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Immunology and Infection

प्रतिरक्षा कोशिकाओं के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के ऊतकों और संबंधित मेनिंगेस को अलग करना

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

यह पेपर मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और मेनिंगेस सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के भीतर निवासी और परिधीय रूप से व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जांच के लिए दो अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इनमें से प्रत्येक प्रोटोकॉल स्थिर अवस्था और भड़काऊ स्थितियों के तहत इन डिब्बों पर कब्जा करने वाली कोशिकाओं के कार्य और संरचना का पता लगाने में मदद करता है।

Abstract

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी से बना होता है और परिधि और सीएनएस के बीच एक बाधा के रूप में काम करने वाली मेनिंगेस, झिल्लीदार परतों से घिरा होता है। सीएनएस एक प्रतिरक्षात्मक रूप से विशिष्ट साइट है, और स्थिर स्थिति की स्थिति में, प्रतिरक्षा विशेषाधिकार सीएनएस पैरेन्काइमा में सबसे अधिक स्पष्ट है। इसके विपरीत, मेनिंगेस निवासी कोशिकाओं की एक विविध सरणी को आश्रय देते हैं, जिसमें जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं। सीएनएस की चोट, ऑटोइम्यूनिटी, संक्रमण, या यहां तक कि न्यूरोडीजेनेरेशन से उत्पन्न सूजन की स्थिति के दौरान, परिधीय रूप से व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाएं पैरेन्काइमा में प्रवेश कर सकती हैं और मेनिंगेस के भीतर निवास कर सकती हैं। इन कोशिकाओं को सीएनएस रोग रोगजनन के दौरान लाभकारी और हानिकारक दोनों कार्यों को करने के लिए माना जाता है। इस ज्ञान के बावजूद, सीएनएस डिब्बे का विश्लेषण करते समय मेनिंगेस को अक्सर अनदेखा किया जाता है, क्योंकि पारंपरिक सीएनएस ऊतक निष्कर्षण विधियां मेनिंगियल परतों को छोड़ देती हैं। यह प्रोटोकॉल मुराइन सीएनएस ऊतकों (यानी, मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और मेनिंगेस) के तेजी से अलगाव के लिए दो अलग-अलग तरीके प्रस्तुत करता है जो एकल-कोशिका तकनीकों, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और सीटू संकरण विधियों के माध्यम से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं। वर्णित विधियां सीएनएस ऊतकों का एक व्यापक विश्लेषण प्रदान करती हैं, जो होमोस्टैटिक स्थितियों के तहत और रोग रोगजनन के दौरान सीएनएस डिब्बे पर कब्जा करने वाली कोशिकाओं के फेनोटाइप, कार्य और स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए आदर्श हैं।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) एक प्रतिरक्षात्मक रूप से विशिष्ट साइट है। सीएनएस पैरेन्काइमा, सीएसएफ स्पेस, मेनिंगेस और वास्कुलचर को छोड़कर, शास्त्रीय रूप से प्रतिरक्षा-विशेषाधिकार प्राप्त साइट 1,2,3,4,5 के रूप में देखा जाता है और होमियोस्टैटिक स्थितियों 2,6,7 के दौरान प्रतिरक्षा कोशिकाओं से अपेक्षाकृत रहित होता है। इसके विपरीत, ड्यूरा, अरचनॉइड और पिया परतों से युक्त मेनिंगेस, सीएनएस डिब्बे के महत्वपूर्ण घटक हैं, जो रोग रोगजनन 3,6,7,8 के दौरान होमियोस्टैटिक प्रतिरक्षा निगरानी और भड़काऊ प्रक्रियाओं में सक्रिय रूप से भाग लेते हैं। स्थिर अवस्था की स्थिति के दौरान, मेनिंगेस कई प्रतिरक्षा प्रहरी कोशिकाओं का समर्थन करते हैं, जिनमें जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाएं (आईएलसी), मैक्रोफेज, डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी), मस्तूल कोशिकाएं, टी कोशिकाएं और कुछ हद तक, बी कोशिकाएं 9,10,11 शामिल हैं।

मेनिंगेस अत्यधिक संवहनी संरचनाएं हैं और इसमें लसीका वाहिकाएं होती हैं जो सीएनएस और इसकी परिधि 8,12,13,14 के बीच एक लसीका कनेक्शन प्रदान करती हैं। सीएनएस की चोट, संक्रमण, ऑटोइम्यूनिटी, या यहां तक कि न्यूरोडीजेनेरेशन से प्रेरित भड़काऊ स्थितियों में, परिधीय रूप से व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाएं पैरेन्काइमा में घुसपैठ करती हैं और मेनिंगेस के भीतर प्रतिरक्षा परिदृश्य को बदल देती हैं। सेल घुसपैठ के बाद, मेनिंगेस परिधीय रूप से व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए एक कार्यात्मक स्थान का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, प्रतिरक्षा कोशिका एकत्रीकरण, स्थानीय प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण और सीएनएस डिब्बे में दीर्घकालिक अस्तित्व को बढ़ावा दे सकते हैं। सीएनएस को प्रभावित करने वाली कई बीमारियों में प्रमुख मेनिंगियल सूजन देखी जाती है, जिसमें मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) 15,16,17,18,19, स्ट्रोक20,21, बाँझ चोट 22,23 (यानी, रीढ़ की हड्डी की चोट और दर्दनाक मस्तिष्क की चोट), माइग्रेन 24, और माइक्रोबियल संक्रमण 25,26,27,28,29. इस प्रकार, मेनिंगियल डिब्बे में निवासी कोशिकाओं और परिधीय रूप से व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं का लक्षण वर्णन स्थिर अवस्था की स्थिति और रोग रोगजनन के दौरान इन कोशिकाओं की भूमिका को समझने के लिए आवश्यक है।

क्रैनियम और कशेरुक शरीर से मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और मेनिंगेस का निष्कर्षण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला है। वर्तमान में मस्तिष्क के तेजी से निष्कर्षण के लिए कोई तकनीक उपलब्ध नहीं है, जिसमें सभी तीन मेनिंगियल परतें बरकरार हैं। जबकि लैमिनेक्टॉमी उत्कृष्ट रीढ़ की हड्डी ऊतक आकृति विज्ञान पैदा करता है और मेनिंगियल परतों को संरक्षित करता है, यह बेहद समय लेने वाला और जटिल30,31 दोनों है। इसके विपरीत, अधिक पारंपरिक निष्कर्षण विधियां जैसे कि क्रैनियम से मस्तिष्क को हटाना और रीढ़ की हड्डी का हाइड्रोलिक एक्सट्रूज़न सीएनएस ऊतक के त्वरित निष्कर्षण की सुविधा प्रदान करता है, लेकिनइन तकनीकों के साथ अरचनॉइड और ड्यूरल मेनिंगेस दोनों खो जाते हैं। मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के पारंपरिक अलगाव के दौरान ड्यूरा और अरचनॉइड परतों की चूक के परिणामस्वरूप सीएनएस डिब्बे के भीतर कोशिकाओं का अधूरा विश्लेषण होता है। इस प्रकार, बरकरार मेनिंगेस के साथ सीएनएस ऊतकों के त्वरित निष्कर्षण पर केंद्रित नई तकनीकों की पहचान सीएनएस डिब्बे के इष्टतम विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है।

