데 필수적인 역할을 합니다. 이 연구는 실질 구획뿐만 아니라 주변 수막층을 분석 할 필요성을 강조합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 수막을 보존하면서 뇌와 척수를 신속하게 분리할 수 있도록 하여 궁극적으로 조직학적 연구와 단일 세포 연구를 모두 활용하여 CNS 구획의 포괄적인 다운스트림 분석을 가능하게 합니다. 대표적인 결과는 CNS 구획의 면역 세포를 평가하는 데 중점을 둡니다. 그러나, 프로토콜은 미세아교세포, 성상교세포, 뉴런, 혈관주위세포, 내피 세포, 또는 다른 CNS 상주 세포를 분석하기 위해 적응될 수 있다.
설명된 방법의 중요한 단계는 뇌, 척수 및 수막에서 순수한 단세포 현탁액을 분리하고 손상되지 않은 두개골 또는 척추가 있는 CNS 조직을 얻어 고품질 조직 형태를 허용하는 데 필수적인 조직을 신중하게 추출하는 것입니다. 단일 세포 현탁액을 얻는 기술을 연습하는 것은 샘플의 순도를 향상시킬 뿐만 아니라 다운스트림 응용 분야의 세포 수율을 향상시키기 때문에 성공적인 조직 추출의 핵심입니다. 유사하게, 뼈를 둘러싼 과도한 조직을 적절하게 제거하기 위해 손상되지 않은 두개골 또는 척추가 있는 CNS 조직을 분리하는 연습은 고품질 형태 및 온전한 항원 표적을 가진 조직 절편을 얻기 위한 모든 중요한 구성 요소인 조직의 더 나은 고정, 석회화 및 냉동 보존을 보장하는 필수 단계입니다.
수막에서 단세포 현탁액을 분리하기 위한 프로토콜의 한 가지 한계는 성상교세포 과정을 통해 뇌 또는 척수에 부착된 채로 남아 있는 피아의 분리를 생략하면서 경막 및 거미막 수막32,54를 얻는 데 초점을 맞춘다는 것입니다. 피아 메이터에 상주하는 세포는 수막 구획의 필수 구성 요소이지만, 적절하게 분리하는 데 필요한 시간이 길기 때문에 단일 세포 현탁액 준비 중에 피아 메이터를 제외하기로 결정되었다55. 유사하게, 프로토콜은 두개골의 위쪽 부분에서 수막을 얻는 데에만 초점을 맞추고 뇌와 맥락막 신경총에서 침입하는 수막의 분리를 배제합니다. 침윤 수막과 맥락막 신경총의 수집은 이전에 발표된 프로토콜55에 따라 수행할 수 있지만 시간이 많이 소요되는 절차입니다. 두 경우 모두 수막층의 일부를 생략하기로 한 선택은 수막층을 분리하는 데 필요한 시간 때문이었습니다. 유세포 분석, 세포 배양 분석 및 RNA 시퀀싱(RNAseq)과 같은 다운스트림 응용 분야에 필요한 단일 세포 현탁액을 준비하는 데 사용되는 프로토콜의 타이밍은 세포 생존율과 데이터 품질을 개선하는 데 매우 중요합니다. 따라서 특정 연구 질문에 따라 샘플 분리 시간과 수막 추출의 철저함 사이에서 균형을 유지해야 합니다. 현재 프로토콜에서는 경막 및 지주막 수막에서 단일 세포 현탁액 제제만 얻을 수 있으며, 이는 결과를 CNS 수막 전체로 외삽하는 능력을 제한합니다. 그러나 이러한 방법을 3개의 수막 층이 있는 전체 조직 절편의 IHC 또는 ISH 분석과 함께 사용하면 실질 및 수막 구획의 세포 및 분자 역학에 대한 보다 철저한 이해를 얻을 수 있습니다.
프로토콜의 또 다른 한계는 특히 항상성 상태에서 경막 및 지주막 수막에서 얻은 낮은 세포 수입니다. 그러나, 척수, 뇌 또는 수막의 세포 수가 특정 표적 세포 집단의 분석에 너무 낮다고 간주되는 경우, 희귀 사건 분석을 전문으로 하는 이전 문헌에 기술된 바와 같이 주어진 정밀도(예를 들어, 5% 변동 계수)에 필요한 총 사건 수를 추정함으로써 해당 분석에 필요한 최소 세포 수를 결정할 수 있다56. 그런 다음 이러한 계산을 사용하여 관심 있는 세포 집단을 분석하기에 충분한 세포 수를 얻기 위해 여러 동물의 샘플을 풀링해야 하는지 여부를 결정할 수 있습니다.
설명된 방법은 일반적으로 무시되는 수막 구획을 포함하도록 분석을 확장함으로써 CNS 구획 내의 세포 역학 조사에 필수적인 발전을 제공합니다. 이러한 프로토콜을 통해 뇌, 척수, 경막 및 지주막 수막을 개별적으로 추출하여 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있습니다. 또한, 석회질 제거 프로토콜은 3개의 수막층을 포함하는 뇌 또는 척수 조직으로 구성된 조직 절편의 조직학적 분석을 가능하게 합니다. EDTA를 활용하면 느리지만 부드러운 석회질 제거 과정이 제공되며, 이는 고품질 조직 형태가 필요한 검체(예: IHC 및 ISH)에 가장 적합합니다. 이 프로토콜은 7.2–7.4의 pH를 사용하여 석회질 제거 속도를 늦추고 손상되지 않은 조직 형태의 유지를 보장하며, 이는 석회질 제거 시간이 짧지만 조직 형태의 품질에 영향을 미치는 강산 및 약산(예: 염산 및 트리클로로아세트산)에 비해 분명한 이점입니다.
