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Immunology and Infection

Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

Este artículo presenta dos protocolos optimizados para examinar las células inmunitarias residentes y derivadas periféricas dentro del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal y las meninges. Cada uno de estos protocolos ayuda a determinar la función y composición de las células que ocupan estos compartimentos en estado estacionario y en condiciones inflamatorias.

Abstract

El sistema nervioso central (SNC) está compuesto por el cerebro y la médula espinal y está envuelto por las meninges, capas membranosas que sirven como barrera entre la periferia y el SNC. El SNC es un sitio inmunológicamente especializado y, en condiciones de estado estacionario, el privilegio inmunitario es más evidente en el parénquima del SNC. Por el contrario, las meninges albergan una amplia gama de células residentes, incluidas las células inmunitarias innatas y adaptativas. Durante las afecciones inflamatorias desencadenadas por una lesión del SNC, la autoinmunidad, la infección o incluso la neurodegeneración, las células inmunitarias de origen periférico pueden entrar en el parénquima y residir dentro de las meninges. Se cree que estas células realizan acciones beneficiosas y perjudiciales durante la patogénesis de la enfermedad del SNC. A pesar de este conocimiento, las meninges a menudo se pasan por alto cuando se analiza el compartimento del SNC, porque los métodos convencionales de extracción de tejido del SNC omiten las capas meníngeas. Este protocolo presenta dos métodos distintos para el aislamiento rápido de tejidos murinos del SNC (es decir, cerebro, médula espinal y meninges) que son adecuados para el análisis posterior mediante técnicas unicelulares, inmunohistoquímica y métodos de hibridación in situ. Los métodos descritos proporcionan un análisis exhaustivo de los tejidos del SNC, ideal para evaluar el fenotipo, la función y la localización de las células que ocupan el compartimento del SNC en condiciones homeostáticas y durante la patogénesis de la enfermedad.

Introduction

El sistema nervioso central (SNC) es un sitio inmunológicamente especializado. El parénquima del SNC, excluyendo el espacio LCR, las meninges y la vasculatura, es considerado clásicamente como un sitio inmunoprivilegiado 1,2,3,4,5 y está relativamente desprovisto de células inmunitarias durante las condiciones homeostáticas 2,6,7. Por el contrario, las meninges, compuestas por las capas duramadre, aracnoidea y pia, son componentes cruciales del compartimento del SNC, participando activamente en la vigilancia inmunitaria homeostática y en los procesos inflamatorios durante la patogénesis de la enfermedad 3,6,7,8. Durante las condiciones de estado estacionario, las meninges albergan numerosas células centinela inmunitarias, incluidas las células linfoides innatas (ILC), los macrófagos, las células dendríticas (DC), los mastocitos, las células T y, en menor medida, las células B 9,10,11.

Las meninges son estructuras altamente vascularizadas y contienen vasos linfáticos que proporcionan una conexión linfática entre el SNC y su periferia 8,12,13,14. En las afecciones inflamatorias inducidas por lesiones del SNC, infecciones, autoinmunidad o incluso neurodegeneración, las células inmunitarias de origen periférico se infiltran en el parénquima y alteran el paisaje inmunitario dentro de las meninges. Después de la infiltración celular, las meninges pueden representar un nicho funcional para las células inmunitarias derivadas periféricamente, promoviendo la agregación de células inmunitarias, la activación local de las células inmunitarias y la supervivencia a largo plazo en el compartimento del SNC. La inflamación meníngea prominente se observa en múltiples enfermedades que afectan al SNC, incluyendo la esclerosis múltiple (EM)15,16,17,18,19, el accidente cerebrovascular 20,21, la lesión estéril 22,23 (es decir, la lesión de la médula espinal y la lesión cerebral traumática), las migrañas 24 y la infección microbiana 25,26,27,28,29. Por lo tanto, la caracterización de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente en el compartimento meníngeo es esencial para comprender el papel de estas células durante las condiciones de estado estacionario y la patogénesis de la enfermedad.

La extracción del cerebro, la médula espinal y las meninges del cráneo y los cuerpos vertebrales es técnicamente difícil y requiere mucho tiempo. Actualmente no existen técnicas disponibles para la extracción rápida del cerebro con las tres capas meníngeas intactas. Si bien la laminectomía produce una excelente morfología del tejido de la médula espinal y preserva las capas meníngeas, requiere mucho tiempo y es extremadamente complicada30,31. Por el contrario, los métodos de extracción más convencionales, como la extirpación del cerebro del cráneo y la extrusión hidráulica de la médula espinal, facilitan la extracción rápida del tejido del SNC, pero con estas técnicas se pierden tanto las meninges aracnoideas como las durales30,31. La omisión de las capas duramadre y aracnoidea durante el aislamiento convencional de los tejidos del cerebro y la médula espinal da lugar a un análisis incompleto de las células dentro del compartimento del SNC. Por lo tanto, la identificación de nuevas técnicas enfocadas a la extracción rápida de tejidos del SNC con meninges intactas es crucial para el análisis óptimo del compartimento del SNC.

