Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isoleren van weefsels van het centrale zenuwstelsel en bijbehorende hersenvliezen voor de downstream-analyse van immuuncellen

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

Dit artikel presenteert twee geoptimaliseerde protocollen voor het onderzoeken van residente en perifeer afgeleide immuuncellen in het centrale zenuwstelsel, waaronder de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen. Elk van deze protocollen helpt bij het vaststellen van de functie en samenstelling van de cellen die deze compartimenten bezetten onder steady state en ontstekingsomstandigheden.

Abstract

Het centrale zenuwstelsel (CZS) bestaat uit de hersenen en het ruggenmerg en wordt omhuld door de hersenvliezen, vliezige lagen die dienen als een barrière tussen de periferie en het CZS. Het CZS is een immunologisch gespecialiseerde plaats en in steady state-omstandigheden is immuunprivilege het duidelijkst in het CZS-parenchym. Daarentegen herbergen de hersenvliezen een breed scala aan residente cellen, waaronder aangeboren en adaptieve immuuncellen. Tijdens ontstekingsaandoeningen veroorzaakt door CZS-letsel, auto-immuniteit, infectie of zelfs neurodegeneratie, kunnen perifeer afgeleide immuuncellen het parenchym binnendringen en hun intrek nemen in de hersenvliezen. Van deze cellen wordt gedacht dat ze zowel gunstige als schadelijke acties uitvoeren tijdens de pathogenese van de ziekte van het CZS. Ondanks deze kennis worden de hersenvliezen vaak over het hoofd gezien bij het analyseren van het CZS-compartiment, omdat conventionele CZS-weefselextractiemethoden de meningeale lagen weglaten. Dit protocol presenteert twee verschillende methoden voor de snelle isolatie van muizen CZS-weefsels (d.w.z. hersenen, ruggenmerg en hersenvliezen) die geschikt zijn voor downstream-analyse via eencellige technieken, immunohistochemie en in situ hybridisatiemethoden. De beschreven methoden bieden een uitgebreide analyse van CZS-weefsels, ideaal voor het beoordelen van het fenotype, de functie en de lokalisatie van cellen die het CZS-compartiment bezetten onder homeostatische omstandigheden en tijdens ziektepathogenese.

Introduction

Het centrale zenuwstelsel (CZS) is een immunologisch gespecialiseerde plaats. Het CZS-parenchym, met uitzondering van de CSF-ruimte, de hersenvliezen en de vasculatuur, wordt klassiek gezien als een immuunbevoorrechte plaats 1,2,3,4,5 en is relatief verstoken van immuuncellen tijdens homeostatische omstandigheden 2,6,7. Daarentegen zijn de hersenvliezen, bestaande uit de dura-, arachnoïde- en pialagen, cruciale componenten van het CZS-compartiment, die actief deelnemen aan homeostatische immuunsurveillance en ontstekingsprocessen tijdens ziektepathogenese 3,6,7,8. Tijdens steady state-omstandigheden ondersteunen de hersenvliezen talrijke immuunschildwachtcellen, waaronder aangeboren lymfoïde cellen (ILC), macrofagen, dendritische cellen (DC), mestcellen, T-cellen en in mindere mate B-cellen 9,10,11.

De hersenvliezen zijn sterk gevasculariseerde structuren en bevatten lymfevaten die zorgen voor een lymfatische verbinding tussen het CZS en de periferie 8,12,13,14. Bij ontstekingsaandoeningen veroorzaakt door CZS-letsel, infecties, auto-immuniteit of zelfs neurodegeneratie, infiltreren perifeer afgeleide immuuncellen het parenchym en veranderen het immuunlandschap in de hersenvliezen. Na celinfiltratie kunnen de hersenvliezen een functionele niche vormen voor perifeer afgeleide immuuncellen, waardoor immuuncelaggregatie, lokale immuuncelactivering en overleving op lange termijn in het CZS-compartiment worden bevorderd. Prominente meningeale ontsteking wordt waargenomen bij meerdere ziekten die het CZS beïnvloeden, waaronder multiple sclerose (MS) 15,16,17,18,19, beroerte 20,21, steriel letsel 22,23 (d.w.z. ruggenmergletsel en traumatisch hersenletsel), migraine 24 en microbiële infectie 25,26,27,28,29. De karakterisering van residente cellen en perifeer afgeleide immuuncellen in het meningeale compartiment is dus essentieel voor het begrijpen van de rol van deze cellen tijdens steady state-omstandigheden en ziektepathogenese.

De extractie van de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen uit de schedel en wervellichamen is technisch uitdagend en tijdrovend. Er zijn momenteel geen technieken beschikbaar voor de snelle extractie van de hersenen met alle drie de meningeale lagen intact. Hoewel laminectomie een uitstekende morfologie van het ruggenmergweefsel oplevert en de meningeale lagen behoudt, is het zowel extreem tijdrovend als gecompliceerd30,31. Omgekeerd vergemakkelijken meer conventionele extractiemethoden zoals de verwijdering van de hersenen uit de schedel en de hydraulische extrusie van het ruggenmerg de snelle extractie van het CZS-weefsel, maar zowel de arachnoïdale als durale hersenvliezen gaan verloren met deze technieken30,31. Het weglaten van dura- en arachnoïdelagen tijdens conventionele isolatie van hersen- en ruggenmergweefsels resulteert in een onvolledige analyse van de cellen in het CZS-compartiment. De identificatie van nieuwe technieken gericht op de snelle extractie van CZS-weefsels met intacte hersenvliezen is dus cruciaal voor de optimale analyse van het CZS-compartiment.