यह पांडुलिपि चूहों से मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और मेनिंगेस के तेजी से निष्कर्षण के लिए दो तरीकों को प्रस्तुत करती है, जो सीएनएस पैरेन्काइमा और मेनिंगेस में निवासी कोशिकाओं और परिधीय रूप से व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की सुविधा प्रदान करती है। ये अनुकूलित प्रोटोकॉल 1) डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एकल-सेल निलंबन को अलग करने और 2) हिस्टोलॉजिकल प्रसंस्करण के लिए ऊतक तैयार करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं। मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी के ऊतक, और ड्यूरल और अरचनॉइड मेनिंगेस32 से एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करना पैरेन्काइमल और मेनिंगियल डिब्बों दोनों में रहने वाली कोशिकाओं के एक साथ विश्लेषण की अनुमति देता है। एकल-कोशिका निलंबन का उपयोग विभिन्न अनुप्रयोगों में किया जा सकता है, जिसमें इन विट्रो उत्तेजना 33, एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोस्पॉट (ईएलआईस्पॉट) 28,34,35, फ्लो साइटोमेट्री 36,33 और एकल-सेल 37 या थोक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स करने के लिए सेल कल्चर परख शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, क्रमशः बरकरार खोपड़ी या कशेरुक स्तंभों के साथ पूरे दिमाग और रीढ़ की हड्डी के डिकैल्सीफिकेशन के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल, आसपास की हड्डी के कोमल डिकैल्सीफिकेशन की अनुमति देता है, जिससे मेनिंगेस बरकरार रहते हैं और ऊतक आकृति विज्ञान को संरक्षित करते हैं। यह विधि पैरेन्काइमल और मेनिंगियल रिक्त स्थान दोनों के भीतर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) या सीटू संकरण (आईएसएच) तकनीकों का उपयोग करके प्रोटीन या आरएनए की चयनात्मक पहचान की अनुमति देती है। सीएनएस के भीतर निवासी कोशिकाओं और परिधीय रूप से व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के फेनोटाइप, सक्रियण स्थिति और स्थानीयकरण का लक्षण वर्णन यह समझने के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकता है कि सीएनएस डिब्बे में व्यक्तिगत सेल प्रकार होमियोस्टैसिस और रोग रोगजनन में कैसे योगदान करते हैं।

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Protocol

सभी पशु कार्य डार्टमाउथ में गीसेल स्कूल ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा समीक्षा और अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं।

1. डिकैल्सीफिकेशन के लिए मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के नमूनों को संसाधित करना

  1. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के नमूने अलग करना
    1. सीओ2 इनहेलेशन के माध्यम से माउस को इच्छामृत्यु करें। सुनिश्चित करें कि सीओ2 प्रवाह दर प्रति मिनट पिंजरे की मात्रा का 10% -30% विस्थापित करती है।
    2. बल का उपयोग करके, ज़िफॉइड प्रक्रिया को उठाएं, और कैंची से पसली पिंजरे के ठीक नीचे पेट की दीवार को काट दें, अंतर्निहित रक्त वाहिकाओं या अंगों को काटने से बचने के लिए ऊपर खींचें। डायाफ्राम को पार्श्व रूप से काटें।
    3. कॉलरबोन तक फेफड़ों के समानांतर पार्श्व किनारों के साथ पसली के पिंजरे को काटें। बल का उपयोग करके, उरोस्थि को उठाएं और उरोस्थि को हेमोस्टैट से दबाएं। पसली के पिंजरे को दूर उठाने और दिल को उजागर करने के लिए सिर के ऊपर हेमोस्टैट रखें।
    4. बल का उपयोग करके, दिल को उसके शीर्ष के पास पकड़ें और एक आउटलेट प्रदान करने के लिए हृदय के दाहिने आलिंद में एक चीरा लगाएं। माउस को ट्रांसकार्डियल रूप से प्रत्यारोपित करने के लिए बाएं वेंट्रिकल में धीरे-धीरे 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 1एक्स फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) को प्रशासित करने के लिए 10 एमएल सिरिंज के साथ 25 ग्राम सुई डालें।
      नोट: छिड़काव 4-5 मिनट से अधिक होना चाहिए जब तक कि यकृत रक्त से साफ न हो जाए। 1x PBS का कुल 10 mL आमतौर पर छिड़काव के लिए पर्याप्त है, लेकिन यदि आवश्यक हो तो अधिक उपयोग किया जा सकता है। एक स्पष्ट यकृत आमतौर पर पर्याप्त छिड़काव को इंगित करता है।
    5. तेज कैंची का उपयोग करके, सिर को सिर को डिकैपिटेशन द्वारा हटा दें (चित्र 1; 1)। त्वचा में एक मध्य रेखा चीरा लगाएं (चित्र 1; 2) और खोपड़ी को मुक्त करने के लिए आंखों के ऊपर त्वचा को पलटें।
    6. खोपड़ी से जबड़ा छोड़ने के लिए नाक की हड्डी को काट लें (चित्र 1; 3)। जबड़ा, जीभ और आंखों को हटा दें। बाहरी श्रवण मांस के साथ ऊतक को छोड़ने के लिए खोपड़ी के पार्श्व पहलुओं के साथ काट लें (चित्रा 1; 4)। खोपड़ी को हटाने वाली सभी अतिरिक्त त्वचा, मांसपेशियों और ऊतक को हटाने के लिए ट्रिम करें।
    7. तेज कैंची से रीढ़ की हड्डी के समानांतर काटकर रीढ़ की हड्डी के स्तंभ से पसली के पिंजरे को अलग करें (चित्र 1; 5 और 6)। रीढ़ की हड्डी के स्तंभ को अलग करने के लिए निचले काठ के क्षेत्र में एक छोटा सा कट बनाएं (चित्र 1; 7)। कशेरुक को उजागर करने के लिए रीढ़ के साथ किसी भी शेष मांसपेशी को ट्रिम करें और हटा दें (चित्र 1; 8)।
      नोट: रीढ़ की हड्डी के स्तंभ और खोपड़ी से अतिरिक्त ऊतक को हटाना फिक्सेटिव पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) और एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) डीकैल्सीफिकेशन बफर के पर्याप्त प्रवेश को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।
  2. पोस्ट-फिक्सेशन, डीकैल्सीफिकेशन और क्रायोप्रिजर्वेशन
    1. बल का उपयोग करके, मस्तिष्क को बरकरार खोपड़ी या रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें जिसमें 4% पीएफए का 10 एमएल होता है। पर्याप्त निर्धारण के लिए ट्यूबों को कम से कम 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: ऊतक के अतिनिर्धारण से बचने के लिए, निर्धारण के 72 घंटे से अधिक न करें। डीकैल्सीफिकेशन से पहले हड्डी के नमूनों के लिए निर्धारण समय बढ़ाया जाता है। पर्याप्त निर्धारण ऊतक को डिकैल्सीफिकेशन के प्रभाव से बचाएगा और बेहतर ऊतक आकृति विज्ञान सुनिश्चित करेगा।
    2. 4% पीएफए से ऊतक को बलके साथ हटाकर मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी को कुल्ला करें और ऊतक को 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के 10 एमएल के साथ डिस्पोजेबल 14 एमएल ट्यूब में रखें। मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी को 10% ईडीटीए (पीएच = 7.2–7.4) के 10 एमएल के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: ईडीटीए के 10 एमएल के साथ एक बड़ी ट्यूब का उपयोग करने से ईडीटीए को ऊतक के साथ अधिक संपर्क क्षेत्र मिलता है और डीकैल्सीफिकेशन प्रक्रिया में तेजी आती है।
    3. दैनिक जांचें कि क्या हड्डी नरम और व्यवहार्य है: ईडीटीए समाधान से ऊतक को बल के साथ हटा दें, इसे पेट्री डिश पर रखें, और धीरे से 25 ग्राम सुई के साथ हड्डी की कोमलता का परीक्षण करें। यदि सुई आसानी से हड्डी में प्रवेश करती है, तो डिकैल्सीफिकेशन प्रक्रिया पूरी हो जाती है।
    4. ईडीटीए समाधान से ऊतक को हटा दें और मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी को 14 एमएल डिस्पोजेबल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल 1x पीबीएस होता है और 10 मिनट के लिए धो लें। धोने को दोहराएं।
      नोट: डिकैल्सीफिकेशन में आमतौर पर 2-3 दिन लगते हैं। समाधान को हर 2-3 दिनों में बदला जाना चाहिए यदि हड्डी अभी तक पर्याप्त रूप से डिकैल्सीफाइड नहीं है। हालांकि, हड्डी को डिकैल्सीफाइड करने के बाद ईडीटीए में लंबे समय तक इनक्यूबेशन ऊतक आकृति विज्ञान को नुकसान पहुंचा सकता है।
    5. 1x PBS में सुक्रोज जोड़कर 10%, 20%, और 30% सुक्रोज समाधान तैयार करें। उदाहरण के लिए, 10% सुक्रोज के लिए, 10 ग्राम सुक्रोज जोड़ें और बाँझ 1x पीबीएस का उपयोग करके मात्रा को 100 एमएल तक लाएं। घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक स्टोर करें।
      नोट: सुक्रोज समाधान सूक्ष्मजीव विकास के लिए प्रवण हैं, इसलिए इन समाधानों में नमूनों को लंबे समय तक संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए।
    6. 1x PBS से ऊतक निकालें, इसे 10% सुक्रोज घोल के 10 मिलीलीटर में रखें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ऊतक को 24 घंटे तक बैठने दें या जब तक यह ट्यूब के तल तक डूब न जाए।
    7. इस प्रक्रिया को दोहराएं, ऊतक को पहले 20% सुक्रोज समाधान में ले जाएं और अंत में 30% सुक्रोज समाधान में ले जाएं। ऊतक को 30% सुक्रोज (कम से कम 24 घंटे) में डूबने दें और ऊतक एम्बेडिंग के लिए आगे बढ़ें।
  3. ऊतक एम्बेडिंग और फ्रीजिंग
    1. फोर्सप्स का उपयोग करके, 30% सुक्रोज से ऊतक को हटा दें, इसे पेट्री डिश पर रखें, और ऊतक पर किसी भी अतिरिक्त सुक्रोज समाधान से छुटकारा पाने के लिए डिश को झुकाएं। एक स्केलपेल का उपयोग करके, ऊतक को वांछित खंडों में काटें।
    2. क्रायोमोल्ड के तल पर इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक की एक पतली परत बनाएं और मोल्ड में ऊतक टुकड़ा (ओं) रखें। ऊतक को पूरी तरह से ओसीटी यौगिक के साथ कवर करें, यह सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले मौजूद नहीं हैं।
    3. तरल नाइट्रोजन38 पर मंडराकर या ब्लॉक को 100% आइसोप्रोपेनोल / सूखी बर्फ घोल39 पर सेट करके ब्लॉक को फ्रीज करें जब तक कि ब्लॉक अपारदर्शी न हो जाए। एल्यूमीनियम पन्नी में क्रायोमोल्ड्स लपेटें और लंबे समय तक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक स्टोर करें। सेक्शनिंग से पहले ब्लॉक को -20 डिग्री सेल्सियस तक ले जाएं।
      नोट: डिकैल्सीफाइड दिमाग पर हिस्टोलॉजी प्रोटोकॉल को सेक्शनिंग और प्रदर्शन करते समय सावधानी बरतनी चाहिए क्योंकि यदि वर्गों को मोटे तौर पर संभाला जाता है तो खोपड़ी और मेनिंगियल परतें खो सकती हैं।