Este manuscrito presenta dos métodos para la extracción rápida del cerebro, la médula espinal y las meninges de ratones, lo que facilita el análisis posterior de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente en el parénquima y las meninges del SNC. Estos protocolos optimizados se centran en 1) aislar suspensiones unicelulares para el análisis posterior y 2) preparar el tejido para el procesamiento histológico. La obtención de suspensiones unicelulares del cerebro, del tejido de la médula espinal y de las meninges durales y aracnoideas32 permite el análisis simultáneo de las células que residen en los compartimentos parenquimatoso y meníngeo. Las suspensiones unicelulares se pueden utilizar en diferentes aplicaciones, incluidos los ensayos de cultivo celular para realizar estimulación in vitro 33, inmunopunto ligado a enzimas (ELISpot)28,34,35, citometría de flujo36,33 y transcriptómica de una sola célula 37 o a granel. Además, el protocolo optimizado para la descalcificación de cerebros enteros y médula espinal con cráneos o columnas vertebrales intactos, respectivamente, permite la descalcificación suave del hueso circundante, dejando las meninges intactas y preservando la morfología del tejido. Este método permite la identificación selectiva de proteínas o ARN mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) o hibridación in situ (ISH) tanto en el espacio parenquimatoso como en el meníngeo. La caracterización del fenotipo, el estado de activación y la localización de las células residentes y las células inmunitarias derivadas periféricamente dentro del SNC puede proporcionar información esencial para comprender cómo los tipos de células individuales en el compartimento del SNC contribuyen a la homeostasis y la patogénesis de la enfermedad.

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Protocol

Todo el trabajo con animales utiliza protocolos revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Geisel en Dartmouth.

1. Procesamiento de muestras de cerebro y médula espinal para la descalcificación

  1. Aislamiento de muestras de cerebro y médula espinal
    1. Sacrificar al ratón mediante inhalación de CO2 . Asegúrese de que el caudal deCO2 desplace entre el 10 % y el 30 % del volumen de la jaula por minuto.
    2. Con fórceps, levante la apófisis xifoides y corte la pared abdominal lateralmente justo debajo de la caja torácica con unas tijeras, tirando hacia arriba para evitar cortar los vasos sanguíneos u órganos subyacentes. Corta el diafragma lateralmente.
    3. Corta la caja torácica a lo largo de los bordes laterales paralelos a los pulmones hasta la clavícula. Con fórceps, levante el esternón y pinde el esternón con un hemostático. Coloque el hemostático sobre la cabeza para levantar la caja torácica y exponer el corazón.
    4. Con fórceps, agarre el corazón cerca de su vértice y haga una incisión en la aurícula derecha del corazón para proporcionar una salida. Inserte una aguja de 25 g con una jeringa de 10 ml conectada para administrar lentamente 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x helada en el ventrículo izquierdo para perfundir transcardialmente al ratón.
      NOTA: La perfusión debe ocurrir durante 4-5 minutos hasta que el hígado esté libre de sangre. Un total de 10 ml de 1x PBS suele ser suficiente para la perfusión, pero se puede utilizar más si es necesario. Un hígado limpio suele indicar una perfusión adecuada.
    5. Con unas tijeras afiladas, retire la cabeza por decapitación (Figura 1; 1). Haga una incisión en la línea media de la piel (Figura 1; 2) y voltee la piel sobre los ojos para liberar el cráneo.
    6. Cortar en el hueso nasal para liberar la mandíbula del cráneo (Figura 1; 3). Extirpa la mandíbula, la lengua y los ojos. Cortar a lo largo de los aspectos laterales del cráneo para liberar el tejido a lo largo del meato auditivo externo (Figura 1; 4). Recorte para eliminar todo el exceso de piel, músculo y tejido que recubre el cráneo.
    7. Separe la caja torácica de la columna vertebral cortando paralelamente a la columna vertebral con unas tijeras afiladas (Figura 1; 5 y 6). Realizar una pequeña incisión en la región lumbar inferior para aislar la columna vertebral (Figura 1; 7). Recorte y retire cualquier músculo restante a lo largo de la columna vertebral para exponer las vértebras (Figura 1; 8).
      NOTA: Es necesario eliminar el exceso de tejido de la columna vertebral y el cráneo para obtener una penetración adecuada del tampón de descalcificación fijador de paraformaldehído (PFA) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
  2. Postfijación, descalcificación y criopreservación
    1. Con fórceps, coloque el cerebro con el cráneo o la columna vertebral intactos en un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de PFA al 4 %. Colocar los tubos a 4 °C durante al menos 48 h para una fijación adecuada.
      NOTA: Para evitar la sobrefijación del tejido, no superar las 72 h de fijación. Los tiempos de fijación se amplían para las muestras óseas antes de la descalcificación. Una fijación adecuada protegerá el tejido de los efectos de la descalcificación y asegurará una mejor morfología del tejido.
    2. Enjuague el cerebro o la médula espinal retirando el tejido del PFA al 4 % con fórceps y colocando el tejido en un tubo desechable de 14 ml con 10 ml de 1x PBS durante 5 minutos. Transfiera el cerebro o la médula espinal a un tubo cónico de 50 ml con 10 ml de EDTA al 10 % (pH = 7,2–7,4).
      NOTA: El uso de un tubo más grande con 10 ml de EDTA le da al EDTA una mayor área de contacto con el tejido y acelera el proceso de descalcificación.
    3. Compruebe diariamente si el hueso está blando y flexible: retire el tejido de la solución de EDTA con pinzas, colóquelo en una placa de Petri y pruebe suavemente la suavidad del hueso con una aguja de 25 G. Si la aguja penetra fácilmente en el hueso, el proceso de descalcificación está completo.
    4. Retire el tejido de la solución de EDTA y transfiera el cerebro o la médula espinal a un tubo desechable de 14 ml que contenga 10 ml de 1x PBS y lávese durante 10 minutos. Repita el lavado.
      NOTA: La descalcificación suele tardar de 2 a 3 días. La solución debe cambiarse cada 2-3 días si el hueso aún no está adecuadamente descalcificado. Sin embargo, la incubación prolongada en EDTA después de que el hueso se haya descalcificado puede dañar la morfología del tejido.
    5. Prepare soluciones de sacarosa al 10%, 20% y 30% agregando sacarosa a 1x PBS. Por ejemplo, para sacarosa al 10%, agregue 10 g de sacarosa y lleve el volumen a 100 ml usando PBS estéril 1x. Almacene la solución a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
      NOTA: Las soluciones de sacarosa son propensas al crecimiento de microorganismos, por lo que las muestras no deben almacenarse durante períodos prolongados de tiempo en estas soluciones.
    6. Retirar el tejido del 1x PBS, colocarlo en 10 mL de solución de sacarosa al 10% y guardarlo a 4 °C. Deje reposar el pañuelo durante 24 horas o hasta que se hunda hasta el fondo del tubo.
    7. Repita este proceso, moviendo el tejido a una solución de sacarosa al 20% primero y finalmente a una solución de sacarosa al 30%. Deje que el tejido se hunda en sacarosa al 30% (al menos 24 h) y proceda a la inclusión del tejido.
  3. Inclusión y congelación de tejidos
    1. Con unas pinzas, retire el tejido de la sacarosa al 30%, colóquelo en una placa de Petri e incline la placa para eliminar el exceso de solución de sacarosa en el tejido. Con un bisturí, corte el tejido en los segmentos deseados.
    2. Cree una capa delgada de compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en la parte inferior del criomold y coloque la(s) pieza(s) de tejido en el molde. Cubra el tejido completamente con el compuesto OCT, asegurándose de que no haya burbujas.
    3. Congele rápidamente los bloques colocando el cursor sobre nitrógeno líquido38 o colocando los bloques en una suspensión de hielo seco / isopropanol al 100%39 hasta que el bloque esté opaco. Envuelva los criomoldes en papel de aluminio y almacene los bloques a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo. Mueva los bloques a -20 °C antes de seccionarlos.
      NOTA: Se debe tener cuidado al seccionar y realizar protocolos histológicos en cerebros descalcificados, ya que las capas del cráneo y la meníngea pueden perderse si las secciones se manipulan bruscamente.