Dit manuscript presenteert twee methoden voor de snelle extractie van de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen van muizen, waardoor de stroomafwaartse analyse van residente cellen en perifeer afgeleide immuuncellen in het CZS-parenchym en hersenvliezen wordt vergemakkelijkt. Deze geoptimaliseerde protocollen richten zich op 1) het isoleren van eencellige suspensies voor downstream-analyse en 2) het voorbereiden van weefsel voor histologische verwerking. Het verkrijgen van eencellige suspensies uit de hersenen, ruggenmergweefsel en durale en arachnoïdalehersenvliezen 32 maakt de gelijktijdige analyse mogelijk van cellen die zich in zowel het parenchymale als het meningeale compartiment bevinden. Eencellige suspensies kunnen worden gebruikt in verschillende toepassingen, waaronder celkweektests om in vitro stimulatie 33 uit te voeren, enzyme-linked immunospot (ELISpot) 28,34,35, flowcytometrie 36,33 en single-cell 37 of bulk transcriptomics. Bovendien zorgt het geoptimaliseerde protocol voor ontkalking van hele hersenen en ruggenmerg met intacte schedels of wervelkolommen respectievelijk voor de zachte ontkalking van het omliggende bot, waardoor de hersenvliezen intact blijven en de weefselmorfologie behouden blijft. Deze methode maakt de selectieve identificatie van eiwitten of RNA mogelijk met behulp van immunohistochemie (IHC) of in situ hybridisatie (ISH) technieken binnen zowel de parenchymale als meningeale ruimten. De karakterisering van het fenotype, de activeringstoestand en de lokalisatie van residente cellen en perifeer afgeleide immuuncellen in het CZS kan informatie opleveren die essentieel is om te begrijpen hoe individuele celtypen in het CZS-compartiment bijdragen aan homeostase en ziektepathogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al het dierenwerk maakt gebruik van protocollen die zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Geisel School of Medicine in Dartmouth.

1. Verwerking van hersen- en ruggenmergmonsters voor ontkalking

  1. Isoleren van hersen- en ruggenmergmonsters
    1. Euthanaseer de muis via CO 2-inhalatie. Zorg ervoor dat het CO 2-debiet 10%-30% van het kooivolume per minuut verplaatst.
    2. Til met een tang het xiphoid-proces op en knip de buikwand zijdelings net onder de ribbenkast door met een schaar, omhoog trekkend om te voorkomen dat onderliggende bloedvaten of organen worden doorgesneden. Snijd het diafragma zijdelings door.
    3. Snijd de ribbenkast langs de zijranden evenwijdig aan de longen tot aan het sleutelbeen. Til met een tang het borstbeen op en klem het borstbeen vast met een hemostat. Plaats de hemostat over het hoofd om de ribbenkast weg te tillen en het hart bloot te leggen.
    4. Grijp met een tang het hart bij de top en maak een incisie in het rechteratrium van het hart om een uitlaatklep te bieden. Plaats een naald van 25 G met een spuit van 10 ml bevestigd om langzaam 10 ml ijskoude 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in de linker ventrikel toe te dienen om de muis transcardiaal te doordrenken.
      OPMERKING: Perfusie moet gedurende 4-5 minuten plaatsvinden totdat de lever vrij is van bloed. Een totaal van 10 ml 1x PBS is meestal voldoende voor perfusie, maar indien nodig kan er meer worden gebruikt. Een heldere lever duidt meestal op voldoende perfusie.
    5. Verwijder met een scherpe schaar het hoofd door onthoofding (figuur 1; 1). Maak een middellijnincisie in de huid (figuur 1; 2) en draai de huid over de ogen om de schedel vrij te maken.
    6. Snijd bij het neusbeen om de onderkaak uit de schedel los te maken (figuur 1; 3). Verwijder de onderkaak, tong en ogen. Snijd langs de laterale aspecten van de schedel om het weefsel langs de externe auditieve meatus vrij te maken (figuur 1; 4). Trim om alle overtollige huid, spieren en weefsel over de schedel te verwijderen.
    7. Scheid de ribbenkast van de wervelkolom door evenwijdig aan de wervelkolom te knippen met een scherpe schaar (figuur 1; 5 en 6). Maak een kleine snee in het onderste lumbale gebied om de wervelkolom te isoleren (figuur 1; 7). Trim en verwijder alle resterende spieren langs de wervelkolom om de wervels bloot te leggen (figuur 1; 8).
      OPMERKING: Het verwijderen van overtollig weefsel uit de wervelkolom en schedel is noodzakelijk om voldoende penetratie van fixatieve paraformaldehyde (PFA) en ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) ontkalkingsbuffer te verkrijgen.
  2. Postfixatie, ontkalking en cryopreservatie
    1. Plaats met behulp van een tang de hersenen met de intacte schedel of wervelkolom in een conische buis van 15 ml met 10 ml 4% PFA. Plaats de buizen gedurende ten minste 48 uur op 4 °C voor een adequate fixatie.
      OPMERKING: Om overfixatie van het weefsel te voorkomen, mag u niet langer zijn dan 72 uur fixatie. Fixatietijden worden verlengd voor botmonsters vóór ontkalking. Adequate fixatie beschermt weefsel tegen de effecten van de ontkalking en zorgt voor een betere weefselmorfologie.
    2. Spoel de hersenen of het ruggenmerg door het weefsel van de 4% PFA met een tang te verwijderen en het weefsel gedurende 5 minuten in een wegwerpbuis van 14 ml met 10 ml 1x PBS te plaatsen. Breng de hersenen of het ruggenmerg over in een conische buis van 50 ml met 10 ml 10% EDTA (pH = 7,2-7,4).
      OPMERKING: Het gebruik van een grotere buis met 10 ml EDTA geeft de EDTA een groter contactoppervlak met het weefsel en versnelt het ontkalkingsproces.
    3. Controleer dagelijks of het bot zacht en buigzaam is: verwijder het weefsel uit de EDTA-oplossing met een tang, plaats het op een petrischaaltje en test de zachtheid van het bot voorzichtig met een naald van 25 G. Als de naald gemakkelijk het bot binnendringt, is het ontkalkingsproces voltooid.
    4. Verwijder het weefsel uit de EDTA-oplossing en breng de hersenen of het ruggenmerg over naar een wegwerpbuis van 14 ml met 10 ml 1x PBS en was gedurende 10 minuten. Herhaal de wasbeurt.
      OPMERKING: Ontkalking duurt meestal 2-3 dagen. De oplossing moet om de 2-3 dagen worden vervangen als het bot nog niet voldoende is ontkalkt. Langdurige incubatie in EDTA nadat het bot is ontkalkt, kan echter de weefselmorfologie beschadigen.
    5. Bereid 10%, 20% en 30% sucrose-oplossingen door sucrose toe te voegen aan 1x PBS. Voeg bijvoorbeeld voor 10% sucrose 10 g sucrose toe en breng het volume op 100 ml met steriele 1x PBS. Bewaar de oplossing bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
      OPMERKING: Sucrose-oplossingen zijn gevoelig voor de groei van micro-organismen, dus monsters mogen niet gedurende langere tijd in deze oplossingen worden bewaard.
    6. Verwijder het weefsel uit de 1x PBS, plaats het in 10 ml 10% sucrose-oplossing en bewaar het bij 4 °C. Laat het weefsel 24 uur zitten of totdat het naar de bodem van de buis zakt.
    7. Herhaal dit proces en verplaats het weefsel eerst naar een 20% sucrose-oplossing en uiteindelijk naar een 30% sucrose-oplossing. Laat het weefsel inzinken in 30% sucrose (ten minste 24 uur) en ga verder met het insluiten van het weefsel.
  3. Insluiten en invriezen van weefsel
    1. Verwijder met een tang het weefsel van de 30% sucrose, plaats het op een petrischaal en kantel de schaal om overtollige sucrose-oplossing op het weefsel te verwijderen. Snijd met behulp van een scalpel het weefsel in de gewenste segmenten.
    2. Maak een dunne laag optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding aan de onderkant van de cryomold en plaats de weefselstukken in de mal. Bedek het weefsel volledig met de OCT-verbinding en zorg ervoor dat er geen bubbels aanwezig zijn.
    3. Flash vries de blokken in door over vloeibare stikstof38 te zweven of de blokken op een 100% isopropanol / droogijsbrij39 te zetten totdat het blok ondoorzichtig is. Wikkel de cryomolds in aluminiumfolie en bewaar de blokken bij -80 °C voor langdurige opslag. Verplaats blokken naar -20 °C voordat u ze doorsnijdt.
      OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het doorsneden en uitvoeren van histologieprotocollen op ontkalkte hersenen, omdat de schedel- en meningeale lagen verloren kunnen gaan als de secties ruw worden behandeld.