2. फ्लो साइटोमेट्री धुंधला होने के लिए मेनिंगेस और सीएनएस ऊतकों की तैयारी

  1. खोपड़ी की टोपी और मस्तिष्क को निकालना
    1. तेज कैंची का उपयोग करके, सिर को सिर को डिकैपिटेशन द्वारा हटा दें (चित्रा 2 ए; 1)। कैंची का उपयोग करके, त्वचा में एक मध्य रेखा चीरा लगाएं (चित्रा 2 ए; 2) और खोपड़ी को मुक्त करने के लिए आंखों पर त्वचा को पलटें।
    2. कैंची को फोरमेन मैग्ना के भीतर रखें और खोपड़ी को घ्राण बल्ब की ओर कॉर्टिकल्स के साथ पार्श्व रूप से काटना शुरू करें, बाहरी श्रवण मांस और जबड़े के ऊपर चीरे रखें (चित्रा 2 ए; 3)। मस्तिष्क से खोपड़ी की टोपी को मुक्त करने के लिए घ्राण बल्ब पर कटौती के साथ विपरीत दिशा में समान कटौती करें (चित्रा 2 ए; 3)।
    3. बल का उपयोग करके, खोपड़ी की टोपी को वापस छील लें और खोपड़ी की टोपी को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें जिसमें 5 मिलीलीटर ठंडा आरपीएमआई माध्यम 25 एमएम एचईपीईएस के साथ पूरक हो। ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    4. घुमावदार बल का उपयोग करके, मस्तिष्क के आधार के नीचे बल रखें, और मस्तिष्क को खोपड़ी की टोपी से मुक्त करने के लिए उठाएं। मस्तिष्क को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें जिसमें 5 एमएल ठंडा आरपीएमआई होता है जो 25 एमएम एचईपीईएस के साथ पूरक होता है। प्रसंस्करण तक ट्यूब को बर्फ पर रखें।
  2. कशेरुक स्तंभ और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को निकालना
    1. बल और तेज कैंची का उपयोग करके, रीढ़ की हड्डी के समानांतर काटकर रीढ़ की हड्डी के स्तंभ से पसली पिंजरे को अलग करें (चित्र 2 ए; 4 और 5)। कशेरुक स्तंभ को अलग करने के लिए निचले काठ के क्षेत्र में एक छोटा सा कट बनाएं (चित्र 2 ए; 6)। कशेरुक को उजागर करने के लिए रीढ़ के साथ किसी भी शेष मांसपेशी को ट्रिम और हटा दें (चित्रा 2 ए; 7)।
    2. अतिरिक्त महीन सर्जिकल कैंची को कशेरुक स्तंभ के भीतर रखें और स्तंभ के पार्श्व किनारे के साथ काट लें (चित्रा 2 सी)। कशेरुक स्तंभ को पूर्वकाल और पीछे के हिस्से में विभाजित करने के लिए विपरीत पार्श्व किनारे को पूरी तरह से काट लें।
      नोट: रीढ़ की हड्डी कशेरुक स्तंभ से जुड़ी रहेगी।
    3. बल का उपयोग करके, धीरे-धीरे और सावधानी से रीढ़ की हड्डी को कशेरुक स्तंभ से दूर करें और ऊतक को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें जिसमें 25 एमएम एचईपीईएस के साथ 5 एमएल ठंडा आरपीएमआई होता है। रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के पूर्ववर्ती और पीछे के हिस्सों को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 25 एमएम एचईपीईएस के साथ 5 एमएल ठंडा आरपीएमआई होता है।
  3. एकल-सेल निलंबन तैयार करने के लिए मेनिंगेस को हटाना।
    1. बल का उपयोग करके, आरपीएमआई मीडिया से खोपड़ी की टोपी हटा दें। तेज बल का उपयोग करना (# 7 बल; सामग्री की तालिका), खोपड़ी टोपी के बाहरी किनारे के चारों ओर स्कोर करें (चित्रा 2 बी) और खोपड़ी की टोपी के किनारे से मेनिंगेस को छील ें, ड्यूरल और अरचनॉइड मेनिंगेस को हटाने के लिए स्क्रैपिंग करें। मेनिंगेस को पेट्री डिश पर रखें।
      नोट: मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी दोनों से मेनिंगेस को हटाने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है। यदि उपयोगकर्ता को मेनिंगेस निकालने में कठिनाई का अनुभव होता है, तो हटाने में सहायता के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    2. ट्यूब से कशेरुक स्तंभ को हटा दें। तेज बल का उपयोग करके, मेनिंगेस को मुक्त करने के लिए कशेरुक स्तंभ के किनारों के चारों ओर स्कोर करें और घुमावदार बल का उपयोग करके कशेरुक के किनारे से मेनिंगेस को छील दें। मेनिंगेस को पेट्री डिश पर रखें।
    3. एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक नायलॉन जाल छन्नी रखें। मेनिंगेस को छन्नी में ले जाएं और 25 एमएम एचईपीईएस के साथ पूरक आरपीएमआई के 3 एमएल जोड़ें। 5 एमएल सिरिंज से प्लंजर का उपयोग करके, छन्नी के माध्यम से ऊतक और मीडिया को पीस लें।
    4. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, छन्नी को अतिरिक्त 2 से 3 एमएल आरपीएमआई / एचईपीईएस मीडिया के साथ धोएं जब तक कि सभी दृश्यमान ऊतक छन्नी से गुजर न जाएं।
      नोट: फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त सेल नंबर प्राप्त करने के लिए, कई जानवरों से मेनिंगेस को एक साथ पूल करने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रयोग में (चित्रा 3 और चित्रा 4), 4-5 चूहों से मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के मेनिंग को एक साथ पूल किया गया था। यदि नमूने पूल किए जाते हैं, तो ऊतक के अतिताप को रोकने के लिए नायलॉन जाल छन्नी के माध्यम से ऊतक को पीसने के लिए अतिरिक्त मीडिया की आवश्यकता होगी।
    5. 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, कोशिकाओं और मीडिया को एक ताजा 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को 5 एमएल मीडिया के साथ धोएं। कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    6. वैक्यूम के साथ पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, सेल गोली से बचने के लिए सावधानी बरतते हुए सतह पर तैरने वाले को उत्तेजित करें और कोशिकाओं को उचित मात्रा और बफर में फिर से निलंबित करें।
    7. एकल-कोशिका निलंबन की गणना करने के लिए, ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण डाई (1:10 कमजोर पड़ने) और आरपीएमआई का उपयोग करके कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा (यानी, 5-10 μL) को पतला करें। हेमोसाइटोमीटर में कमजोर पड़ने के 10 μL जोड़ें।
    8. कोशिकाओं को पहले वर्णित40,41 के रूप में गिनें, सटीकता के लिए कम से कम दो 16 वर्ग ग्रिड का औसत।