2. Preparación de las meninges y tejidos del SNC para la tinción por citometría de flujo

  1. Extracción del casquete craneal y del cerebro
    1. Con unas tijeras afiladas, retire la cabeza por decapitación (Figura 2A; 1). Con unas tijeras, haga una incisión en la línea media de la piel (Figura 2A; 2) y voltee la piel sobre los ojos para liberar el cráneo.
    2. Coloque las tijeras dentro del foramen magna y comience a cortar el cráneo lateralmente a lo largo de las cortezas hacia el bulbo olfatorio, manteniendo las incisiones por encima del meato auditivo externo y la mandíbula (Figura 2A; 3). Realice los mismos cortes en el lado opuesto, con cortes que se encuentran en el bulbo olfatorio para liberar la tapa del cráneo del cerebro (Figura 2A; 3).
    3. Con unas pinzas, retire el casquete craneal y colóquelo en un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de medio RPMI frío suplementado con 25 mM de HEPES. Mantenga el tubo en hielo.
    4. Con pinzas curvas, coloque las pinzas debajo de la base del cerebro y levántelas para liberar el cerebro de la tapa del cráneo. Coloque el cerebro en un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de RPMI frío suplementado con 25 mM de HEPES. Mantenga el tubo en hielo hasta que se procese.
  2. Extracción de la columna vertebral y el tejido de la médula espinal
    1. Con fórceps y tijeras afiladas, separe la caja torácica de la columna vertebral cortando paralelamente a la columna vertebral (Figura 2A; 4 y 5). Realizar una pequeña incisión en la región lumbar inferior para aislar la columna vertebral (Figura 2A; 6). Recorte y retire cualquier músculo restante a lo largo de la columna vertebral para exponer las vértebras (Figura 2A; 7).
    2. Coloque las tijeras quirúrgicas extrafinas dentro de la columna vertebral y corte a lo largo del borde lateral de la columna (Figura 2C). Corta completamente el borde lateral opuesto para dividir la columna vertebral en una porción anterior y otra posterior.
      NOTA: La médula espinal permanecerá unida a la columna vertebral.
    3. Con fórceps, retire lenta y cuidadosamente la médula espinal de la columna vertebral y coloque el tejido en un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de RPMI frío con 25 mM de HEPES. Transfiera las porciones anterior y posterior de la columna vertebral a un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de RPMI frío con 25 mM de HEPES.
  3. Extracción de las meninges para preparar suspensiones unicelulares
    1. Con unas pinzas, retire el casquete craneal del medio RPMI. Uso de pinzas afiladas (pinzas #7; Tabla de materiales), marque alrededor del borde exterior de la tapa del cráneo (Figura 2B) y retire las meninges del borde de la tapa del cráneo, raspando para eliminar las meninges durales y aracnoideas. Coloca las meninges en una placa de Petri.
      NOTA: La extirpación de las meninges tanto del cerebro como de la médula espinal requiere práctica. Si el usuario experimenta dificultades para extraer las meninges, use un microscopio de disección para ayudar en la extracción.
    2. Retire la columna vertebral del tubo. Con pinzas afiladas, marque alrededor de los bordes de la columna vertebral para liberar las meninges y despegue las meninges del borde de la vértebra con pinzas curvas. Coloca las meninges en una placa de Petri.
    3. Coloque un colador de malla de nailon en un tubo cónico de 50 ml. Mueva las meninges al colador y agregue 3 mL de RPMI suplementado con 25 mM de HEPES. Usando el émbolo de una jeringa de 5 ml, muela el tejido y el medio a través del colador.
    4. Con una pipeta serológica de 5 ml, lave el colador con 2 a 3 ml adicionales de medio RPMI/HEPES hasta que todo el tejido visible haya pasado a través del colador.
      NOTA: Para obtener un número adecuado de células para el análisis citométrico de flujo, es posible que sea necesario agrupar las meninges de varios animales. En este experimento (Figura 3 y Figura 4), se agruparon las meninges del cerebro y la médula espinal de 4 a 5 ratones. Si las muestras se agrupan, se requerirán medios adicionales para moler el tejido a través del colador de malla de nailon para evitar el sobrecalentamiento del tejido.
    5. Con una pipeta serológica de 10 ml, transfiera las células y el medio a un tubo cónico nuevo de 15 ml. Con una pipeta serológica de 10 ml, lave el tubo cónico de 50 ml con 5 ml de medio para recoger las células restantes. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C para granular las células.
    6. Utilizando una pipeta Pasteur con vacío, aspire el sobrenadante teniendo cuidado de evitar el gránulo celular y vuelva a suspender las células en un volumen y tampón adecuados.
    7. Para contar la suspensión unicelular, diluya un pequeño volumen de las células (es decir, 5-10 μL) con colorante de exclusión azul de tripano (dilución 1:10) y RPMI. Añadir 10 μL de la dilución al hemocitómetro.
    8. Cuente las celdas como se describió anteriormente40,41, promediando al menos dos cuadrículas de 16 cuadrados para mayor precisión.