2. Voorbereiding van de hersenvliezen en CZS-weefsels voor flowcytometriekleuring

  1. Het extraheren van de schedelkap en de hersenen
    1. Verwijder met een scherpe schaar het hoofd door onthoofding (figuur 2A; 1). Maak met een schaar een middellijnincisie in de huid (figuur 2A; 2) en draai de huid over de ogen om de schedel vrij te maken.
    2. Plaats de schaar in het foramen magna en begin de schedel zijdelings langs de cortices naar de reukbol te knippen, waarbij de incisies boven de uitwendige auditieve meatus en onderkaak blijven (figuur 2A; 3). Voer dezelfde sneden uit aan de andere kant, met sneden die samenkomen bij de bulbus olfactorius om de schedelkap van de hersenen te bevrijden (figuur 2A; 3).
    3. Verwijder met een tang het schedelkapje en plaats het schedelkapje in een conische buis van 15 ml met 5 ml koud RPMI-medium aangevuld met 25 mM HEPES. Houd de buis op ijs.
    4. Gebruik een gebogen tang, plaats de tang onder de basis van de hersenen en til op om de hersenen te bevrijden van de schedelkap. Plaats de hersenen in een conische buis van 15 ml met 5 ml koude RPMI aangevuld met 25 mM HEPES. Houd de buis op ijs totdat deze is verwerkt.
  2. Extraheren van de wervelkolom en het ruggenmergweefsel
    1. Scheid met behulp van een tang en een scherpe schaar de ribbenkast van de wervelkolom door parallel aan de wervelkolom te knippen (figuur 2A; 4 en 5). Maak een kleine snee in het onderste lumbale gebied om de wervelkolom te isoleren (figuur 2A; 6). Trim en verwijder alle resterende spieren langs de wervelkolom om de wervels bloot te leggen (figuur 2A; 7).
    2. Plaats de extra fijne chirurgische schaar in de wervelkolom en knip langs de zijrand van de kolom (figuur 2C). Snijd de tegenoverliggende zijrand volledig af om de wervelkolom in een voorste en achterste gedeelte te verdelen.
      OPMERKING: Het ruggenmerg blijft vastzitten aan de wervelkolom.
    3. Verwijder met behulp van een tang langzaam en voorzichtig het ruggenmerg van de wervelkolom en plaats het weefsel in een conische buis van 15 ml met 5 ml koude RPMI met 25 mM HEPES. Breng de voorste en achterste delen van de wervelkolom over naar een conische buis van 15 ml met 5 ml koude RPMI met 25 mM HEPES.
  3. Het verwijderen van de hersenvliezen om eencellige suspensies te bereiden
    1. Verwijder met een tang het schedelkapje van het RPMI-medium. Met behulp van een scherpe tang (#7 tang; Tabel met materialen), scoor rond de buitenrand van de schedelkap (figuur 2B) en pel de hersenvliezen weg van de rand van de schedelkap, schrap om de durale en arachnoïdale hersenvliezen te verwijderen. Leg de hersenvliezen op een petrischaaltje.
      OPMERKING: Het verwijderen van de hersenvliezen uit zowel de hersenen als het ruggenmerg vereist oefening. Als de gebruiker problemen ondervindt bij het extraheren van de hersenvliezen, gebruik dan een ontleedmicroscoop om te helpen bij het verwijderen.
    2. Verwijder de wervelkolom uit de buis. Scoor met een scherpe tang rond de randen van de wervelkolom om de hersenvliezen vrij te maken en pel de hersenvliezen van de rand van de wervel af met een gebogen tang. Leg de hersenvliezen op een petrischaaltje.
    3. Plaats een nylon gaaszeef in een conische buis van 50 ml. Verplaats de hersenvliezen in de zeef en voeg 3 ml RPMI toe, aangevuld met 25 mM HEPES. Gebruik de zuiger van een spuit van 5 ml en maal het weefsel en de media door de zeef.
    4. Was de zeef met behulp van een serologische pipet van 5 ml met nog eens 2 tot 3 ml RPMI/HEPES-media totdat al het zichtbare weefsel door de zeef is gegaan.
      OPMERKING: Om voldoende celaantallen te verkrijgen voor flowcytometrische analyse, moeten hersenvliezen van meerdere dieren mogelijk worden samengevoegd. In dit experiment (figuur 3 en figuur 4) werden de hersen- en ruggenmerghersenvliezen van 4-5 muizen samengevoegd. Als de monsters worden samengevoegd, zijn extra media nodig om het weefsel door de nylon gaaszeef te slijpen om oververhitting van het weefsel te voorkomen.
    5. Breng met behulp van een serologische pipet van 10 ml de cellen en media over in een verse conische buis van 15 ml. Was met behulp van een serologische pipet van 10 ml de conische buis van 50 ml met 5 ml media om eventuele resterende cellen te verzamelen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
    6. Gebruik een Pasteur-pipet met vacuüm, zuig het supernatant voorzichtig op om de celkorrel te vermijden en resuspendien de cellen in een geschikt volume en buffer.
    7. Om de eencellige suspensie te tellen, verdunt u een klein volume van de cellen (d.w.z. 5-10 μL) met trypanblauwe uitsluitingskleurstof (1:10 verdunning) en RPMI. Voeg 10 μL van de verdunning toe aan de hemocytometer.
    8. Tel de cellen zoals eerder beschreven40,41, gemiddeld ten minste twee 16 vierkante rasters voor nauwkeurigheid.