      नोट: चित्रा 3 में, उदाहरण के लिए, मेनिंगेस से पूल, पेलेट कोशिकाओं को डाउनस्ट्रीम सतह धुंधला करने के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) बफर (1% एफबीएस के साथ 1 x पीबीएस) के 250 μL में फिर से निलंबित कर दिया गया था। कोशिकाओं को गिनती के लिए 1:10 पतला किया गया था (5 μL कोशिकाएं, 5 μL ट्राइपैन नीला, 40 μL RPMI)। इस कमजोर पड़ने से प्रति 16 वर्ग ग्रिड में 50-100 कोशिकाओं के बीच उत्पादन हुआ, जिससे अधिक सटीक सेल गिनती सुनिश्चित हुई क्योंकि कोशिकाएं न तो बहुत घनी और अतिव्यापी हैं और न ही बहुत विरल हैं। प्रति माउस पूल किए गए मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के मेनिंगेस से न्यूक्लियेटेड सेल की गिनती इस प्रकार थी: शाम-उपचार चूहों से मेनिंगेस के लिए = 100,000-150,000 कोशिकाओं और थेइलर के मुराइन एन्सेफलोमाइलाइटिस वायरस-प्रेरित डिमाइलेटिंग रोग (टीएमईवी-आईडीडी) चूहों से मेनिंगेस के लिए = 300,000-350,000 कोशिकाएं। सेल की गिनती संग्रह, प्रसंस्करण की सटीकता के आधार पर अलग-अलग होगी, और यदि मेनिंगियल सूजन मौजूद है।
    9. वांछित एकल-कोशिका तकनीक जैसे एफएसीएस सतह (चित्रा 3)14,36,42,43,44, इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग प्रोटोकॉल 33,45, इन विट्रो उत्तेजना, सेल कल्चर परख 33,46,47, एलिस्पॉट परख 28,34,35, और थोक या एकल-सेल के लिए आगे बढ़ें। ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स37,48.
      नोट: प्रसंस्करण चरणों के बीच में बर्फ पर सभी ट्यूबों को रखें।
  4. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के एकल-कोशिका निलंबन तैयार करना
    1. ट्यूब से ऊतक और मीडिया डालकर 100 मिमी पेट्री डिश के शीर्ष पर मीडिया के साथ मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को स्थानांतरित करें। फोर्सप्स का उपयोग करके, ऊतक को पेट्री डिश के तल पर ले जाएं। एक बाँझ रेजर ब्लेड के साथ मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी को बारीक कीमा करें। रेजर ब्लेड का उपयोग करके, ऊतक को इकट्ठा करने के लिए स्क्रैपिंग करके कीमा ऊतक को प्लेट के नीचे ले जाएं।
      नोट: नीचे दिए गए एंजाइमेटिक पाचन प्रोटोकॉल के लिए, प्रसंस्करण के लिए दो रीढ़ की हड्डी को एक साथ पूल किया जा सकता है। दिमाग को व्यक्तिगत रूप से संसाधित किया जाना चाहिए।
    2. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, पेट्री डिश में 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ पूरक आरपीएमआई के 3 एमएल जोड़ें। 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, मीडिया में ऊतक को फिर से निलंबित करने और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए पिपेट को ऊपर और नीचे करें।
      नोट: यदि डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन एकल-सेल या थोक आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण या सेल कल्चर है, तो एफसीएस लॉट का परीक्षण यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि विश्लेषण से पहले कोशिकाएं सक्रिय नहीं हैं। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को 10% एफसीएस के साथ आरपीएमआई के बजाय 0.04% बीएसए के साथ 1x पीबीएस का उपयोग करके संसाधित किया जा सकता है।
    3. 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, किसी भी अवशिष्ट ऊतक को इकट्ठा करने और 5 एमएल कुल मात्रा के लिए शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए अतिरिक्त 2 एमएल मीडिया के साथ पेट्री डिश को धो लें। प्रसंस्करण चरणों के बीच ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    4. एक पिपेट का उपयोग करके, वांछित एकाग्रता (यानी, 100 मिलीग्राम / एमएल) प्राप्त करने के लिए हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) मीडिया में कोलेजनेस आई पाउडर को फिर से निलंबित करें। वांछित अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए शंक्वाकार ट्यूब में कोलेजनेज टाइप 1 जोड़ें जिसमें कीमा ऊतक का नमूना होता है (यानी, 1 मिलीग्राम / एमएल के लिए 50 μL)।
      नोट: कोलेजनेस की उच्च सांद्रता सेल पैदावार में वृद्धि करेगी लेकिन सेल सतह मार्करों को छोड़ सकती है। इसलिए, सभी आवश्यक सेल सतह मार्करों के साथ उच्चतम संख्या में व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए कोलेजनेज आई लॉट को टाइट किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, कोलेजनेस I को एकल मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के नमूनों पर 0.5 मिलीग्राम / एमएल, 1 मिलीग्राम / एमएल और 2 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम सांद्रता पर परीक्षण किया गया था। सेल व्यवहार्यता को ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण विधि का उपयोग करके निर्धारित किया गया था और सेल सतह मार्कर सीडी 45, सीडी 1 9 और सीडी 4 का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। कोलेजनेस I की 1 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता ने रुचि के सभी सेल सतह मार्करों को बनाए रखते हुए उच्चतम लाइव सेल गिनती प्राप्त की। इस प्रकार, इस एकाग्रता का उपयोग इन सेल प्रकारों की जांच करने वाले आगे के प्रयोगों के लिए किया गया था।
    5. वांछित स्टॉक एकाग्रता के लिए 0.15 एम सोडियम क्लोराइड का उपयोग करके डीनेस आई पाउडर को धीरे से पुन: निलंबित करें। 20 U/mL की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए शंक्वाकार ट्यूब में पुन: निलंबित DNase I जोड़ें जिसमें कीमा ऊतक का नमूना होता है।
      नोट: DNase I लॉट प्रति एमएल गतिविधि की इकाइयों से भिन्न होता है। ऊतक के नमूने में जोड़ी जाने वाली एकाग्रता स्टॉक शीशी की प्रति मिलीलीटर गतिविधि की इकाइयों के आधार पर बदल जाएगी। प्रति नमूना अंतिम वांछित एकाग्रता 20 यू / एमएल है।