      NOTA: En la Figura 3, por ejemplo, las células peletizadas agrupadas de las meninges se resuspendieron en 250 μL de tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (1x PBS con 1% de FBS) para la tinción superficial posterior. Las células se diluyeron 1:10 para el recuento (5 μL de células, 5 μL de azul de tripano, 40 μL de RPMI). Esta dilución produjo entre 50 y 100 células por cada 16 cuadrículas cuadradas, lo que garantiza un recuento de células más preciso porque las células no son ni demasiado densas ni superpuestas ni demasiado escasas. Los recuentos de células nucleadas de las meninges combinadas del cerebro y la médula espinal por ratón fueron los siguientes: para las meninges de ratones con tratamiento simulado = 100.000-150.000 células y para las meninges de los ratones de la enfermedad desmielinizante inducida por el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV-IDD) = 300.000-350.000 células. Los recuentos celulares variarán según la precisión de la recolección, el procesamiento y si hay inflamación meníngea.
    9. Proceda a la técnica de célula única deseada, como una superficie FACS (Figura 3)14,36,42,43,44, protocolos de tinción intracelular 33,45, estimulación in vitro, ensayos de cultivo celular 33,46,47, ensayo ELISPOT 28,34,35 y células a granel o unicelulares Transcriptómica37,48.
      NOTA: Mantenga todos los tubos en hielo entre los pasos de procesamiento.
  4. Preparación de suspensiones unicelulares de tejido cerebral y de la médula espinal
    1. Transfiera el tejido del cerebro o de la médula espinal con medios a la parte superior de la placa de Petri de 100 mm vertiendo el tejido y los medios del tubo. Con unas pinzas, mueva el tejido hasta el fondo de la placa de Petri. Pica finamente el cerebro o la médula espinal con una cuchilla de afeitar estéril. Con la cuchilla de afeitar, mueva el pañuelo picado al fondo del plato raspando para recoger el pañuelo.
      NOTA: Para el protocolo de digestión enzimática que se indica a continuación, se pueden agrupar hasta dos médulas espinales para su procesamiento. Los cerebros deben ser procesados individualmente.
    2. Con una pipeta serológica de 5 ml, agregue 3 ml de RPMI suplementado con suero fetal de ternero (FCS) al 10% a la placa de Petri. Con una pipeta serológica de 10 ml, pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender el tejido en el medio y transferirlo a un tubo cónico de 15 ml.
      NOTA: Si la aplicación posterior es el análisis de secuenciación de ARN a granel o de una sola célula o el cultivo celular, los lotes de FCS deben probarse para garantizar que las células no se activen antes del análisis. Alternativamente, las celdas se pueden procesar usando 1x PBS con 0.04% BSA en lugar de RPMI con 10% FCS.
    3. Con una pipeta serológica de 10 ml, lave la placa de Petri con 2 ml adicionales de medio para recolectar cualquier tejido residual y transferirlo a un tubo cónico para obtener un volumen total de 5 ml. Mantenga los tubos en hielo entre los pasos de procesamiento.
    4. Con una pipeta, vuelva a suspender el polvo de colagenasa I en un medio de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para obtener la concentración deseada (es decir, 100 mg/ml). Añadir colagenasa tipo I al tubo cónico que contiene la muestra de tejido picado para obtener la concentración final deseada (es decir, 50 μL por 1 mg/mL).
      NOTA: Las concentraciones más altas de colagenasa aumentarán el rendimiento celular, pero pueden escindir los marcadores de la superficie celular. Por lo tanto, los lotes de colagenasa I deben valorarse para determinar la concentración óptima necesaria para obtener el mayor número de células viables con todos los marcadores de superficie celular necesarios intactos. Por ejemplo, la colagenasa I se analizó a concentraciones finales de 0,5 mg/ml, 1 mg/ml y 2 mg/ml en muestras individuales de cerebro o médula espinal. La viabilidad celular se determinó mediante el método de exclusión de azul de tripano y los marcadores de superficie celular CD45, CD19 y CD4 se evaluaron mediante citometría de flujo. Una concentración de 1 mg/ml de colagenasa I produjo el mayor recuento de células vivas al tiempo que conservó todos los marcadores de superficie celular de interés. Por lo tanto, esta concentración se utilizó para otros experimentos que examinaron estos tipos de células.
    5. Resuspender suavemente el polvo de DNasa I con cloruro de sodio 0,15 M hasta la concentración de material deseada. Añadir la DNasa I resuspendida al tubo cónico que contiene la muestra de tejido picado para obtener una concentración final de 20 U/mL.
      NOTA: Los lotes de DNasa I varían según las unidades de actividad por ml. La concentración que se añadirá a la muestra de tejido cambiará en función de las unidades de actividad por mililitro del vial madre. La concentración final deseada por muestra es de 20 U/mL.