      OPMERKING: In figuur 3 werden bijvoorbeeld gepoolde, gepelletiseerde cellen uit de hersenvliezen geresuspendeerd in 250 μL fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer (1x PBS met 1% FBS) voor downstream oppervlaktekleuring. De cellen werden 1:10 verdund voor het tellen (5 μL cellen, 5 μL trypan blauw, 40 μL RPMI). Deze verdunning leverde tussen de 50-100 cellen per 16 vierkante rasters op, wat zorgde voor een nauwkeurigere celtelling omdat de cellen niet te dicht en overlappend of te dun zijn. Nucleated cell counts van gepoolde hersen- en ruggenmerghersenvliezen per muis waren als volgt: Voor hersenvliezen van sham-treatment muizen = 100.000-150.000 cellen en voor hersenvliezen van Theiler's murine encephalomyelitis virus-geïnduceerde demyeliniserende ziekte (TMEV-IDD) muizen = 300.000-350.000 cellen. Het aantal cellen zal variëren, afhankelijk van de precisie van verzameling, verwerking en of meningeale ontsteking aanwezig is.
    9. Ga verder met de gewenste eencellige techniek zoals een FACS-oppervlak (figuur 3)14,36,42,43,44, intracellulaire kleuringsprotocollen 33,45, in vitro stimulatie, celkweektests 33,46,47, ELISPOT-test 28,34,35 en bulk- of eencellige Transcriptomics 37,48.
      OPMERKING: Houd alle buizen op ijs tussen de verwerkingsstappen door.
  4. Het voorbereiden van eencellige suspensies van hersen- en ruggenmergweefsel
    1. Breng het hersen- of ruggenmergweefsel met media over naar de bovenkant van de 100 mm petrischaal door het weefsel en de media uit de buis te gieten. Verplaats met een tang het weefsel naar de bodem van de petrischaal. Hak de hersenen of het ruggenmerg fijn met een steriel scheermesje. Verplaats met het scheermesje het gehakte weefsel naar de bodem van de plaat door te schrapen om het weefsel te verzamelen.
      OPMERKING: Voor het onderstaande enzymatische verteringsprotocol kunnen maximaal twee ruggenmerg worden samengevoegd voor verwerking. Hersenen moeten individueel worden verwerkt.
    2. Voeg met behulp van een serologische pipet van 5 ml 3 ml RPMI aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) toe aan de petrischaal. Met behulp van een serologische pipet van 10 ml, pipet op en neer om het weefsel in de media te resuspenderen en over te brengen naar een conische buis van 15 ml.
      OPMERKING: Als de downstream-toepassing eencellige of bulk-RNA-sequencinganalyse of celcultuur is, moeten FCS-partijen worden getest om ervoor te zorgen dat cellen niet vóór de analyse worden geactiveerd. Als alternatief kunnen cellen worden verwerkt met behulp van 1x PBS met 0,04% BSA in plaats van RPMI met 10% FCS.
    3. Was met behulp van een serologische pipet van 10 ml de petrischaal met een extra 2 ml media om eventueel achtergebleven weefsel te verzamelen en over te brengen naar een conische buis voor een totaal volume van 5 ml. Houd de buizen op ijs tussen de verwerkingsstappen door.
    4. Gebruik een pipet om het collagenase I-poeder in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) -media te resuspenderen om de gewenste concentratie (d.w.z. 100 mg / ml) te verkrijgen. Voeg collagenase type I toe aan de conische buis met het gehakte weefselmonster om de gewenste eindconcentratie te verkrijgen (d.w.z. 50 μL voor 1 mg / ml).
      OPMERKING: Hogere concentraties collagenase zullen de celopbrengst verhogen, maar kunnen celoppervlakmarkers splitsen. Daarom moeten collagenase I-partijen worden getitreerd om de optimale concentratie te bepalen die nodig is om het hoogste aantal levensvatbare cellen te verkrijgen met alle vereiste celoppervlakmarkers intact. Collagenase I werd bijvoorbeeld getest in eindconcentraties van 0,5 mg / ml, 1 mg / ml en 2 mg / ml op monsters van één hersenen of ruggenmerg. De levensvatbaarheid van cellen werd bepaald met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode en celoppervlakmarkers CD45, CD19 en CD4 werden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. Een concentratie collagenase van 1 mg/ml I leverde het hoogste aantal levende cellen op met behoud van alle relevante celoppervlakmarkers. Deze concentratie werd dus gebruikt voor verdere experimenten met deze celtypen.
    5. Suspensie DNase I poeder voorzichtig met 0,15 M natriumchloride tot de gewenste voorraadconcentratie. Voeg de geresuspendeerde DNase I toe aan de conische buis met het gehakte weefselmonster om een eindconcentratie van 20 E/ml te verkrijgen.
      OPMERKING: DNase I-partijen variëren per activiteitseenheid per ml. De concentratie die aan het weefselmonster moet worden toegevoegd, verandert op basis van de activiteitseenheden per milliliter van de voorraadinjectieflacon. De uiteindelijke gewenste concentratie per monster is 20 E/ml.
    6. Plaats de buizen in een buizenrek in een waterbad van 37 °C en incubeer gedurende 40 minuten. Keer de buisjes elke 15 minuten om om het weefsel grondig te mengen met de enzymen. Voeg na incubatie 500 μL 0,1 M EDTA (pH = 7,2) toe aan elke buis voor een eindconcentratie van 0,01 M EDTA en incubeer gedurende nog eens 5 minuten om het collagenase te inactiveren.