    6. ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक ट्यूब रैक में रखें और 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एंजाइमों के साथ ऊतक को अच्छी तरह से मिलाने के लिए हर 15 मिनट में ट्यूबों को घुमाएं। इनक्यूबेशन के बाद, 0.01 एम ईडीटीए की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक ट्यूब में 0.1 एम ईडीटीए (पीएच = 7.2) के 500 μL जोड़ें और कोलेजनेज को निष्क्रिय करने के लिए अतिरिक्त 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक ट्यूब की मात्रा ~ 14.5 एमएल तक लाने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 10% एफसीएस के साथ पूरक आरपीएमआई के 9 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर सेंट्रीफ्यूज। वैक्यूम के साथ पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, सतह पर तैरने वाले को सेल गोली को छूने के लिए सावधान रहें।
    8. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, सेल गोली युक्त ट्यूब में 100% स्टॉक आइसोटोनिक घनत्व ढाल समाधान के 3 एमएल जोड़ें। 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, अंतिम मात्रा को 10 एमएल तक लाने के लिए अतिरिक्त आरपीएमआई 10% एफसीएस मीडिया जोड़ें और 30% स्टॉक आइसोटोनिक घनत्व ढाल समाधान परत बनाने के लिए सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
      नोट: 100% स्टॉक आइसोटोनिक घनत्व ढाल माध्यम को पहले से तैयार करें, एलिकोट करें, और 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 100% स्टॉक आइसोटोनिक घनत्व ढाल समाधान तैयार करने के लिए, घनत्व ढाल मीडिया (सामग्री की तालिका) को घनत्व ढाल मीडिया तनुकरण बफर के साथ पतला करें। घनत्व प्रवणता मीडिया तनुकरण बफर (80.0 ग्राम /एल एनएसीएल, 3.0 ग्राम / एल केसीएल; 0.73 ग्राम / एल एनए 2 एचपी 0 4, 0.20 ग्राम / एल केएच2एचपी 04; 20.0 ग्राम/ एल ग्लूकोज) तैयार करें और वैक्यूम फिल्टर सिस्टम का उपयोग करके फ़िल्टर स्टरलाइज़ करें। घनत्व ग्रेडिएंट डाइल्यूशन बफर के 1 भाग और 9 भागों घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया को मिलाकर 100% स्टॉक आइसोटोनिक घनत्व ढाल समाधान बनाएं। अच्छी तरह मिलाएं।
    9. 70% स्टॉक आइसोटोनिक घनत्व ढाल समाधान को जोड़ने से पहले प्रत्येक ट्यूब को अच्छी तरह से मिलाएं। ट्यूब के तल में 70% स्टॉक आइसोटोनिक घनत्व ढाल समाधान के 1 एमएल युक्त 1 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट डालें। धीरे-धीरे घोल के 1 एमएल को नीचे रखें, बुलबुले न बनाने के लिए सावधान रहें। धीरे-धीरे ट्यूब से सीरोलॉजिकल पाइप को हटा दें, सावधानी बरतें कि ढाल को परेशान न करें।
      नोट: 70% अंडरले के लिए, 100% स्टॉक आइसोटोनिक घनत्व ढाल समाधान को आरपीएमआई मीडिया का उपयोग करके 70% तक पतला किया जाना चाहिए (यानी, 100% स्टॉक आइसोटोनिक घनत्व ढाल समाधान का 7 एमएल और आरपीएमआई मीडिया का 3 एमएल अच्छी तरह से मिश्रित)। इसके अतिरिक्त, माइलिन मलबे को हटाने और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद ग्रेडिएंट इंटरफ़ेस पर शुद्ध एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एक स्वच्छ, निर्विवाद 70% अंडरले बनाना आवश्यक है।
    10. बिना ब्रेक के 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 800 x g पर सेंट्रीफ्यूज। ट्यूब में 2-3 एमएल रहने तक माइलिन मलबे की परत सहित सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, सेल परत को परेशान न करने के लिए सावधान रहें। 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके 30/70% घनत्व ढाल के बीच सेल परत की कटाई करें और एक नए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    11. 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, अंतिम मात्रा को 15 एमएल तक लाने के लिए आरपीएमआई 10% एफसीएस मीडिया जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज 450 x g 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए।
      नोट: इस चरण के दौरान, यदि आवश्यक हो तो दो ट्यूबों से सेल परतों को पूल किया जा सकता है। दो से अधिक ट्यूबों को पूल न करें या उच्च घनत्व ढाल मीडिया एकाग्रता के कारण कोशिकाएं गोली नहीं चलेंगी।
    12. सेल गोली को परेशान न करने के लिए सतह पर तैरने वाले को सावधानी से एस्पिरेट करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करने के लिए कोशिकाओं को एक उपयुक्त मात्रा / बफर में पुन: निलंबित करें (उदाहरण के लिए, डाउनस्ट्रीम सतह धुंधला होने के लिए एफएसीएस बफर के 250 μL में एकल रीढ़ की हड्डी को फिर से निलंबित करें) (चित्रा 3)।
    13. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, सेल निलंबन को फ़िल्टर टॉप ट्यूब (सामग्री की तालिका) के शीर्ष पर स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को किसी भी शेष माइलिन मलबे को हटाने के लिए ट्यूब के नीचे फ़िल्टर करने की अनुमति दें।
    14. ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण डाई का उपयोग करके,40,41 सटीकता के लिए कम से कम दो 16 वर्ग ग्रिड के औसत से हेमोसाइटोमीटर पर कोशिकाओं को पतला और गिनना चाहिए।
    15. वांछित एकल-कोशिका विश्लेषण तकनीक के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: कोलेजनेस के विभिन्न रूपों (यानी, डी, टाइप 1, टाइप 2, टाइप IV), प्रतिरक्षा कोशिकाओं, माइक्रोग्लिया (चित्रा 3), एस्ट्रोसाइट्स, पेरिसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं49, और न्यूरॉन्स50 का उपयोग करके सभी को कुशलतासे अलग किया जा सकता है। परिणामों के लिए प्राप्त न्यूक्लियेटेड सेल की गिनती टाइटेटेड कोलेजनेज आई एंजाइम का उपयोग करके निम्नानुसार थी: पूरे शाम-उपचारित मस्तिष्क = 500,000-600,000 कोशिकाएं; संपूर्ण TMEV-IDD मस्तिष्क = 800,000-1,000,000 कोशिकाएं; पूरे शाम-उपचारित रीढ़ की हड्डी = 150,000-200,000 कोशिकाएं; पूरे TMEV-IDD रीढ़ की हड्डी = 300,000-400,000। सेल की गिनती संग्रह, प्रसंस्करण की सटीकता के आधार पर अलग-अलग होगी, और क्या सीएनएस सूजन मौजूद है।