    6. Coloque los tubos en una rejilla de tubos en un baño de agua a 37 °C e incube durante 40 min. Invierta los tubos cada 15 minutos para mezclar bien el tejido con las enzimas. Después de la incubación, añadir 500 μL de EDTA 0,1 M (pH = 7,2) a cada tubo para obtener una concentración final de 0,01 M de EDTA e incubar durante 5 min más para inactivar la colagenasa.
    7. Con una pipeta serológica de 10 ml, agregue 9 ml de RPMI suplementado con FCS al 10% a cada tubo para llevar el volumen de cada tubo a ~14,5 ml. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Utilizando una pipeta Pasteur con vacío, aspire el sobrenadante teniendo cuidado de no tocar el gránulo celular.
    8. Con una pipeta serológica de 5 ml, añadir 3 ml de solución de gradiente de densidad isotónica al 100 % al tubo que contiene el gránulo celular. Con una pipeta serológica de 10 ml, agregue medios adicionales de RPMI 10% FCS para llevar el volumen final a 10 ml y vuelva a suspender el gránulo celular para crear una capa de solución de gradiente de densidad isotónica al 30%.
      NOTA: Prepare el medio de gradiente de densidad isotónica 100% de stock con anticipación, alícuota, y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Para preparar la solución de gradiente de densidad isotónica 100% original, diluya el medio de gradiente de densidad (Tabla de materiales) con tampón de dilución de medios de gradiente de densidad. Prepare el tampón de dilución de medios de gradiente de densidad (80,0 g/L de NaCl, 3,0 g/L de KCl; 0,73 g/L de Na2 HP0 4, 0,20 g/L de KH2HP04; 20,0 g/L de glucosa) y filtre la esterilización con un sistema de filtro de vacío. Prepare la solución de gradiente de densidad isotónica 100% original mezclando 1 parte de tampón de dilución de gradiente de densidad y 9 partes de medios de gradiente de densidad. Mezclar bien.
    9. Invierta y mezcle bien cada tubo antes de agregar la base de la solución de gradiente de densidad isotónica al 70%. Inserte una pipeta serológica de 1 ml que contenga 1 ml de solución de gradiente de densidad isotónica al 70% en el fondo del tubo. Coloque lentamente 1 ml de la solución, teniendo cuidado de no hacer burbujas. Retire lentamente la pipeta serológica del tubo, teniendo cuidado de no alterar el gradiente.
      NOTA: Para la capa subyacente al 70 %, la solución de gradiente de densidad isotónica al 100 % debe diluirse al 70 % utilizando medios RPMI (es decir, 7 ml de solución de gradiente de densidad isotónica al 100 % y 3 ml de medios RPMI bien mezclados). Además, la creación de una capa de base limpia e inalterada del 70% es esencial para la eliminación de restos de mielina y para obtener suspensiones unicelulares puras en la interfaz de gradiente después de la centrifugación.
    10. Centrifugar a 800 x g durante 30 min a 4 °C sin freno. Aspire el sobrenadante, incluida la capa de restos de mielina, hasta que queden 2-3 ml en el tubo, teniendo cuidado de no alterar la capa celular. Extraiga la capa celular entre el gradiente de densidad del 30/70% utilizando una pipeta de 1 ml y transfiérala a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
    11. Con una pipeta serológica de 10 ml, agregue medios RPMI 10% FCS para llevar el volumen final a 15 ml. Centrifugar 450 x g durante 5 min a 4 °C.
      NOTA: Durante este paso, las capas de células de dos tubos se pueden agrupar si es necesario. No agrupe más de dos tubos o las células no se granularán debido a una concentración de medios de gradiente de alta densidad.
    12. Aspire el sobrenadante con cuidado para no alterar el gránulo de la célula. Vuelva a suspender las células en un volumen/tampón adecuado para contar las células utilizando un hemocitómetro (p. ej., resuspender una sola médula espinal en 250 μL de tampón FACS para la tinción superficial posterior) (Figura 3).
    13. Con una pipeta de 1 ml, transfiera las suspensiones celulares a la parte superior de un tubo superior del filtro (Tabla de materiales) y deje que las células se filtren al fondo del tubo para eliminar cualquier residuo de mielina restante.
    14. Usando un tinte de exclusión azul de tripano, diluya y cuente las células en un hemocitómetro promediando al menos dos cuadrículas de 16 cuadrados para una precisión40,41.
    15. Proceda con la técnica de análisis de una sola célula deseada.
      NOTA: Utilizando varias formas de colagenasa (es decir, D, tipo I, tipo II, tipo IV), las células inmunitarias, la microglía (Figura 3), los astrocitos, los pericitos, las células endoteliales49 y las neuronas50 se pueden aislar de manera eficiente. Los recuentos de células nucleadas obtenidos para los resultados fueron los siguientes utilizando la enzima colagenasa I titulada: Cerebro entero tratado simulado = 500.000-600.000 células; Cerebro completo de TMEV-IDD = 800.000-1.000.000 de células; Médula espinal entera tratada de forma simulada = 150.000–200.000 células; Médula espinal completa de TMEV-IDD = 300.000–400.000. Los recuentos celulares variarán dependiendo de la precisión de la recolección, el procesamiento y la presencia de inflamación del SNC.