    7. Voeg met behulp van een serologische pipet van 10 ml 9 ml RPMI aangevuld met 10% FCS toe aan elke buis om het volume van elke buis op ~ 14,5 ml te brengen. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gebruik een Pasteur-pipet met vacuüm, zuig het supernatant op en zorg ervoor dat u de celkorrel niet aanraakt.
    8. Voeg met behulp van een serologische pipet van 5 ml 3 ml 100% stock isotone dichtheidsgradiëntoplossing toe aan de buis met de celpellet. Voeg met behulp van een serologische pipet van 10 ml extra RPMI 10% FCS-media toe om het uiteindelijke volume op 10 ml te brengen en resuspensie van de celpellet om een 30% stock isotone dichtheidsgradiëntoplossingslaag te creëren.
      OPMERKING: Bereid het 100% stock isotone dichtheidsgradiëntmedium van tevoren, aliquot, en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden. Om de 100% stock isotone dichtheidsgradiëntoplossing te bereiden, verdunt u het dichtheidsgradiëntmedium (Materiaaltabel) met de verdunningsbuffer van het dichtheidsgradiëntmedium. Bereid de verdunningsbuffer voor dichtheidsgradiënt media (80,0 g/L NaCl, 3,0 g/L KCl; 0,73 g/L Na2 HP0 4, 0,20 g/L KH2HP04; 20,0 g/L glucose) en filter steriliseren met behulp van een vacuümfiltersysteem. Maak de 100% stock isotone dichtheidsgradiëntoplossing door 1 deel van de dichtheidsgradiëntverdunningsbuffer en 9 delen dichtheidsgradiëntmedia te mengen. Meng goed.
    9. Keer elke buis om en meng deze goed voordat u de onderlaag met 70% isotone dichtheidsgradiëntoplossing toevoegt. Steek een serologische pipet van 1 ml met 1 ml 70% stock isotone dichtheidsgradiëntoplossing in de bodem van de buis. Leg langzaam 1 ml van de oplossing onder de vloer en zorg ervoor dat u geen bubbels maakt. Verwijder langzaam de serologische pipet uit de buis en zorg ervoor dat u de gradiënt niet verstoort.
      OPMERKING: Voor de 70% onderlaag moet de 100% stock isotone dichtheidsgradiëntoplossing worden verdund tot 70% met behulp van RPMI-media (d.w.z. 7 ml 100% stock isotone dichtheidsgradiëntoplossing en 3 ml RPMI-media goed gemengd). Bovendien is het creëren van een schone, ongestoorde 70% onderlaag essentieel voor het verwijderen van myelineresten en voor het verkrijgen van zuivere eencellige suspensies op de gradiëntinterface na centrifugeren.
    10. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C zonder rem. Zuig het supernatant op, inclusief de myeline-puinlaag totdat 2-3 ml in de buis achterblijft, waarbij u voorzichtig bent om de cellaag niet te verstoren. Oogst de cellaag tussen de 30/70% dichtheidsgradiënt met behulp van een pipet van 1 ml en breng over naar een nieuwe conische buis van 15 ml.
    11. Voeg met behulp van een serologische pipet van 10 ml RPMI 10% FCS-media toe om het uiteindelijke volume op 15 ml te brengen. Centrifugeer 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Tijdens deze stap kunnen cellagen van twee buizen indien nodig worden samengevoegd. Span niet meer dan twee buizen, anders zullen de cellen niet pelleteren vanwege een gradiëntmediaconcentratie met hoge dichtheid.
    12. Zuig het supernatant voorzichtig op om de celkorrel niet te verstoren. Resuspendeer de cellen in een geschikt volume/buffer om de cellen te tellen met behulp van een hemocytometer (bv. resuspendeerde een enkel ruggenmerg in 250 μL FACS-buffer voor stroomafwaartse oppervlaktekleuring) (figuur 3).
    13. Breng met behulp van een pipet van 1 ml de celsuspensies over naar de bovenkant van een filterbovenbuis (materiaaltabel) en laat de cellen naar de onderkant van de buis filteren om eventuele resterende myelineresten te verwijderen.
    14. Met behulp van trypan blauwe uitsluitingskleurstof, verdun en tel de cellen op een hemocytometer door gemiddeld ten minste twee 16 vierkante rasters voor nauwkeurigheid40,41.
    15. Ga verder met de gewenste eencellige analysetechniek.
      OPMERKING: Met behulp van verschillende vormen van collagenase (d.w.z. D, type I, type II, type IV), kunnen immuuncellen, microglia (figuur 3), astrocyten, pericyten, endotheelcellen49 en neuronen50 allemaal efficiënt worden geïsoleerd. Nucleated cell counts verkregen voor de resultaten waren als volgt met behulp van het getitreerde collagenase I enzym: Hele sham-treated hersenen = 500.000-600.000 cellen; Hele TMEV-IDD hersenen = 800.000-1.000.000 cellen; Hele schijnbehandelde ruggenmerg = 150.000-200.000 cellen; Hele TMEV-IDD ruggenmerg = 300.000-400.000. Celtellingen variëren afhankelijk van de precisie van verzameling, verwerking en of CZS-ontsteking aanwezig is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit representatieve experiment was gericht op het kwantificeren van B- en T-cellen en het beschrijven van B- en T-cellokalisatie in de meningeale en parenchymale CZS-compartimenten in homeostatische omstandigheden en in een muizenprogressief MS-model (d.w.z. TMEV-IDD). TMEV-IDD werd geïnduceerd in 5 weken oude vrouwelijke SJL-muizen door intracraniële infectie met 5 x 106 plaquevormende eenheden (PFU) van TMEV BeAn zoals eerder beschreven29.