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Representative Results

इस प्रतिनिधि प्रयोग का उद्देश्य बी और टी कोशिकाओं को निर्धारित करना और होमियोस्टैटिक स्थितियों में मेनिंगियल और पैरेन्काइमल सीएनएस डिब्बों में बी और टी सेल स्थानीयकरण का वर्णन करना था, साथ ही एक मुराइन प्रगतिशील एमएस मॉडल (यानी, टीएमईवी-आईडीडी) में भी। TMEV-IDD को 5 सप्ताह की मादा SJL चूहों में TMEV BeAn की 5 x 106 प्लेक बनाने वाली इकाइयों (PFU) के साथ इंट्राक्रैनील संक्रमण द्वारा प्रेरित किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित29 था।

वर्तमान अध्ययन में संक्रमण के 120 दिन बाद क्रोनिक टीएमईवी-आईडीडी के दौरान मेनिंगेस, मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में बी और टी कोशिकाओं का आकलन किया गया। उम्र-मिलान शाम-उपचारित चूहों को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। अध्ययन में दो प्रयोग शामिल थे। पहला प्रवाह साइटोमेट्रिक मूल्यांकन के लिए एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने पर केंद्रित है, जो सेल सतह और / या इंट्रासेल्युलर एंटीजन (एन = 4 शाम-उपचारित; एन = 5 टीएमईवी-आईडीडी) का मूल्यांकन करके सेल संरचना का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है। दूसरे प्रयोग ने डीकैल्सीफाइड मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों (एन = 3 शाम-उपचारित; एन = 8 टीएमईवी-आईडीडी) पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके सीएनएस डिब्बे में बी और टी सेल स्थानीयकरण का वर्णन करने पर ध्यान केंद्रित किया।

टीएमईवी-आईडीडी और शाम-उपचारित चूहों से मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और पूल ्ड मेनिंगेस (मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी) से एकल-कोशिका निलंबन के अलगाव के बाद, सभी नमूनों पर एक सतह धुंधला प्रोटोकॉल लागू किया गया था। संक्षेप में, एकल-कोशिका निलंबन को 15 मिनट के लिए एक निश्चित व्यवहार्यता बहिष्करण दाग (780) के साथ इनक्यूबेट किया गया था, धोया गया था, 15 मिनट के लिए माउस सीरम की उपस्थिति में एफसी ब्लॉक के साथ अवरुद्ध किया गया था, और सीडी 45 (30-एफ 11) सहित सेल सतह मार्करों के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। PerCP-Cy5.5, CD19 (1D3; पीई-सीएफ 594), और सीडी 4 (जीके 1.5; पीई) 30 मिनट के लिए जैसा कि पहले वर्णित28,29 है। कोशिकाओं को तब प्रवाह साइटोमीटर28,29 का उपयोग करके धोया और विश्लेषण किया गया था। व्यवहार्यता गेटिंग पहले वर्णित28 के रूप में आयोजित की गई थी। सीडी 45 अभिव्यक्ति का मूल्यांकन सीडी 45लो माइक्रोग्लिया (पी 2) और सीडी 45- न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स से सीडी 45हाय परिधीय रूप से व्युत्पन्न घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं (पी 1) को अलग करने के लिए किया गया था । चित्रा 3 ए)। शाम-उपचारित चूहों में, रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क के ऊतकों में कुछ सीडी 45एचआई कोशिकाएं मौजूद थीं। मेनिंगेस में, मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के डेटा के लिए उपयोग किए जाने वाले सीडी 45 हायअभिव्यक्ति के लिए एक ही गेटिंग कट-ऑफ सीडी 45हाय प्रतिरक्षा कोशिकाओं (पी 1) की पहचान करने के लिए लागू किया गया था। चित्र 3C) और मेनिंगेस (यानी, फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाओं) में मौजूद गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं को बाहर करें। शाम-उपचारित चूहों में, कुछ सीडी 45हाय कोशिकाएं (<0.1%) मेनिंगेस में मौजूद थीं। TMEV-IDD CNS ऊतकों में CD45hi प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, B कोशिकाओं और CD4 T कोशिकाओं की पहचान क्रमशः CD19 और CD4 की सतह अभिव्यक्ति द्वारा की गई (चित्र 3B-D)। सभी TMEV-IDD CNS ऊतकों में, शाम-उपचारित चूहों की तुलना में CD45hi प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि देखी गई (चित्रा 4A)। क्रोनिक TMEV-IDD के दौरान, मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में CD45hi प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बी कोशिकाओं का प्रतिशत मेनिंगियल कम्पार्टमेंट (चित्रा 4B) की तुलना में अधिक था।

क्रोनिक टीएमईवी-आईडीडी के दौरान सीएनएस डिब्बे के भीतर बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं के स्थानीयकरण की पहचान करने के लिए, पहले वर्णितस्टेनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके डिकैल्सीफाइड दिमाग और रीढ़ की हड्डी का मूल्यांकन किया गया था। मेनिंगेस और वास्कुलचर को लैमिनिन, एक तहखाने झिल्ली घटक29,51 और ईआर-टीआर 7, एक फाइब्रोब्लास्ट रेटिकुलर सेल मार्कर52,53 का उपयोग करके सीमांकित किया गया था। खोपड़ी की टोपी से मस्तिष्क के पारंपरिक निष्कर्षण के दौरान, पिया परत बरकरार थी, लेकिन शेष मेनिंगियल परतों को बाहर रखा गया था (चित्रा 5 ए)। रीढ़ की हड्डी में, हाइड्रोलिक एक्सट्रूज़न के परिणामस्वरूप सभी मेनिंगियल परतों (डेटा नहीं दिखाया गया) की अनुपस्थिति हुई। डिकैल्सीफाइड मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी दोनों में, सभी मेनिंगियल परतें बरकरार थीं (चित्रा 5 बी)। क्रोनिक टीएमईवी-आईडीडी में बी और टी सेल स्थानीयकरण की जांच करने के लिए, आईजीजी अभिव्यक्ति का उपयोग आइसोटाइप-स्विच्ड बी कोशिकाओं 29 के स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए किया गया था, और सीडी 3 का उपयोग सभी टी कोशिकाओं29 की कल्पना करने के लिए किया गया था। ईआर-टीआर 7 के साथ आईजीजी को सहलाने से पता चला कि आइसोटाइप-स्विच्ड आईजीजी + बी कोशिकाएं सीएनएस पैरेन्काइमा और मेनिंगेस (चित्रा 6 ए) में मौजूद थीं। ईआर-टीआर 7 + मेनिंगेस के भीतर सेलुलर समुच्चय में कई आईजीजी + बी कोशिकाएं और सीडी 3 + टी कोशिकाएं (चित्रा 6 बी) शामिल थीं।

प्रतिनिधि परिणाम उम्र से मेल खाने वाले शाम-उपचारित चूहों के विपरीत क्रोनिक टीएमईवी-आईडीडी चूहों में पैरेन्काइमल और मेनिंगियल डिब्बों में बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं दोनों के उच्च प्रतिशत दिखाते हैं। आईएचसी विश्लेषण ने आगे दिखाया कि टीएमईवी-आईडीडी ऊतक में, बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं को पैरेन्काइमा में फैलाया गया था, लेकिन मेनिंगेस में निकटता से जुड़े हुए थे, जिससे भड़काऊ समुच्चय बनते थे। प्रगतिशील एमएस रोगियों में, मेनिंगियल भड़काऊ समुच्चय आसन्न ऊतक की चोट और बदतर रोग परिणामों से जुड़े होते हैं। क्रोनिक टीएमईवी-आईडीडी में, सीएनएस डिब्बे में लगातार बी सेल और टी सेल की उपस्थिति और मेनिंगेस में एकत्रीकरण ऊतक की चोट और रोग की प्रगति से जुड़ा हो सकता है। यह समझने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है कि मेनिंगियल बनाम पैरेन्काइमल सूजन डिमाइलिनेशन, न्यूरोडीजेनेरेशन और नैदानिक विकलांगता को कैसे प्रभावित करती है।