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Representative Results

Este experimento representativo tuvo como objetivo cuantificar las células B y T y describir la localización de las células B y T en los compartimentos meníngeo y parenquimatoso del SNC en condiciones homeostáticas, así como en un modelo de EM progresiva murina (es decir, TMEV-IDD). La TMEV-IDD fue inducida en ratones hembra SJL de 5 semanas de edad mediante infección intracraneal con 5 x 106 unidades formadoras de placa (UFP) de TMEV BeAn como se describió anteriormente29.

El presente estudio evaluó las células B y T en las meninges, el cerebro y la médula espinal durante la TMEV-IDD crónica en el día 120 después de la infección. Se utilizaron ratones tratados simuladamente de la misma edad como controles. El estudio se compuso de dos experimentos. El primero se centró en la obtención de suspensiones unicelulares para la evaluación por citometría de flujo, una técnica bien establecida para analizar y cuantificar la composición celular mediante la evaluación de la superficie celular y/o los antígenos intracelulares (n = 4 tratados simuladamente; n = 5 TMEV-IDD). El segundo experimento se centró en describir la localización de las células B y T en el compartimento del SNC mediante la utilización de inmunohistoquímica en tejidos cerebrales y de médula espinal descalcificados (n = 3 tratados simuladamente; n = 8 TMEV-IDD).

Tras el aislamiento de suspensiones unicelulares del cerebro, la médula espinal y las meninges agrupadas (cerebro y médula espinal) de ratones tratados con TMEV-IDD y simulados, se aplicó un protocolo de tinción superficial a todas las muestras. Brevemente, las suspensiones unicelulares se incubaron con una tinción de exclusión de viabilidad fijable (780) durante 15 min, se lavaron, se bloquearon con un bloque Fc en presencia de suero de ratón durante 15 min, y se tiñeron con anticuerpos conjugados para marcadores de superficie celular, incluyendo CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3; PE-CF594) y CD4 (GK1.5; EP) durante 30 min como se ha descrito anteriormente28,29. A continuación, las células fueron lavadas y analizadas con un citómetro de flujo28,29. La compuerta de viabilidad se llevó a cabo como se describió anteriormente28. Se evaluó la expresión de CD45 para distinguir las células inmunitarias infiltrantes (P1)derivadas periféricamente de CD45 de las microglías CD45 (P2) y las neuronas, astrocitos y oligodendrocitos del cerebro y la médula espinal(P3; Figura 3A). En los ratones tratados con simulación, pocas células CD45hi estaban presentes en la médula espinal y el tejido cerebral. En las meninges, se aplicó el mismo punto de corte de compuerta para la expresión de CD45 hi utilizado para los datos del cerebro y la médula espinal para identificar las células inmunitarias CD45hi (P1; Figura 3C) y excluir las células no inmunitarias presentes en las meninges (es decir, fibroblastos, células endoteliales). En los ratones tratados simuladamente,pocas células hi CD45 (<0,1%) estaban presentes en las meninges. Entre las células inmunitarias CD45hi en los tejidos del SNC TMEV-IDD, se identificaron las células B y las células T CD4 por la expresión superficial de CD19 y CD4, respectivamente (Figura 3B-D). En todos los tejidos del SNC de TMEV-IDD, se observó un aumento de los porcentajes de células inmunitarias CD45hi en comparación con los ratones tratados de forma simulada (Figura 4A). Durante la EMV-IDD crónica, el porcentaje de células B entre las células inmunitarias CD45hi en el cerebro y la médula espinal fue mayor en comparación con el compartimento meníngeo (Figura 4B).

Para identificar la localización de los linfocitos B y T dentro del compartimento del SNC durante la IDD-TMEV crónica, se evaluaron cerebros y médula espinal descalcificados mediante inmunohistoquímica utilizando el protocolo de tinción descrito anteriormente29. Las meninges y la vasculatura se delimitaron mediante laminina, un componente de la membrana basal29,51 y ER-TR7, un marcador de células reticulares de fibroblastos52,53. Durante la extracción convencional del cerebro del casquete craneal, la capa de pia estaba intacta, pero se excluyeron las capas meníngeas restantes (Figura 5A). En la médula espinal, la extrusión hidráulica dio lugar a la ausencia de todas las capas meníngeas (datos no mostrados). Tanto en el cerebro descalcificado como en la médula espinal, todas las capas meníngeas estaban intactas (Figura 5B). Para examinar la localización de los linfocitos B y T en la IDD crónica de TMEV, se utilizó la expresión de IgG para determinar la localización de los linfocitos B 29 con cambio de isotipo, y se utilizó CD3 para visualizar todos los linfocitos T29. La cotinción de IgG con ER-TR7 reveló que las células B IgG+ conmutadas por isotipo estaban presentes en el parénquima del SNC y en las meninges (Figura 6A). Los agregados celulares dentro de las meninges ER-TR7+ contenían múltiples células B IgG+ y células T CD3+ (Figura 6B).

Los resultados representativos muestran altos porcentajes de células B y células T en los compartimentos parenquimatoso y meníngeo en ratones con IDD crónico de TMEV en contraste con ratones tratados simulados de la misma edad. El análisis de IHQ demostró además que en el tejido TMEV-IDD, las células B y las células T estaban dispersas en el parénquima, pero estaban estrechamente asociadas en las meninges, formando agregados inflamatorios. En los pacientes con EM progresiva, los agregados inflamatorios meníngeos se asocian con lesiones tisulares adyacentes y peores resultados de la enfermedad. En la EMV-IDD crónica, la presencia persistente de células B y T en el compartimento del SNC y la agregación en las meninges pueden estar asociadas con lesión tisular y progresión de la enfermedad. Se necesitan más estudios para comprender cómo la inflamación meníngea versus parenquimatosa afecta la desmielinización, la neurodegeneración y la discapacidad clínica.