De huidige studie beoordeelde B- en T-cellen in de hersenvliezen, hersenen en ruggenmerg tijdens chronische TMEV-IDD op dag 120 na infectie. Leeftijdsgematchte sham-behandelde muizen werden gebruikt als controles. De studie bestond uit twee experimenten. De eerste richtte zich op het verkrijgen van eencellige suspensies voor flowcytometrische beoordeling, een gevestigde techniek om de celsamenstelling te analyseren en te kwantificeren door celoppervlak en / of intracellulaire antigenen te evalueren (n = 4 sham-behandeld; n = 5 TMEV-IDD). Het tweede experiment richtte zich op het beschrijven van B- en T-cellokalisatie in het CZS-compartiment door gebruik te maken van immunohistochemie op ontkalkte hersen- en ruggenmergweefsels (n = 3 sham-behandeld; n = 8 TMEV-IDD).

Na de isolatie van eencellige suspensies uit de hersenen, het ruggenmerg en gepoolde hersenvliezen (hersenen en ruggenmerg) van TMEV-IDD en met schijn behandelde muizen, werd een oppervlaktekleuringsprotocol toegepast op alle monsters. In het kort werden eencellige suspensies geïncubeerd met een fixeerbare levensvatbaarheidsuitsluitingskleuring (780) gedurende 15 minuten, gewassen, geblokkeerd met Fc-blok in aanwezigheid van muizenserum gedurende 15 minuten, en gekleurd met geconjugeerde antilichamen voor celoppervlakmarkers, waaronder CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3; PE-CF594) en CD4 (GK1.5; PE) gedurende 30 min zoals eerder beschreven28,29. Cellen werden vervolgens gewassen en geanalyseerd met behulp van een flowcytometer28,29. Levensvatbaarheidsgating werd uitgevoerd zoals eerder beschreven28. CD45-expressie werd beoordeeld om CD45hi perifeer afgeleide infiltrerende immuuncellen (P1) te onderscheiden van CD45lo microglia (P2) en CD45-neuronen, astrocyten en oligodendrocyten in de hersenen en het ruggenmerg (P3; Figuur 3A). Bij met sham behandelde muizen waren er weinig CD45hi-cellen aanwezig in het ruggenmerg en hersenweefsel. In de hersenvliezen werd dezelfde gating cut-off voor CD45hi-expressie gebruikt voor de hersen- en ruggenmerggegevens toegepast om CD45hi-immuuncellen te identificeren (P1; Figuur 3C) en niet-immuuncellen uitsluiten die aanwezig zijn in de hersenvliezen (d.w.z. fibroblasten, endotheelcellen). Bij met sham behandelde muizen waren weinig CD45hi-cellen (<0,1%) aanwezig in de hersenvliezen. Onder CD45hi-immuuncellen in TMEV-IDD CNS-weefsels werden B-cellen en CD4 T-cellen geïdentificeerd door oppervlakte-expressie van respectievelijk CD19 en CD4 (figuur 3B-D). In alle TMEV-IDD CZS-weefsels werden verhoogde percentages CD45hi-immuuncellen waargenomen in vergelijking met met sham behandelde muizen (figuur 4A). Tijdens chronische TMEV-IDD was het percentage B-cellen onder CD45hi-immuuncellen in de hersenen en het ruggenmerg hoger in vergelijking met het meningeale compartiment (figuur 4B).

Om de lokalisatie van B-cellen en T-cellen in het CZS-compartiment tijdens chronische TMEV-IDD te identificeren, werden ontkalkte hersenen en ruggenmerg geëvalueerd met behulp van immunohistochemie met behulp van het eerder beschreven kleuringsprotocol29. De hersenvliezen en vasculatuur werden afgebakend met laminine, een keldermembraancomponent29,51 en ER-TR7, een fibroblast reticulaire celmarker52,53. Tijdens conventionele extractie van de hersenen uit de schedelkap was de pialaag intact, maar de resterende meningeale lagen werden uitgesloten (figuur 5A). In het ruggenmerg resulteerde hydraulische extrusie in de afwezigheid van alle meningeale lagen (gegevens niet getoond). In zowel ontkalkte hersenen als ruggenmerg waren alle meningeale lagen intact (figuur 5B). Om B- en T-cellokalisatie in chronische TMEV-IDD te onderzoeken, werd IgG-expressie gebruikt om de lokalisatie van isotype-geschakelde B-cellen29 te bepalen, en CD3 werd gebruikt om alle T-cellen29 te visualiseren. Costaining IgG met ER-TR7 onthulde dat isotype-geschakelde IgG + B-cellen aanwezig waren in het CZS-parenchym en de hersenvliezen (figuur 6A). Cellulaire aggregaten in ER-TR7+ hersenvliezen bevatten meerdere IgG+ B-cellen en CD3+ T-cellen (figuur 6B).

De representatieve resultaten tonen hoge percentages van zowel B-cellen als T-cellen in de parenchymale en meningeale compartimenten in chronische TMEV-IDD-muizen in tegenstelling tot leeftijdsgematchte sham-behandelde muizen. IHC-analyse toonde verder aan dat in TMEV-IDD-weefsel B-cellen en T-cellen werden gedispergeerd in het parenchym, maar nauw verbonden waren in de hersenvliezen, waardoor ontstekingsaggregaten werden gevormd. Bij progressieve MS-patiënten zijn meningeale inflammatoire aggregaten geassocieerd met aangrenzend weefselletsel en slechtere ziekte-uitkomsten. Bij chronische TMEV-IDD kunnen persistente B-cel- en T-celaanwezigheid in het CZS-compartiment en aggregatie in de hersenvliezen geassocieerd zijn met weefselbeschadiging en ziekteprogressie. Verdere studies zijn nodig om te begrijpen hoe meningeale versus parenchymale ontsteking demyelinisatie, neurodegeneratie en klinische invaliditeit beïnvloeden.