Figure 1
चित्रा 1: डिकैल्सीफिकेशन के लिए मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को अलग करना। नीली बिंदीदार रेखाएं मस्तिष्क को बरकरार खोपड़ी (कट 1-4) और कशेरुक स्तंभ (कट 5-8) के साथ अलग करने के लिए किए गए कट का संकेत देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एकल-कोशिका तकनीकों के लिए दिमाग, रीढ़ की हड्डी और मेनिंगेस को अलग करना। (ए) नीली बिंदीदार रेखाएं खोपड़ी की टोपी को बरकरार मेनिंगेस और मस्तिष्क (कट 1-3) और कशेरुक स्तंभ (कट 5-7) के साथ अलग करने के लिए किए गए कट का संकेत देती हैं। पार्श्व कट 3 खोपड़ी के दोनों किनारों पर बनाया जाता है। (बी) नीली रेखा खोपड़ी की टोपी में मेनिंगेस को स्कोर करने और हटाने के लिए किए गए चीरे को इंगित करती है और रीढ़ की हड्डी और मेनिंगेस को अलग करने के लिए कशेरुक स्तंभ (दोनों पार्श्व पक्षों) में किए गए कट को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सीएनएस ऊतकों में सीडी 45ही घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान। (ए) शाम-उपचारित (लाल) या टीएमईवी-आईडीडी (नीले) चूहों से रीढ़ की हड्डी में कुल जीवित कोशिकाओं के बीच सीडी 45ही घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं (पी 1), सीडी 45लो माइक्रोग्लिया (पी 2), और सीडी 45- ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स की पहचान के लिए गेटिंग रणनीति। शम-उपचारित दिमाग और रीढ़ की हड्डी में न्यूनतम सीडी 45एचआई कोशिकाओं का पता लगाया गया था। (बी) टीएमईवी-आईडीडी चूहों में सीडी 45में घुसपैठ करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं (पी 1) के बीच सीडी 19 + बी कोशिकाओं और सीडी 4 + टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए रणनीति तैयार करना। गेटिंग रणनीतियाँ मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के लिए समान थीं। (सी) शाम-उपचारित (लाल) और क्रोनिक टीएमईवी-आईडीडी चूहों (नीले) के मेनिंग में सीडी 45एचआई कोशिकाओं (पी 1) की पहचान करने के लिए गेटिंग रणनीति। (घ) क्रोनिक टीएमईवी-आईडीडी चूहों के मेनिंगेस में सीडी45में घुसपैठ करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं (पी1) के बीच सीडी19+बी कोशिकाओं और सीडी4+टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए रणनीति तैयार करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: क्रोनिक टीएमईवी-आईडीडी में सीएनएस ऊतकों में सीडी 45हाय प्रतिरक्षा कोशिकाओं और सीडी 19 + बी कोशिकाओं में वृद्धि हुई। शम-उपचारित या टीएमईवी-आईडीडी मेनिंगेस, मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी से प्राप्त फ्लो साइटोमेट्री डेटा के बार ग्राफ सारांश सीडी 45 के प्रतिशतको प्रतिरक्षा कोशिकाओं (ए) या सीडी 19 + बी कोशिकाओं (बी) के प्रतिशत दिखाते हैं। TMEV-IDD ऊतकों के लिए, फ्लो साइटोमेट्री डेटा पांच चूहों से प्राप्त किया गया था, जिसमें रीढ़ की हड्डी और दिमाग को व्यक्तिगत रूप से संसाधित किया गया था, जबकि मेनिंगेस को विश्लेषण के लिए पूल किया गया था। शाम-उपचारित चूहों के लिए, फ्लो साइटोमेट्री डेटा चार चूहों से प्राप्त किया गया था, जिसमें रीढ़ की हड्डी और दिमाग को व्यक्तिगत रूप से संसाधित किया गया था, जबकि मेनिंगेस को विश्लेषण के लिए पूल किया गया था। रीढ़ की हड्डी और दिमाग के डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: डिकैल्सीफाइड दिमाग और रीढ़ की हड्डी में बरकरार मेनिंगियल परतें। (ए) खोपड़ी टोपी से निकाले गए दिमाग या (बी) क्रोनिक-टीएमईवी-आईडीडी चूहों से बरकरार खोपड़ी और कशेरुक स्तंभों के साथ डिकैल्सीफाइड दिमाग का मूल्यांकन डीएपीआई (नीला), मेनिंगियल मार्कर लैमिनिन (हरा), और ईआर-टीआर 7 (लाल) के लिए किया गया था। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: क्रोनिक टीएमईवी-आईडीडी के दौरान मेनिंगेस में प्रतिरक्षा कोशिका एकत्रीकरण स्पष्ट था। (ए) क्रोनिक-टीएमईवी-आईडीडी चूहों से डिकैल्सीफाइड वर्टेब्रल कॉलम की जांच आईजीजी (हरे) की उपस्थिति के लिए की गई ताकि पैरेन्काइमा और ईआर-टीआर 7+ मेनिंगेस (लाल) में आइसोटाइप-स्विच्ड प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान की जा सके। (बी) रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के भीतर स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए सीडी 3 + टी कोशिकाओं (हरा) और आईजीजी + आइसोटाइप-स्विच्ड बी कोशिकाओं (लाल) को ईआर-टीआर 7 + मेनिंगेस के साथ जोड़ा गया था। सफेद तीर मेनिंगेस के भीतर बी और टी कोशिकाओं को उजागर करते हैं। स्केल बार = 50 μm। सफेद बक्से क्रॉप्ड छवियों के लिए चुने गए क्षेत्रों को चित्रित करते हैं (दाएं; स्केल बार = 10 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

होमोस्टेसिस और बीमारी के दौरान सीएनएस डिब्बे में सेलुलर संरचना का मूल्यांकन करने के तरीके सीएनएस के शारीरिक और रोग संबंधी राज्यों को समझने के लिए आवश्यक हैं। हालांकि, सीएनएस में एक महत्वपूर्ण बाधा के रूप में सेवा करने और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक विविध सरणी के आवास के बावजूद, मेनिंगेस को अक्सर विश्लेषण से हटा दिया जाता है क्योंकि मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के लिए कई पारंपरिक ऊतक निष्कर्षण विधियां इन झिल्ली के संग्रह की अनुमति नहीं देती हैं। यह चूक सेलुलर संरचना और मेनिंगेस के कार्य और स्थिर अवस्था और भड़काऊ स्थितियों में इसकी भूमिका की हमारी समझ की प्रगति में एक महत्वपूर्ण सीमा है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि मेनिंगियल कम्पार्टमेंट में रहने वाले निवासी और परिधीय रूप से व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाएं दोनों सीएनएस में होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में एक आवश्यक भूमिका निभाती हैं, साथ ही सीएनएस रोग रोगजनन को चलाने में भी। ये अध्ययन न केवल पैरेन्काइमल डिब्बे बल्कि आसपास के मेनिंगियल परतों का विश्लेषण करने की आवश्यकता पर जोर देते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल मेनिंगेस को संरक्षित करते हुए मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के तेजी से अलगाव की अनुमति देते हैं, अंततः हिस्टोलॉजिकल और सिंगल-सेल अध्ययन दोनों का उपयोग करके सीएनएस डिब्बे के व्यापक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को सक्षम करते हैं। प्रतिनिधि परिणाम सीएनएस डिब्बे में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का आकलन करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं; हालांकि, प्रोटोकॉल को माइक्रोग्लिया, एस्ट्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स, पेरिसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं या अन्य सीएनएस निवासी कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

वर्णित विधियों में एक महत्वपूर्ण कदम ऊतक का सावधानीपूर्वक निष्कर्षण है, जो मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और मेनिंगेस से शुद्ध एकल-कोशिका निलंबन को अलग करने और बरकरार खोपड़ी या कशेरुक स्तंभों के साथ सीएनएस ऊतकों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, जिससे उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक आकृति विज्ञान की अनुमति मिलती है। एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए तकनीक का अभ्यास करना एक सफल ऊतक निष्कर्षण की कुंजी है क्योंकि यह न केवल नमूने की शुद्धता को बढ़ाएगा बल्कि डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए सेल पैदावार में भी सुधार करेगा। इसी तरह, हड्डी के आसपास के अतिरिक्त ऊतक को पर्याप्त रूप से हटाने के लिए बरकरार खोपड़ी या कशेरुक स्तंभों के साथ सीएनएस ऊतकों के अलगाव में अभ्यास एक आवश्यक कदम है जो ऊतक के बेहतर निर्धारण, डीकैल्सीफिकेशन और क्रायोप्रिजर्वेशन को सुनिश्चित करता है, उच्च गुणवत्ता वाले आकृति विज्ञान और बरकरार एंटीजन लक्ष्यों के साथ ऊतक वर्गों को प्राप्त करने के लिए सभी महत्वपूर्ण घटक।

मेनिंगेस से एकल-कोशिका निलंबन को अलग करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह पिया के अलगाव को छोड़ते हुए ड्यूरल और अरचनॉइड मेनिंगेस32,54 प्राप्त करने पर केंद्रित है, जो एस्ट्रोसाइट्स प्रक्रियाओं के माध्यम से मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी से जुड़ा रहता है। यद्यपि पिया मेटर में रहने वाली कोशिकाएं मेनिंगियल डिब्बे का एक आवश्यक घटक हैं, लेकिन इसे पर्याप्त रूप से अलग करने के लिए आवश्यक समय की व्यापक मात्रा के कारण एकल-सेल निलंबन तैयारी के दौरान पिया मैटर को बाहर करने का निर्णय लियागया था। इसी तरह, प्रोटोकॉल केवल क्रैनियम के बेहतर हिस्से में मेनिंगेस प्राप्त करने पर केंद्रित है और मस्तिष्क और कोरॉयड प्लेक्सस में इनवेजाइनिंग मेनिंगेस के अलगाव को शामिल नहीं करता है। इनवेजाइनिंग मेनिंगेस और कोरॉयड प्लेक्सस का संग्रह पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल55 के अनुसार आयोजित किया जा सकता है, हालांकि यह एक समय लेने वाली प्रक्रिया है। दोनों मामलों में मेनिंगियल परतों के हिस्से को छोड़ने का विकल्प उन्हें अलग करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा के कारण था। फ्लो साइटोमेट्री, सेल कल्चर परख और आरएनए अनुक्रमण (आरएनएसेक) जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक एकल-सेल निलंबन तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का समय सेल व्यवहार्यता और डेटा गुणवत्ता में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, विशिष्ट शोध प्रश्न के आधार पर, नमूना अलगाव समय और मेनिंगेस निकालने में संपूर्णता के बीच एक संतुलन बनाया जाना चाहिए। वर्तमान प्रोटोकॉल में, ड्यूरा और अरचनॉइड मेनिंगेस से केवल एकल-सेल निलंबन तैयारी प्राप्त की जाती है, जो सीएनएस मेनिंगेस की संपूर्णता में परिणामों को विस्तारित करने की क्षमता को सीमित करती है। हालांकि, यदि इन विधियों का उपयोग मेनिंगेस की तीन परतों के साथ पूरे ऊतक वर्गों के आईएचसी या आईएसएच विश्लेषण के साथ संयोजन में किया जाता है, तो पैरेन्काइमल और मेनिंगियल डिब्बों में सेलुलर और आणविक गतिशीलता की अधिक गहन समझ प्राप्त की जा सकती है।

प्रोटोकॉल की एक और सीमा विशेष रूप से होमियोस्टैटिक स्थितियों के दौरान, ड्यूरल और अरचनॉइड मेनिंगेस से प्राप्त कम सेल संख्या है। हालांकि, यदि रीढ़ की हड्डी, मस्तिष्क, या मेनिंगेस में सेल संख्या को किसी विशेष लक्ष्य सेल आबादी के विश्लेषण के लिए बहुत कम माना जाता है, तो उस विश्लेषण के लिए आवश्यक न्यूनतम सेल संख्या को किसी दिए गए परिशुद्धता (जैसे, भिन्नता के 5% गुणांक) के लिए आवश्यक घटनाओं की कुल संख्या का अनुमान लगाकर निर्धारित किया जा सकता है, जैसा कि दुर्लभघटना विश्लेषण में विशेषज्ञता वाले पिछले साहित्य में वर्णित है।. इन गणनाओं का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या कई जानवरों के नमूनों को एकत्र किया जाना चाहिए ताकि रुचि की सेल आबादी का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त सेल संख्या प्राप्त की जा सके।

वर्णित विधियां आमतौर पर उपेक्षित मेनिंगियल डिब्बे को शामिल करने के लिए विश्लेषण का विस्तार करके सीएनएस डिब्बे के भीतर सेलुलर गतिशीलता की जांच में एक आवश्यक प्रगति प्रदान करती हैं। ये प्रोटोकॉल मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी, और ड्यूरल और अरचनॉइड मेनिंगेस के व्यक्तिगत निष्कर्षण के लिए एकल-कोशिका निलंबन उत्पन्न करने की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, डिकैल्सीफिकेशन प्रोटोकॉल ऊतक वर्गों के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण की अनुमति देता है जिसमें मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के ऊतक शामिल होते हैं जिसमें तीन मेनिंगियल परतें शामिल होती हैं। ईडीटीए का उपयोग एक धीमी लेकिन सौम्य डिकैल्सीफिकेशन प्रक्रिया प्रदान करता है, जो उन नमूनों के लिए सबसे उपयुक्त है जहां उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक आकृति विज्ञान की आवश्यकता होती है (जैसे, आईएचसी और आईएसएच)। प्रोटोकॉल 7.2-7.4 के पीएच का उपयोग करता है ताकि डिकैल्सीफिकेशन की दर को धीमा किया जा सके और बरकरार ऊतक आकृति विज्ञान के रखरखाव को सुनिश्चित किया जा सके, मजबूत और कमजोर एसिड (जैसे, हाइड्रोक्लोरिक एसिड और ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड) पर एक स्पष्ट लाभ, जिसमें कम डिकैल्सीफिकेशन समय होता है, लेकिन ऊतक आकृति विज्ञान की गुणवत्ता को प्रभावित करता है।

मेनिंग्स से एकल-कोशिका निलंबन को अलग करने की मांग करने वाले भविष्य के तरीकों को सीएनएस ऊतकों से पियाल परत को पूरी तरह से अलग करने के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए। तीन मेनिंगियल परतों के पूर्ण परिसर को प्राप्त करने से न केवल किसी भी विश्लेषण के लिए सेल संख्या में वृद्धि होगी, बल्कि मेनिंगेस पर कब्जा करने वाले निवासी और घुसपैठ करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अधिक व्यापक मूल्यांकन भी प्रदान करेगा, जो सीएनएस को घेरते हैं। समवर्ती रूप से, भविष्य के प्रोटोकॉल जो डिकैल्सीफाइड दिमाग और रीढ़ की हड्डी तैयार करने पर केंद्रित हैं, उन्हें ऊतक आकृति विज्ञान की गुणवत्ता को संरक्षित करते हुए ऊतक डिकैल्सीफिकेशन में तेजी लाने के उद्देश्य से नए एजेंटों की पहचान करने की कोशिश करनी चाहिए। हालांकि, कुल मिलाकर, व्यापक ऊतक अनुभाग विश्लेषण के साथ संयोजन में किए गए दोहरे और अरचनॉइड मेनिंगेस सहित सीएनएस एकल-सेल निलंबन का विश्लेषण करने वाले डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग, सीएनएस डिब्बे के भीतर सेल फेनोटाइप, फ़ंक्शन और स्थानीयकरण की विस्तृत समझ प्रदान कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इन अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों की विशेषज्ञ देखभाल के लिए डार्टमाउथ में तुलनात्मक चिकित्सा और अनुसंधान केंद्र (सीसीएमआर) के कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं। बोर्नस्टीन रिसर्च फंड ने इस शोध को वित्त पोषित किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

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References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, Pt 10 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, Pt 9 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019).
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 159 मेनिंगेस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र डीकैल्सीफिकेशन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एकल-कोशिका निलंबन प्रतिरक्षा कोशिकाएं चूहे।
प्रतिरक्षा कोशिकाओं के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के ऊतकों और संबंधित मेनिंगेस को अलग करना
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DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, … More

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

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