수막에서 단일 세포 현탁액을 분리하려는 미래의 방법은 CNS 조직과 뇌의 침입 수막에서 피알층을 완전히 분리하는 데 필요한 시간을 단축하는 프로토콜 개발에 중점을 두어야 합니다. 3개의 수막층의 완전한 복합체를 얻는 것은 모든 분석을 위한 세포 수를 증가시킬 뿐만 아니라 CNS를 둘러싸고 있는 수막을 차지하는 상주 및 침윤 면역 세포에 대한 보다 포괄적인 평가를 제공할 것입니다. 동시에, 석회질 제거된 뇌와 척수를 준비하는 데 초점을 맞춘 미래 프로토콜은 조직 형태의 품질을 유지하면서 조직 석회질을 촉진하는 것을 목표로 하는 새로운 제제를 식별하기 위해 노력해야 합니다. 그러나 포괄적인 조직 절편 분석과 함께 수행되는 이중 및 거미 수막을 포함하는 CNS 단일 세포 현탁액을 분석하는 다운스트림 애플리케이션은 CNS 구획 내의 세포 표현형, 기능 및 국소화에 대한 자세한 이해를 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 다트머스 (Dartmouth)의 비교 의학 및 연구 센터 (CCMR) 직원들에게이 연구에 사용 된 마우스에 대한 전문적인 관리에 감사드립니다. Bornstein Research Fund가이 연구에 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | any | N/A | |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | 37002D | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-12R centrifuge | |
| Collagenase I | Worthington | LS004196 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 525-1069 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Cover glass | Hauser Scientific | 5000 | |
| Cryomold | VWR | 18000-128 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-14 | |
| Disposable polystyrene tube, 14 mL | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| Disposable Scalpel | Fisher Scientific | NC0595256 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dry ice | Airgas | N/A | |
| Durmont #7Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco | 0105-500g | |
| Ethanol, 100% | any | N/A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Filter top tube, 5 mL | VWR | 352235 | |
| Fixable viability stain 780 | Becton Dickinson | 565388 | |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) | Jackson immunoresearch | 115-546-146 | |
| Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) | Jackson immunoresearch | 115-586-146 | |
| Goat anti-rabbit 488 | Jackson immunoresearch | 111-545-144 | |
| Goat anti-rat 594 | Jackson immunoresearch | 112-585-167 | |
| Goat anti-rat 650 | Jackson immunoresearch | 112-605-167 | |
| Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-020-CV | |
| Hemacytometer | Andwin Scientific | 02-671-51B | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| KCl | Fisher chemical | BP366-500 | |
| KH2PO4 (anhydrous) | Sigma Aldrich | P5655-100G | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | N/A | |
| Mouse FC block (CD16/32) | Becton Dickinson | 553141 | |
| Na2HP04 (anhydrous) | Fisher Chemical | S374-500 | |
| NaCl | Fisher chemical | S671-500 | |
| Needle, 25 gauge | Becton Dickinson | 305122 | |
| Normal mouse serum | ThermoFisher Scientific | 31881 | |
| Nylon mesh strainer | VWR | 352350 | |
| OCT | Sakura | 4583 | |
| Paraformaldehyde, 20% | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Diluted to 4% using 1 x PBS |
| Pasteur pipette, 9 inch, unplugged | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBS (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| PE Rat Anti-Mouse CD4 | Becton Dickinson | 553730 | |
| PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 | Becton Dickinson | 562329 | |
| Percoll density gradient media | GE healthcare | 17-0891-01 | |
| PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 | Becton Dickinson | 550994 | |
| Petri dish, 100 mm | VWR | 353003 | |
| pH meter | Fisher Scientific | 13-636-AB150 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Corporation | 4-000-101 | |
| Pipette 200 µl | Gilson | FA10005M | |
| Pipette tips, 1 mL | USA Scientific | 1111-2831 | |
| Pipette tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1816 | |
| Pipette, 1 mL | Gilson | FA10006M | |
| Prolong Diamond mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36962 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | Becton Dickinson | 553141 | |
| Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) | Abcam | ab16669 | |
| Rabbit anti-mouse laminin | Abcam | ab11575 | |
| Rat anti-mouse ERT-R7 | Abcam | ab51824 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Serological pipet, 1 mL | VWR | 357521 | |
| Serological pipet, 10 mL | VWR | 357551 | |
| Serological pipet, 5 mL | VWR | 357543 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-500 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-16 | |
| Surgical scissors, extra fine | Roboz | RS-5882 | |
| Syringe, 10 mL | Becton Dickinson | 302995 | |
| Syringe, 5 mL | Becton Dickinson | 309646 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| Vacuum filter system | Millipore | 20207749 | |
| Vacuum flask | Thomas Scientific | 5340-2L | |
| Vacuum in-line filter | Pall Corporation | 4402 | |
| Vacuum line | Cole Palmer | EW-06414-20 | |
| Water bath | ThermoFisher Scientific | Versa bath |
References
- Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
- Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
- Rua, R., McGavern, D. B.
- Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
- Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
- Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
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