Figure 1
Figuur 1: Hersenen en ruggenmerg isoleren voor ontkalking. Blauwe stippellijnen geven sneden aan die zijn gemaakt om de hersenen te isoleren met intacte schedel (sneden 1-4) en wervelkolom (sneden 5-8). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Het isoleren van hersenen, ruggenmerg en hersenvliezen voor eencellige technieken. (A) Blauwe stippellijnen geven sneden aan die zijn gemaakt om de schedelkap te isoleren met intacte hersenvliezen en hersenen (sneden 1-3) en wervelkolom (sneden 5-7). Laterale snede 3 wordt aan beide zijden van de schedel gemaakt. (B) Blauwe lijn geeft de incisie aan die is gemaakt om de hersenvliezen in het schedelkapje te scoren en te verwijderen en de sneden in de wervelkolom (beide laterale zijden) om het ruggenmerg en de hersenvliezen te isoleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Identificatie van CD45hi infiltrerende immuuncellen in CZS weefsels. (A) Gating strategie voor de identificatie van CD45hi infiltrerende immuuncellen (P1), CD45lo microglia (P2), en CD45- oligodendrocyten, astrocyten en neuronen onder totale levende cellen in ruggenmerg van sham-behandelde (rode) of TMEV-IDD (blauwe) muizen. Minimale CD45hi-cellen werden gedetecteerd in sham-behandelde hersenen en ruggenmerg. (B) Gating strategie voor het identificeren van CD19+ B cellen en CD4+ T cellen onder CD45hi infiltrerende immuuncellen (P1) in TMEV-IDD muizen. Gating strategieën waren vergelijkbaar voor hersenen en ruggenmergweefsel. (C) Gating strategie voor het identificeren van CD45hi-cellen (P1) in de hersenvliezen van sham-behandelde (rood) en chronische TMEV-IDD-muizen (blauw). (D) Gating strategie voor het identificeren van CD19+ B cellen en CD4+ T cellen onder CD45hi infiltrerende immuuncellen (P1) in de hersenvliezen van chronische TMEV-IDD muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: CD45hi immuuncellen en CD19+ B cellen verhoogd in CZS weefsels in chronische TMEV-IDD. Staafdiagrammen samenvattingen van flowcytometriegegevens verkregen uit sham-behandelde of TMEV-IDD hersenvliezen, hersenen en ruggenmerg tonen percentages van CD45hi infiltrerende immuuncellen (A) of percentages van CD19 + B-cellen (B). Voor TMEV-IDD-weefsels werden flowcytometriegegevens verkregen van vijf muizen, waarbij ruggenmerg en hersenen afzonderlijk werden verwerkt, terwijl hersenvliezen werden samengevoegd voor analyse. Voor met sham behandelde muizen werden flowcytometriegegevens verkregen van vier muizen, waarbij ruggenmerg en hersenen individueel werden verwerkt, terwijl hersenvliezen werden samengevoegd voor analyse. Gegevens voor ruggenmerg en hersenen worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Intacte meningeale lagen in ontkalkte hersenen en ruggenmerg. (A) Hersenen geëxtraheerd uit de schedelkap of (B) ontkalkte hersenen met intacte schedels en wervelkolommen van chronische TMEV-IDD-muizen werden beoordeeld op DAPI (blauw), meningeale markers laminine (groen) en ER-TR7 (rood). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Immuuncelaggregatie was duidelijk in de hersenvliezen tijdens chronische TMEV-IDD. (A) Ontkalkte wervelkolommen van chronische TMEV-IDD-muizen werden onderzocht op de aanwezigheid van IgG (groen) om isotype-geschakelde immuuncellen in het parenchym en in de ER-TR7+ hersenvliezen (rood) te identificeren. (B) CD3+ T-cellen (groen) en IgG+ isotype-geschakelde B-cellen (rood) werden gecostained met ER-TR7+ hersenvliezen om de lokalisatie in het ruggenmergweefsel te beoordelen. Witte pijlen markeren B- en T-cellen in de hersenvliezen. Schaalbalk = 50 μm. Witte vakken bakenen gebieden af die zijn geselecteerd voor bijgesneden afbeeldingen (rechts; schaalbalk = 10 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Methoden voor het evalueren van de cellulaire samenstelling in het CZS-compartiment tijdens homeostase en ziekte zijn essentieel voor het begrijpen van de fysiologische en pathologische toestanden van het CZS. Ondanks het feit dat ze dienen als een belangrijke barrière in het CZS en een breed scala aan immuuncellen huisvesten, worden de hersenvliezen vaak weggelaten uit de analyse omdat veel conventionele weefselextractiemethoden voor de hersenen en het ruggenmerg het verzamelen van deze membranen niet mogelijk maken. Deze omissie is een kritische beperking in de vooruitgang van ons begrip van de cellulaire samenstelling en functie van de hersenvliezen en zijn rol in steady state en ontstekingsaandoeningen. Recente studies toonden aan dat zowel residente als perifeer afgeleide immuuncellen die zich in het meningeale compartiment bevinden, een essentiële rol spelen bij het handhaven van homeostase in het CZS, evenals bij het stimuleren van de pathogenese van de ziekte van het CZS. Deze studies benadrukken de noodzaak om niet alleen het parenchymale compartiment te analyseren, maar ook de omliggende meningeale lagen. De hier beschreven protocollen maken de snelle isolatie van hersenen en ruggenmerg mogelijk met behoud van de hersenvliezen, waardoor uiteindelijk een uitgebreide downstream-analyse van het CZS-compartiment mogelijk wordt met behulp van zowel histologische als eencellige studies. De representatieve resultaten richten zich op het beoordelen van immuuncellen in het CZS-compartiment; de protocollen kunnen echter worden aangepast om microglia, astrocyten, neuronen, pericyten, endotheelcellen of andere czs-residente cellen te analyseren.

Een cruciale stap in de beschreven methoden is de zorgvuldige extractie van het weefsel, essentieel voor zowel het isoleren van zuivere eencellige suspensies uit hersenen, ruggenmerg en hersenvliezen als voor het verkrijgen van CNS-weefsels met intacte schedels of wervelkolommen, waardoor hoogwaardige weefselmorfologie mogelijk is. Het beoefenen van de techniek voor het verkrijgen van eencellige suspensies is de sleutel tot een succesvolle weefselextractie omdat het niet alleen de zuiverheid van het monster zal verbeteren, maar ook de celopbrengsten voor downstream-toepassingen zal verbeteren. Evenzo is de praktijk in de isolatie van CZS-weefsels met intacte schedels of wervelkolommen om overtollig weefsel rond het bot adequaat te verwijderen een essentiële stap die zorgt voor een betere fixatie, ontkalking en cryopreservatie van het weefsel, allemaal cruciale componenten voor het verkrijgen van weefselsecties met hoogwaardige morfologie en intacte antigeendoelen.