Figure 1
Figura 1: Aislamiento de cerebros y médula espinal para la descalcificación. Las líneas punteadas azules indican cortes hechos para aislar el cerebro con el cráneo intacto (cortes 1-4) y la columna vertebral (cortes 5-8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Aislamiento de cerebros, médula espinal y meninges para técnicas unicelulares. (A) Las líneas punteadas azules indican cortes realizados para aislar la tapa del cráneo con meninges y cerebro intactos (cortes 1-3) y columna vertebral (cortes 5-7). El corte lateral 3 se realiza en ambos lados del cráneo. (B) La línea azul indica la incisión realizada para marcar y extirpar las meninges en la tapa del cráneo y los cortes realizados en la columna vertebral (ambos lados laterales) para aislar la médula espinal y las meninges. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Identificación de células inmunitarias infiltrantes de CD45hi en tejidos del SNC. (A) Estrategia de activación para la identificación de células inmunitarias inmunitarias (P1) CD45hi (P1), microglía CD45 lo (P2) y oligodendrocitos, astrocitos y neuronas CD45- entre el total de células vivas en la médula espinal de ratones tratados con simulación (rojo) o TMEV-IDD (azul). Se detectaron célulashi CD45 mínimas en cerebros y médula espinal tratados con simulación. (B) Estrategia de activación para identificar las células B CD19+ y las células T CD4+ entre las células inmunitarias infiltrantes CD45hi (P1) en ratones TMEV-IDD. Las estrategias de activación fueron similares para el tejido cerebral y de la médula espinal. (C) Estrategia de activación para la identificaciónde células altas CD45 (P1) en las meninges de ratones tratados simuladamente (rojo) y ratones TMEV-IDD crónicos (azul). (D) Estrategia de activación para identificar las células B CD19+ y las células T CD4+ entre las células inmunitarias infiltrantes de CD45hi (P1) en las meninges de ratones con TEM-IDD crónico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Las células inmunitarias CD45hi y las células B CD19+ aumentaron en los tejidos del SNC en la IDD de TMEV crónica. Los resúmenes de los gráficos de barras de los datos de citometría de flujo obtenidos de las meninges, el cerebro y la médula espinal tratados de forma simulada o con TMEV-IDD muestran porcentajes de células inmunitarias infiltrantes CD45hi (A) o porcentajes de células B CD19+ (B). Para los tejidos TMEV-IDD, los datos de citometría de flujo se obtuvieron de cinco ratones, con la médula espinal y el cerebro procesados individualmente, mientras que las meninges se agruparon para su análisis. En el caso de los ratones tratados con simulación, se obtuvieron datos de citometría de flujo de cuatro ratones, con la médula espinal y el cerebro procesados individualmente, mientras que las meninges se agruparon para su análisis. Los datos de la médula espinal y el cerebro se muestran como media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Capas meníngeas intactas en cerebros y médula espinal descalcificados. (A) Los cerebros extraídos de la capa craneal o (B) cerebros descalcificados con cráneos y columnas vertebrales intactos de ratones con TMEV-IDD crónico se evaluaron para DAPI (azul), marcadores meníngeos laminina (verde) y ER-TR7 (rojo). Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: La agregación de células inmunitarias fue evidente en las meninges durante la IDD-TMEV crónica. (A) Se examinaron las columnas vertebrales descalcificadas de ratones con TMEV-IDD crónica para detectar la presencia de IgG (verde) para identificar células inmunitarias con cambio de isotipo en el parénquima y en las meninges ER-TR7+ (rojo). (B) Los linfocitos T CD3+ (verde) y los linfocitos B con cambio de isotipo IgG+ (rojo) se combinaron con meninges ER-TR7+ para evaluar la localización dentro del tejido de la médula espinal. Las flechas blancas resaltan las células B y T dentro de las meninges. Barra de escala = 50 μm. Los cuadros blancos delimitan las áreas seleccionadas para las imágenes recortadas (derecha; barra de escala = 10 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los métodos para evaluar la composición celular en el compartimento del SNC durante la homeostasis y la enfermedad son esenciales para comprender los estados fisiológicos y patológicos del SNC. Sin embargo, a pesar de servir como una barrera importante en el SNC y albergar una amplia gama de células inmunitarias, las meninges a menudo se omiten del análisis porque muchos métodos convencionales de extracción de tejidos para el cerebro y la médula espinal no permiten la recolección de estas membranas. Esta omisión es una limitación crítica en el avance de nuestra comprensión de la composición celular y la función de las meninges y su papel en el estado estacionario y las condiciones inflamatorias. Estudios recientes revelaron que tanto las células inmunitarias residentes como las derivadas periféricas que residen en el compartimento meníngeo desempeñan un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis en el SNC, así como en la patogénesis de la enfermedad del SNC. Estos estudios enfatizan la necesidad de analizar no solo el compartimento parenquimatoso sino también las capas meníngeas circundantes. Los protocolos descritos aquí permiten el aislamiento rápido del cerebro y la médula espinal mientras se preservan las meninges, lo que en última instancia permite un análisis exhaustivo del compartimento del SNC utilizando estudios histológicos y de células individuales. Los resultados representativos se centran en la evaluación de las células inmunitarias en el compartimento del SNC; sin embargo, los protocolos pueden adaptarse para analizar la microglía, los astrocitos, las neuronas, los pericitos, las células endoteliales u otras células residentes del SNC.

Un paso crítico en los métodos descritos es la extracción cuidadosa del tejido, esencial tanto para aislar suspensiones unicelulares puras del cerebro, la médula espinal y las meninges como para obtener tejidos del SNC con cráneos intactos o columnas vertebrales, lo que permite una morfología tisular de alta calidad. La práctica de la técnica para obtener suspensiones unicelulares es la clave para una extracción exitosa de tejidos, ya que no solo mejorará la pureza de la muestra, sino que también mejorará el rendimiento celular para aplicaciones posteriores. Del mismo modo, la práctica en el aislamiento de tejidos del SNC con cráneos o columnas vertebrales intactas para eliminar adecuadamente el exceso de tejido que rodea el hueso es un paso esencial que garantiza una mejor fijación, descalcificación y criopreservación del tejido, todos ellos componentes cruciales para obtener cortes de tejido con morfología de alta calidad y dianas antigénicas intactas.

Una limitación de nuestro protocolo para aislar suspensiones unicelulares de las meninges es que se centra en la obtención de meninges durales y aracnoideas32,54 y omite el aislamiento de la pia, que permanece unida al cerebro o a la médula espinal a través de procesos astrocitarios. A pesar de que las células que residen en la piamadre son un componente esencial del compartimento meníngeo, se decidió excluir la piamadre durante la preparación de la suspensión unicelular debido a la gran cantidad de tiempo requerido para aislarla adecuadamente55. Del mismo modo, el protocolo solo se centra en la obtención de meninges en la porción superior del cráneo y excluye el aislamiento de las meninges invaginantes en el cerebro y el plexo coroideo. La recolección de las meninges invaginadoras y del plexo coroideo puede realizarse de acuerdo con los protocolos publicados previamente55, aunque es un procedimiento que requiere mucho tiempo. En ambos casos, la elección de omitir parte de las capas meníngeas se debió a la cantidad de tiempo que se requiere para aislarlas. El momento del protocolo utilizado para preparar las suspensiones unicelulares necesarias para aplicaciones posteriores, como la citometría de flujo, los ensayos de cultivo celular y la secuenciación de ARN (RNAseq), es fundamental para mejorar la viabilidad celular y la calidad de los datos. Por lo tanto, dependiendo de la pregunta de investigación específica, se debe lograr un equilibrio entre el tiempo de aislamiento de la muestra y la minuciosidad en la extracción de las meninges. En el protocolo actual, solo se obtienen preparaciones de suspensión unicelular de las meninges duramadre y aracnoideas, lo que limita la capacidad de extrapolar los resultados a la totalidad de las meninges del SNC. Sin embargo, si estos métodos se utilizan en combinación con el análisis de IHQ o ISH de secciones de tejido completo con las tres capas de meninges, se puede obtener una comprensión más profunda de la dinámica celular y molecular en los compartimentos parenquimatoso y meníngeo.

Otra limitación del protocolo es el bajo número de células obtenido de las meninges durales y aracnoideas, especialmente en condiciones homeostáticas. Sin embargo, si se considera que el número de células en la médula espinal, el cerebro o las meninges es demasiado bajo para el análisis de una población de células diana en particular, el número mínimo de células requerido para ese análisis puede determinarse estimando el número total de eventos necesarios para una precisión dada (por ejemplo, un coeficiente de variación del 5%) como se describe en la literatura previa especializada en el análisis de eventos raros56. Estos cálculos se pueden utilizar para determinar si las muestras de varios animales deben agruparse para adquirir un número de células suficiente para analizar la población de células de interés.

Los métodos descritos proporcionan un avance esencial en la investigación de la dinámica celular dentro del compartimento del SNC al ampliar los análisis para incluir el compartimento meníngeo comúnmente descuidado. Estos protocolos permiten la extracción individual del cerebro, la médula espinal y las meninges durales y aracnoideas para generar suspensiones unicelulares. Además, el protocolo de descalcificación permite el análisis histológico de secciones de tejido que comprenden tejido cerebral o de médula espinal, incluidas las tres capas meníngeas. El uso de EDTA proporciona un proceso de descalcificación lento pero suave, que es más apropiado para muestras donde se requiere una morfología de tejido de alta calidad (p. ej., IHQ e ISH). El protocolo utiliza un pH de 7,2 a 7,4 para disminuir la velocidad de descalcificación y garantizar el mantenimiento de la morfología intacta del tejido, una clara ventaja sobre los ácidos fuertes y débiles (por ejemplo, ácido clorhídrico y ácido tricloroacético), que tienen un tiempo de descalcificación más corto, pero afectan la calidad de la morfología del tejido.

Los métodos futuros que buscan aislar suspensiones unicelulares de las meninges deben centrarse en el desarrollo de protocolos para acortar el tiempo requerido para aislar completamente la capa pial de los tejidos del SNC y las meninges invaginantes en el cerebro. La obtención del complejo completo de las tres capas meníngeas no solo aumentará el número de células para cualquier análisis, sino que también proporcionará una evaluación más completa de las células inmunitarias residentes e infiltrantes que ocupan las meninges, que encierran el SNC. Al mismo tiempo, los protocolos futuros centrados en la preparación de cerebros y médula espinal descalcificados deben tratar de identificar nuevos agentes destinados a acelerar la descalcificación de los tejidos preservando al mismo tiempo la calidad de la morfología de los tejidos. Sin embargo, en conjunto, las aplicaciones posteriores que analizan suspensiones unicelulares del SNC, incluidas las meninges duales y aracnoideas, realizadas en combinación con un análisis exhaustivo de secciones de tejido, pueden proporcionar una comprensión detallada del fenotipo, la función y la localización de las células dentro del compartimento del SNC.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen al personal del Centro de Medicina e Investigación Comparativa (CCMR) de Dartmouth por su atención experta a los ratones utilizados para estos estudios. El Fondo de Investigación Bornstein financió esta investigación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

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References

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Immunology and Infection Número 159 meninges sistema nervioso central descalcificación inmunohistoquímica suspensión unicelular células inmunitarias ratones
Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias
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DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

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