Een beperking van ons protocol voor het isoleren van eencellige suspensies uit de hersenvliezen is dat het zich richt op het verkrijgen van durale en arachnoïde hersenvliezen32,54, terwijl de isolatie van de pia wordt weggelaten, die via astrocytenprocessen aan de hersenen of het ruggenmerg blijft gehecht. Hoewel de cellen die zich in de pia mater bevinden een essentieel onderdeel zijn van het meningeale compartiment, werd besloten om de pia mater uit te sluiten tijdens het eencellige suspensiepreparaat vanwege de lange tijd die nodig is om het adequaat te isoleren55. Evenzo richt het protocol zich alleen op het verkrijgen van hersenvliezen in het superieure deel van de schedel en sluit het de isolatie van de invaginatiserende hersenvliezen in de hersenen en de plexus choroideus uit. Het verzamelen van de invaginatiserende hersenvliezen en de plexus choroideus kan worden uitgevoerd volgens eerder gepubliceerde protocollen55, hoewel het een tijdrovende procedure is. In beide gevallen was de keuze om een deel van de meningeale lagen weg te laten te wijten aan de hoeveelheid tijd die nodig is om ze te isoleren. De timing van het protocol dat wordt gebruikt om eencellige suspensies te bereiden die nodig zijn voor downstream-toepassingen zoals flowcytometrie, celkweektests en RNA-sequencing (RNAseq) is van cruciaal belang om de levensvatbaarheid van cellen en de gegevenskwaliteit te verbeteren. Daarom moet, afhankelijk van de specifieke onderzoeksvraag, een evenwicht worden gevonden tussen de isolatietijd van het monster en de grondigheid bij het extraheren van de hersenvliezen. In het huidige protocol worden alleen eencellige suspensiepreparaten uit de dura- en arachnoïdale hersenvliezen verkregen, wat het vermogen om resultaten te extrapoleren naar het geheel van de CZS-hersenvliezen beperkt. Als deze methoden echter worden gebruikt in combinatie met IHC- of ISH-analyse van hele weefselsecties met de drie lagen hersenvliezen, kan een grondiger begrip van de cellulaire en moleculaire dynamiek in de parenchymale en meningeale compartimenten worden verkregen.

Een andere beperking van het protocol is het lage celaantal verkregen uit de durale en arachnoïdale hersenvliezen, vooral tijdens homeostatische omstandigheden. Als het aantal cellen in het ruggenmerg, de hersenen of de hersenvliezen echter te laag wordt geacht voor analyse van een bepaalde doelcelpopulatie, kan het minimale celaantal dat voor die analyse nodig is, worden bepaald door het totale aantal gebeurtenissen te schatten dat nodig is voor een bepaalde precisie (bijvoorbeeld 5% variatiecoëfficiënt) zoals beschreven in eerdere literatuur die gespecialiseerd is in analyse van zeldzame gebeurtenissen56. Deze berekeningen kunnen vervolgens worden gebruikt om te bepalen of monsters van meerdere dieren moeten worden samengevoegd om voldoende celaantallen te verkrijgen om de celpopulatie van belang te analyseren.

De beschreven methoden bieden een essentiële vooruitgang in het onderzoek naar de cellulaire dynamiek in het CZS-compartiment door analyses uit te breiden met het vaak verwaarloosde meningeale compartiment. Deze protocollen maken de individuele extractie van de hersenen, het ruggenmerg en de durale en arachnoïde hersenvliezen mogelijk om eencellige suspensies te genereren. Bovendien maakt het ontkalkingsprotocol histologische analyses mogelijk van weefselsecties bestaande uit hersen- of ruggenmergweefsel inclusief de drie meningeale lagen. Het gebruik van EDTA biedt een langzaam maar zacht ontkalkingsproces, dat het meest geschikt is voor monsters waar hoogwaardige weefselmorfologie vereist is (bijv. IHC en ISH). Het protocol gebruikt een pH van 7,2-7,4 om de snelheid van ontkalking te vertragen en het behoud van intacte weefselmorfologie te garanderen, een duidelijk voordeel ten opzichte van sterke en zwakke zuren (bijv. Zoutzuur en trichloorazijnzuur), die een kortere ontkalkingstijd hebben, maar de kwaliteit van de weefselmorfologie beïnvloeden.

Toekomstige methoden om eencellige suspensies uit de hersenvliezen te isoleren, moeten zich richten op het ontwikkelen van protocollen om de tijd te verkorten die nodig is om de piale laag grondig te isoleren van CZS-weefsels en de invaginatiserende hersenvliezen in de hersenen. Het verkrijgen van het volledige complex van de drie meningeale lagen zal niet alleen het aantal cellen voor elke analyse verhogen, maar zal ook een uitgebreidere beoordeling bieden van de bewoner en infiltrerende immuuncellen die de hersenvliezen bezetten, die het CZS omsluiten. Tegelijkertijd moeten toekomstige protocollen gericht op het voorbereiden van ontkalkte hersenen en ruggenmerg proberen nieuwe middelen te identificeren die gericht zijn op het versnellen van weefselontkalking met behoud van de kwaliteit van weefselmorfologie. Al met al kunnen downstream-toepassingen die CNS-eencellige suspensies analyseren, inclusief dubbele en arachnoïde hersenvliezen, uitgevoerd in combinatie met uitgebreide weefselsectieanalyse, een gedetailleerd inzicht bieden in het celfenotype, de functie en de lokalisatie binnen het CZS-compartiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken het personeel van het Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) in Dartmouth voor hun deskundige zorg voor de muizen die voor deze studies worden gebruikt. Het Bornstein Research Fund financierde dit onderzoek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, Pt 10 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, Pt 9 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019).
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

Immunologie en infectie hersenvliezen centraal zenuwstelsel ontkalking immunohistochemie eencellige suspensie immuuncellen muizen
Isoleren van weefsels van het centrale zenuwstelsel en bijbehorende hersenvliezen voor de downstream-analyse van immuuncellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, … More

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter