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Immunology and Infection

Isolamento dei tessuti del sistema nervoso centrale e delle meningi associate per l'analisi a valle delle cellule immunitarie

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

Questo documento presenta due protocolli ottimizzati per l'esame delle cellule immunitarie residenti e di derivazione periferica all'interno del sistema nervoso centrale, tra cui il cervello, il midollo spinale e le meningi. Ognuno di questi protocolli aiuta ad accertare la funzione e la composizione delle cellule che occupano questi compartimenti in condizioni stazionarie e infiammatorie.

Abstract

Il sistema nervoso centrale (SNC) è composto dal cervello e dal midollo spinale ed è avvolto dalle meningi, strati membranosi che fungono da barriera tra la periferia e il SNC. Il sistema nervoso centrale è un sito immunologicamente specializzato e, in condizioni di stato stazionario, il privilegio immunitario è più evidente nel parenchima del sistema nervoso centrale. Al contrario, le meningi ospitano una vasta gamma di cellule residenti, comprese le cellule immunitarie innate e adattative. Durante le condizioni infiammatorie innescate da lesioni del sistema nervoso centrale, autoimmunità, infezioni o persino neurodegenerazione, le cellule immunitarie di derivazione periferica possono entrare nel parenchima e risiedere all'interno delle meningi. Si ritiene che queste cellule svolgano azioni sia benefiche che dannose durante la patogenesi della malattia del SNC. Nonostante questa conoscenza, le meningi sono spesso trascurate quando si analizza il compartimento del SNC, perché i metodi convenzionali di estrazione del tessuto del SNC omettono gli strati meningei. Questo protocollo presenta due metodi distinti per l'isolamento rapido dei tessuti murini del SNC (cioè cervello, midollo spinale e meningi) che sono adatti per l'analisi a valle tramite tecniche a singola cellula, immunoistochimica e metodi di ibridazione in situ. I metodi descritti forniscono un'analisi completa dei tessuti del SNC, ideale per valutare il fenotipo, la funzione e la localizzazione delle cellule che occupano il compartimento del SNC in condizioni omeostatiche e durante la patogenesi della malattia.

Introduction

Il sistema nervoso centrale (SNC) è una sede immunologicamente specializzata. Il parenchima del SNC, escludendo lo spazio del liquido cerebrospinale, le meningi e la vascolarizzazione, è classicamente visto come un sito immuno-privilegiato 1,2,3,4,5 ed è relativamente privo di cellule immunitarie durante le condizioni omeostatiche 2,6,7. Al contrario, le meningi, che comprendono gli strati dura, aracnoideo e pia, sono componenti cruciali del compartimento del SNC, partecipando attivamente alla sorveglianza immunitaria omeostatica e ai processi infiammatori durante la patogenesi della malattia 3,6,7,8. In condizioni di stato stazionario, le meningi supportano numerose cellule sentinella immunitarie, tra cui le cellule linfoidi innate (ILC), i macrofagi, le cellule dendritiche (DC), i mastociti, le cellule T e, in misura minore, le cellule B 9,10,11.

Le meningi sono strutture altamente vascolarizzate e contengono vasi linfatici che forniscono una connessione linfatica tra il SNC e la sua periferia 8,12,13,14. Nelle condizioni infiammatorie indotte da lesioni del sistema nervoso centrale, infezioni, autoimmunità o persino neurodegenerazione, le cellule immunitarie di derivazione periferica si infiltrano nel parenchima e alterano il paesaggio immunitario all'interno delle meningi. A seguito dell'infiltrazione cellulare, le meningi possono rappresentare una nicchia funzionale per le cellule immunitarie di derivazione periferica, promuovendo l'aggregazione delle cellule immunitarie, l'attivazione delle cellule immunitarie locali e la sopravvivenza a lungo termine nel compartimento del SNC. L'infiammazione meningea prominente si osserva in molteplici malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale, tra cui la sclerosi multipla (SM) 15,16,17,18,19, l'ictus 20,21, la lesione sterile 22,23 (cioè lesione del midollo spinale e lesione cerebrale traumatica), l'emicrania 24 e l'infezione microbica 25,26,27,28,29. Pertanto, la caratterizzazione delle cellule residenti e delle cellule immunitarie di derivazione periferica nel compartimento meningeo è essenziale per comprendere il ruolo di queste cellule durante le condizioni di stato stazionario e la patogenesi della malattia.

L'estrazione del cervello, del midollo spinale e delle meningi dal cranio e dai corpi vertebrali è tecnicamente impegnativa e richiede molto tempo. Attualmente non sono disponibili tecniche per l'estrazione rapida del cervello con tutti e tre gli strati meningei intatti. Sebbene la laminectomia produca un'eccellente morfologia del tessuto del midollo spinale e preservi gli strati meningei, è estremamente dispendiosa in termini di tempo e complicata30,31. Al contrario, i metodi di estrazione più convenzionali come la rimozione del cervello dal cranio e l'estrusione idraulica del midollo spinale facilitano la rapida estrazione del tessuto del SNC, ma sia le meningi aracnoidie che quelle durali vengono perse con queste tecniche30,31. L'omissione degli strati della dura e dell'aracnoide durante l'isolamento convenzionale dei tessuti cerebrali e del midollo spinale provoca un'analisi incompleta delle cellule all'interno del compartimento del SNC. Pertanto, l'identificazione di nuove tecniche focalizzate sull'estrazione rapida di tessuti del SNC con meningi intatte è fondamentale per l'analisi ottimale del compartimento del SNC.

Questo manoscritto presenta due metodi per l'estrazione rapida del cervello, del midollo spinale e delle meningi dai topi, facilitando l'analisi a valle delle cellule residenti e delle cellule immunitarie derivate perifericamente nel parenchima del SNC e nelle meningi. Questi protocolli ottimizzati si concentrano su 1) l'isolamento di sospensioni a singola cellula per l'analisi a valle e 2) la preparazione del tessuto per l'elaborazione istologica. L'ottenimento di sospensioni unicellulari dal cervello, dal tessuto del midollo spinale e dalle meningi durali e aracnoidee32 consente l'analisi simultanea delle cellule che risiedono sia nel compartimento parenchimale che in quello meningeo. Le sospensioni a singola cellula possono essere utilizzate in diverse applicazioni, tra cui saggi di coltura cellulare per eseguire la stimolazione in vitro 33, immunospot enzimatico (ELISpot)28,34,35, citometria a flusso36,33 e trascrittomica a singola cellula 37 o bulk. Inoltre, il protocollo ottimizzato per la decalcificazione di interi cervelli e midolli spinali con crani o colonne vertebrali intatti, rispettivamente, consente la decalcificazione delicata dell'osso circostante, lasciando intatte le meningi e preservando la morfologia dei tessuti. Questo metodo consente l'identificazione selettiva di proteine o RNA utilizzando tecniche di immunoistochimica (IHC) o ibridazione in situ (ISH) sia all'interno dello spazio parenchimale che meningeo. La caratterizzazione del fenotipo, dello stato di attivazione e della localizzazione delle cellule residenti e delle cellule immunitarie derivate perifericamente all'interno del SNC può fornire informazioni essenziali per comprendere come i singoli tipi di cellule nel compartimento del SNC contribuiscano all'omeostasi e alla patogenesi della malattia.

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Protocol

Tutto il lavoro sugli animali utilizza protocolli esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Geisel School of Medicine di Dartmouth.

1. Elaborazione di campioni di cervello e midollo spinale per la decalcificazione

  1. Isolamento di campioni di cervello e midollo spinale
    1. Eutanasia il topo tramite inalazione di CO2 . Assicurarsi che la portata di CO2 sposti il 10%-30% del volume della gabbia al minuto.
    2. Usando una pinza, solleva il processo xifoideo e taglia la parete addominale lateralmente appena sotto la gabbia toracica con le forbici, tirando verso l'alto per evitare di tagliare i vasi sanguigni o gli organi sottostanti. Tagliare lateralmente il diaframma.
    3. Tagliare la gabbia toracica lungo i bordi laterali parallelamente ai polmoni fino alla clavicola. Usando una pinza, sollevare lo sterno e bloccare lo sterno con un emostato. Posiziona l'emostatico sopra la testa per sollevare la gabbia toracica ed esporre il cuore.
    4. Usando una pinza, afferra il cuore vicino al suo apice e fai un'incisione nell'atrio destro del cuore per fornire uno sbocco. Inserire un ago da 25 G con una siringa da 10 mL attaccata per somministrare lentamente 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ghiacciata nel ventricolo sinistro per perfondere transcardicamente il topo.
      NOTA: La perfusione dovrebbe avvenire nell'arco di 4-5 minuti fino a quando il fegato non viene ripulito dal sangue. Un totale di 10 mL di PBS 1x è solitamente sufficiente per la perfusione, ma se necessario possono essere utilizzati di più. Un fegato chiaro di solito indica un'adeguata perfusione.
    5. Usando forbici affilate, rimuovere la testa mediante decapitazione (Figura 1; 1). Praticare un'incisione sulla linea mediana della pelle (Figura 1; 2) e capovolgere la pelle sugli occhi per liberare il cranio.
    6. Tagliare l'osso nasale per liberare la mandibola dal cranio (Figura 1; 3). Rimuovi la mandibola, la lingua e gli occhi. Tagliare lungo gli aspetti laterali del cranio per rilasciare il tessuto lungo il meato uditivo esterno (Figura 1; 4). Taglia per rimuovere tutta la pelle, i muscoli e i tessuti in eccesso che si sovrappongono al cranio.
    7. Separare la gabbia toracica dalla colonna vertebrale tagliando parallelamente alla colonna vertebrale con forbici affilate (Figura 1; 5 e 6). Praticare un piccolo taglio nella regione lombare inferiore per isolare la colonna vertebrale (Figura 1; 7). Tagliare e rimuovere eventuali muscoli rimanenti lungo la colonna vertebrale per esporre le vertebre (Figura 1; 8).
      NOTA: La rimozione del tessuto in eccesso dalla colonna vertebrale e dal cranio è necessaria per ottenere un'adeguata penetrazione del tampone di decalcificazione fissativa della paraformaldeide (PFA) e dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
  2. Post-fissazione, decalcificazione e crioconservazione
    1. Usando una pinza, posizionare il cervello con il cranio intatto o la colonna vertebrale in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di PFA al 4%. Posizionare i tubi a 4 °C per almeno 48 ore per un fissaggio adeguato.
      NOTA: Per evitare la fissazione eccessiva del tessuto, non superare le 72 ore di fissazione. I tempi di fissazione sono prolungati per i campioni ossei prima della decalcificazione. Un'adeguata fissazione proteggerà il tessuto dagli effetti della decalcificazione e garantirà una migliore morfologia del tessuto.
    2. Sciacquare il cervello o il midollo spinale rimuovendo il tessuto dal PFA al 4% con una pinza e posizionando il tessuto in una provetta monouso da 14 ml con 10 ml di 1x PBS per 5 minuti. Trasferire il cervello o il midollo spinale in una provetta conica da 50 mL con 10 mL di EDTA al 10% (pH = 7,2-7,4).
      NOTA: L'uso di una provetta più grande con 10 mL di EDTA conferisce all'EDTA una maggiore area di contatto con il tessuto e accelera il processo di decalcificazione.
    3. Controllare quotidianamente se l'osso è morbido e flessibile: rimuovere il tessuto dalla soluzione di EDTA con una pinza, posizionarlo su una capsula di Petri e testare delicatamente la morbidezza dell'osso con un ago da 25 G. Se l'ago penetra facilmente nell'osso, il processo di decalcificazione è completo.
    4. Rimuovere il tessuto dalla soluzione di EDTA e trasferire il cervello o il midollo spinale in una provetta monouso da 14 mL contenente 10 mL di 1x PBS e lavare per 10 minuti. Ripetere il lavaggio.
      NOTA: La decalcificazione richiede solitamente 2-3 giorni. La soluzione deve essere cambiata ogni 2-3 giorni se l'osso non è ancora adeguatamente decalcificato. Tuttavia, l'incubazione prolungata in EDTA dopo che l'osso è stato decalcificato può danneggiare la morfologia del tessuto.
    5. Preparare soluzioni di saccarosio al 10%, 20% e 30% aggiungendo saccarosio a 1x PBS. Ad esempio, per il 10% di saccarosio, aggiungere 10 g di saccarosio e portare il volume a 100 ml utilizzando 1x PBS sterile. Conservare la soluzione a 4 °C per un massimo di 1 mese.
      NOTA: Le soluzioni di saccarosio sono soggette alla crescita di microrganismi, quindi i campioni non devono essere conservati per periodi di tempo prolungati in queste soluzioni.
    6. Rimuovere il tessuto dal PBS 1x, metterlo in 10 mL di soluzione di saccarosio al 10% e conservarlo a 4 °C. Lasciare riposare il tessuto per 24 ore o fino a quando non affonda sul fondo del tubo.
    7. Ripeti questo processo, spostando il tessuto prima in una soluzione di saccarosio al 20% e infine in una soluzione di saccarosio al 30%. Lasciare che il tessuto affondi nel saccarosio al 30% (almeno 24 ore) e procedere all'inclusione del tessuto.
  3. Inclusione e congelamento dei tessuti
    1. Usando una pinza, rimuovere il tessuto dal saccarosio al 30%, posizionarlo su una piastra di Petri e inclinare il piatto per eliminare la soluzione di saccarosio in eccesso sul tessuto. Usando un bisturi, tagliare il tessuto nei segmenti desiderati.
    2. Creare uno strato sottile di composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) sul fondo del crioma e posizionare i pezzi di tessuto nello stampo. Coprire completamente il tessuto con il composto OCT, assicurandosi che non siano presenti bolle.
    3. Congelare i blocchi passando il mouse sopra l'azoto liquido38 o impostando i blocchi su un impasto isopropanolo/ghiaccio secco al 100%39 fino a quando il blocco non è opaco. Avvolgere i criostampi in un foglio di alluminio e conservare i blocchi a -80 °C per la conservazione a lungo termine. Spostare i blocchi a -20 °C prima del sezionamento.
      NOTA: È necessario prestare attenzione durante il sezionamento e l'esecuzione di protocolli istologici su cervelli decalcificati poiché gli strati del cranio e della meningea possono essere persi se le sezioni vengono maneggiate in modo approssimativo.

2. Preparazione delle meningi e dei tessuti del SNC per la colorazione con citometria a flusso

  1. Estrazione della calotta cranica e del cervello
    1. Usando forbici affilate, rimuovere la testa mediante decapitazione (Figura 2A; 1). Usando le forbici, praticare un'incisione sulla linea mediana della pelle (Figura 2A; 2) e capovolgere la pelle sopra gli occhi per liberare il cranio.
    2. Posiziona le forbici all'interno del forame magna e inizia a tagliare il cranio lateralmente lungo le cortecce verso il bulbo olfattivo, mantenendo le incisioni sopra il meato uditivo esterno e la mandibola (Figura 2A; 3). Eseguire gli stessi tagli sul lato opposto, con i tagli che si incontrano al bulbo olfattivo per liberare la calotta cranica dal cervello (Figura 2A; 3).
    3. Usando una pinza, staccare la calotta cranica e posizionare la calotta cranica in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di terreno RPMI freddo integrato con 25 mM di HEPES. Tenere il tubo sul ghiaccio.
    4. Usando una pinza curva, posiziona la pinza sotto la base del cervello e sollevala per liberare il cervello dalla calotta cranica. Mettere il cervello in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di RPMI freddo integrato con 25 mM di HEPES. Tenere il tubo sul ghiaccio fino alla lavorazione.
  2. Estrazione della colonna vertebrale e del tessuto del midollo spinale
    1. Usando una pinza e delle forbici affilate, separare la gabbia toracica dalla colonna vertebrale tagliando parallelamente alla colonna vertebrale (Figura 2A; 4 e 5). Praticare un piccolo taglio nella regione lombare inferiore per isolare la colonna vertebrale (Figura 2A; 6). Tagliare e rimuovere eventuali muscoli rimanenti lungo la colonna vertebrale per esporre le vertebre (Figura 2A; 7).
    2. Posizionare le forbici chirurgiche extra fini all'interno della colonna vertebrale e tagliare lungo il bordo laterale della colonna (Figura 2C). Tagliare completamente il bordo laterale opposto per dividere la colonna vertebrale in una porzione anteriore e posteriore.
      NOTA: Il midollo spinale rimarrà attaccato alla colonna vertebrale.
    3. Usando una pinza, staccare lentamente e con attenzione il midollo spinale dalla colonna vertebrale e posizionare il tessuto in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di RPMI freddo con 25 mM di HEPES. Trasferire le porzioni anteriore e posteriore della colonna vertebrale in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di RPMI freddo con HEPES da 25 mM.
  3. Rimozione delle meningi per preparare sospensioni monocellulari
    1. Usando una pinza, rimuovere la calotta cranica dal supporto RPMI. Utilizzo di pinze affilate (#7 pinze; Tabella dei materiali), incidendo intorno al bordo esterno della calotta cranica (Figura 2B) e staccando le meningi dal bordo della calotta cranica, raschiando per rimuovere le meningi durali e aracnoidee. Disporre le meningi su una capsula di Petri.
      NOTA: La rimozione delle meningi sia dal cervello che dal midollo spinale richiede pratica. Se l'utente ha difficoltà a estrarre le meningi, utilizzare un microscopio da dissezione per facilitare la rimozione.
    2. Rimuovere la colonna vertebrale dal tubo. Usando una pinza affilata, incidi intorno ai bordi della colonna vertebrale per liberare le meningi e stacca le meningi dal bordo della vertebra usando una pinza curva. Disporre le meningi su una capsula di Petri.
    3. Mettere un colino a rete di nylon in una provetta conica da 50 ml. Spostare le meningi nel colino e aggiungere 3 mL di RPMI integrato con 25 mM di HEPES. Utilizzando lo stantuffo di una siringa da 5 ml, macinare il tessuto e il terreno attraverso il colino.
    4. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL, lavare il filtro con altri 2 o 3 mL di terreno RPMI/HEPES fino a quando tutto il tessuto visibile non è passato attraverso il filtro.
      NOTA: Per ottenere un numero di cellule adeguato per l'analisi citofluorimetrica, potrebbe essere necessario raggruppare le meningi di più animali. In questo esperimento (Figura 3 e Figura 4), le meningi cerebrali e del midollo spinale di 4-5 topi sono state raggruppate insieme. Se i campioni vengono raggruppati, saranno necessari terreni aggiuntivi per macinare il tessuto attraverso il filtro a rete di nylon per evitare il surriscaldamento del tessuto.
    5. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, trasferire le cellule e il terreno in una nuova provetta conica da 15 mL. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, lavare la provetta conica da 50 mL con 5 mL di terreno per raccogliere le cellule rimanenti. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le cellule.
    6. Utilizzando una pipetta Pasteur con vuoto, aspirare il surnatante facendo attenzione ad evitare il pellet cellulare e risospendere le cellule in un volume e tampone appropriati.
    7. Per contare la sospensione unicellulare, diluire un piccolo volume di cellule (cioè 5-10 μL) utilizzando un colorante di esclusione del blu di tripano (diluizione 1:10) e RPMI. Aggiungere 10 μL di diluizione all'emocitometro.
    8. Conta le celle come descritto in precedenza40,41, facendo una media di almeno due griglie quadrate da 16 per la precisione.
      NOTA: Nella Figura 3, ad esempio, le cellule in pool e pellettate delle meningi sono state risospese in 250 μL di tampone FACS (Fluorescence-activated Cell Sorting) (1x PBS con 1% FBS) per la colorazione superficiale a valle. Le cellule sono state diluite 1:10 per il conteggio (5 μL di cellule, 5 μL di blu di tripano, 40 μL di RPMI). Questa diluizione ha prodotto tra 50 e 100 cellule per 16 griglie quadrate, garantendo un conteggio più accurato delle cellule perché le cellule non sono né troppo dense e sovrapposte né troppo sparse. La conta delle cellule nucleate delle meningi del cervello e del midollo spinale raggruppate per topo era la seguente: per le meningi di topi sottoposti a trattamento fittizio = 100.000-150.000 cellule e per le meningi di topi della malattia demielinizzante indotta dal virus dell'encefalomielite murina di Theiler (TMEV-IDD) = 300.000-350.000 cellule. La conta cellulare varia a seconda della precisione della raccolta, dell'elaborazione e della presenza di infiammazione meningea.
    9. Procedere alla tecnica a singola cellula desiderata come una superficie FACS (Figura 3)14,36,42,43,44, protocolli di colorazione intracellulare 33,45, stimolazione in vitro, saggi di coltura cellulare 33,46,47, saggio ELISPOT 28,34,35 e test bulk o a singola cellula Trascrittomica37,48.
      NOTA: Tenere tutte le provette sul ghiaccio tra una fase di lavorazione e l'altra.
  4. Preparazione di sospensioni unicellulari di tessuto cerebrale e del midollo spinale
    1. Trasferire il tessuto cerebrale o del midollo spinale con il terreno nella parte superiore della piastra di Petri da 100 mm versando il tessuto e il terreno dalla provetta. Usando una pinza, sposta il tessuto sul fondo della capsula di Petri. Tritare finemente il cervello o il midollo spinale con una lametta sterile. Usando la lama del rasoio, sposta il tessuto tritato sul fondo della piastra raschiando per raccogliere il tessuto.
      NOTA: Per il protocollo di digestione enzimatica riportato di seguito, è possibile raggruppare fino a due midolli spinali per l'elaborazione. I cervelli dovrebbero essere elaborati individualmente.
    2. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL, aggiungere 3 mL di RPMI integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) alla capsula di Petri. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, pipettare su e giù per risospendere il tessuto nel terreno e trasferirlo in una provetta conica da 15 mL.
      NOTA: Se l'applicazione a valle è l'analisi di sequenziamento di RNA a singola cellula o di massa o la coltura cellulare, i lotti FCS devono essere testati per garantire che le cellule non vengano attivate prima dell'analisi. In alternativa, le celle possono essere processate utilizzando 1x PBS con 0,04% di BSA invece di RPMI con 10% di FCS.
    3. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, lavare la capsula di Petri con altri 2 mL di terreno per raccogliere eventuali residui di tessuto e trasferirla in una provetta conica per un volume totale di 5 mL. Tenere i tubi su ghiaccio tra una fase di lavorazione e l'altra.
    4. Utilizzando una pipetta, sospendere nuovamente la polvere di collagenasi I nel terreno di coltura Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) per ottenere la concentrazione desiderata (cioè 100 mg/mL). Aggiungere la collagenasi di tipo I alla provetta conica contenente il campione di tessuto tritato per ottenere la concentrazione finale desiderata (cioè 50 μL per 1 mg/mL).
      NOTA: Concentrazioni più elevate di collagenasi aumentano la resa cellulare, ma possono scindere i marcatori della superficie cellulare. Pertanto, i lotti di collagenasi I devono essere titolati per determinare la concentrazione ottimale necessaria per ottenere il maggior numero di cellule vitali con tutti i marcatori di superficie cellulare richiesti intatti. Ad esempio, la collagenasi I è stata testata a concentrazioni finali di 0,5 mg/mL, 1 mg/mL e 2 mg/mL su singoli campioni di cervello o midollo spinale. La vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano e i marcatori di superficie cellulare CD45, CD19 e CD4 sono stati valutati mediante citometria a flusso. Una concentrazione di 1 mg/mL di collagenasi I ha prodotto il più alto numero di cellule vive, pur mantenendo tutti i marcatori di interesse sulla superficie cellulare. Pertanto, questa concentrazione è stata utilizzata per ulteriori esperimenti che esaminano questi tipi di cellule.
    5. Risospendere delicatamente la polvere di DNasi I utilizzando cloruro di sodio 0,15 M fino alla concentrazione madre desiderata. Aggiungere la DNasi I risospesa alla provetta conica contenente il campione di tessuto tritato per ottenere una concentrazione finale di 20 U/mL.
      NOTA: I lotti DNasi I variano in base alle unità di attività per mL. La concentrazione da aggiungere al campione di tessuto cambierà in base alle unità di attività del flaconcino per millilitro. La concentrazione finale desiderata per campione è di 20 U/mL.
    6. Mettere le provette in un rack per provette a bagnomaria a 37 °C e incubare per 40 minuti. Capovolgere le provette ogni 15 minuti per mescolare accuratamente il tessuto con gli enzimi. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 μL di EDTA 0,1 M (pH = 7,2) in ciascuna provetta per una concentrazione finale di EDTA 0,01 M e incubare per altri 5 minuti per inattivare la collagenasi.
    7. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere 9 mL di RPMI integrato con FCS al 10% a ciascuna provetta per portare il volume di ciascuna provetta a ~14,5 mL. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Utilizzando una pipetta Pasteur con vuoto, aspirare il surnatante facendo attenzione a non toccare il pellet cellulare.
    8. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL, aggiungere 3 mL di soluzione a gradiente di densità isotonica al 100% alla provetta contenente il pellet cellulare. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere ulteriore terreno RPMI 10% FCS per portare il volume finale a 10 mL e risospendere il pellet cellulare per creare uno strato di soluzione di gradiente di densità isotonica al 30%.
      NOTA: Preparare in anticipo il terreno di gradiente di densità isotonica al 100%, aliquotarlo e conservarlo a 4 °C per un massimo di 3 mesi. Per preparare la soluzione di gradiente di densità isotonica al 100%, diluire il terreno di densità (Tabella dei materiali) con un tampone di diluizione del terreno di densità gradiente di densità. Preparare il tampone di diluizione del terreno a gradiente di densità (80,0 g/L NaCl, 3,0 g/L KCl; 0,73 g/L Na 2 HP04, 0,20 g/L KH2HP04; 20,0 g/L glucosio) e sterilizzare con filtro utilizzando un sistema di filtraggio sottovuoto. Preparare la soluzione di gradiente di densità isotonica al 100% mescolando 1 parte di tampone di diluizione del gradiente di densità e 9 parti di terreno di sodio a gradiente di densità. Mescolare bene.
    9. Capovolgere e mescolare bene ogni provetta prima di aggiungere il sottofondo della soluzione di gradiente di densità isotonica al 70%. Inserire una pipetta sierologica da 1 mL contenente 1 mL di soluzione monotonica al 70% di gradiente di densità isotonica sul fondo della provetta. Sottoporre lentamente 1 mL di soluzione, facendo attenzione a non formare bolle. Rimuovere lentamente la pipetta sierologica dalla provetta, facendo attenzione a non disturbare il gradiente.
      NOTA: Per il sottofondo al 70%, la soluzione di gradiente di densità isotonica al 100% deve essere diluita al 70% utilizzando terreni RPMI (ad esempio, 7 mL di soluzione di gradiente di densità isotonica al 100% e 3 mL di terreno RPMI mescolati bene). Inoltre, la creazione di un sottofondo pulito e indisturbato al 70% è essenziale per la rimozione dei detriti di mielina e per ottenere sospensioni monocellulari pure all'interfaccia del gradiente dopo la centrifugazione.
    10. Centrifugare a 800 x g per 30 minuti a 4 °C senza freno. Aspirare il surnatante, compreso lo strato di detriti di mielina, fino a quando non rimangono 2-3 mL nella provetta, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare. Prelevare lo strato cellulare tra il gradiente di densità del 30/70% utilizzando una pipetta da 1 mL e trasferirlo in una nuova provetta conica da 15 mL.
    11. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere il terreno RPMI 10% FCS per portare il volume finale a 15 mL. Centrifugare 450 x g per 5 minuti a 4 °C.
      NOTA: Durante questa fase, gli strati cellulari di due provette possono essere raggruppati, se necessario. Non raggruppare più di due provette o le celle non si pelletteranno a causa di una concentrazione di terreno a gradiente ad alta densità.
    12. Aspirare il surnatante con attenzione per non disturbare il pellet cellulare. Risospendere le cellule in un volume/tampone appropriato per contare le cellule utilizzando un emocitometro (ad esempio, risospendere un singolo midollo spinale in 250 μL di tampone FACS per la colorazione superficiale a valle) (Figura 3).
    13. Utilizzando una pipetta da 1 ml, trasferire le sospensioni cellulari nella parte superiore di un tubo superiore del filtro (Tabella dei materiali) e lasciare che le cellule filtrino sul fondo della provetta per rimuovere eventuali residui di mielina.
    14. Usando il colorante di esclusione del blu di tripano, diluire e contare le cellule su un emocitometro facendo una media di almeno due griglie quadrate da 16 per una precisionedi 40,41.
    15. Procedere con la tecnica di analisi a singola cellula desiderata.
      NOTA: Utilizzando varie forme di collagenasi (ad esempio, D, tipo I, tipo II, tipo IV), le cellule immunitarie, la microglia (Figura 3), gli astrociti, i periciti, le cellule endoteliali49 e i neuroni50 possono essere isolati in modo efficiente. La conta delle cellule nucleate ottenuta per i risultati è stata la seguente utilizzando l'enzima collagenasi I titolata: cervello intero trattato con sham = 500.000-600.000 cellule; Cervello intero TMEV-IDD = 800.000–1.000.000 di cellule; Intero midollo spinale trattato con sham = 150.000-200.000 cellule; Intero midollo spinale TMEV-IDD = 300.000–400.000. La conta cellulare varia a seconda della precisione della raccolta, dell'elaborazione e della presenza di infiammazione del sistema nervoso centrale.

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Representative Results

Questo esperimento rappresentativo aveva lo scopo di quantificare le cellule B e T e descrivere la localizzazione delle cellule B e T nei compartimenti meningeo e parenchimale del SNC in condizioni omeostatiche e in un modello murino di SM progressiva (i.e., TMEV-IDD). TMEV-IDD è stato indotto in topi SJL femmine di 5 settimane da infezione intracranica con 5 x 106 unità formanti placca (PFU) di TMEV BeAn come descrittoin precedenza 29.

Il presente studio ha valutato le cellule B e T nelle meningi, nel cervello e nel midollo spinale durante la TMEV-IDD cronica al giorno 120 dopo l'infezione. Come controlli sono stati utilizzati topi trattati con sham di pari età. Lo studio è stato composto da due esperimenti. Il primo si è concentrato sull'ottenimento di sospensioni a singola cellula per la valutazione citofluorimetrica, una tecnica consolidata per analizzare e quantificare la composizione cellulare valutando la superficie cellulare e/o gli antigeni intracellulari (n = 4 trattati in modo fittizio; n = 5 TMEV-IDD). Il secondo esperimento si è concentrato sulla descrizione della localizzazione delle cellule B e T nel compartimento del SNC utilizzando l'immunoistochimica su tessuti cerebrali e del midollo spinale decalcificati (n = 3 trattati con sham; n = 8 TMEV-IDD).

A seguito dell'isolamento di sospensioni a singola cellula dal cervello, dal midollo spinale e dalle meningi raggruppate (cervello e midollo spinale) da topi trattati con TMEV-IDD e sham, è stato applicato un protocollo di colorazione superficiale a tutti i campioni. In breve, le sospensioni a singola cellula sono state incubate con un colorante di esclusione della vitalità fissabile (780) per 15 minuti, lavate, bloccate con blocco Fc in presenza di siero di topo per 15 minuti e colorate con anticorpi coniugati per marcatori di superficie cellulare, tra cui CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3; PE-CF594) e CD4 (GK1.5; PE) per 30 minuti come descritto in precedenza28,29. Le cellule sono state quindi lavate e analizzate utilizzando un citometro a flusso28,29. Il viability gating è stato condotto come descritto in precedenza28. L'espressione di CD45 è stata valutata per distinguere le cellule immunitarie infiltranti CD45 hi derivate perifericamente (P1) dalla microglia CD45(P2) e dai neuroni, astrociti e oligodendrocitiCD45- nel cervello e nel midollo spinale (P3; Figura 3A). Nei topi trattati con sham, poche cellulehi CD45 erano presenti nel midollo spinale e nel tessuto cerebrale. Nelle meningi, lo stesso cut-off di gating per l'espressione di CD45 hi utilizzato per i dati del cervello e del midollo spinale è stato applicato per identificare le cellule immunitariedi CD45hi (P1; Figura 3C) ed escludere le cellule non immunitarie presenti nelle meningi (cioè fibroblasti, cellule endoteliali). Nei topi trattati con sham, poche cellulehi CD45 (<0,1%) erano presenti nelle meningi. Tra le cellule immunitariehi CD45 nei tessuti del SNC TMEV-IDD, le cellule B e le cellule T CD4 sono state identificate rispettivamente dall'espressione superficiale di CD19 e CD4 (Figura 3B-D). In tutti i tessuti del sistema nervoso centrale TMEV-IDD, sono state osservate percentuali aumentate di cellule immunitariehi CD45 rispetto ai topi trattati con sham (Figura 4A). Durante la TMEV-IDD cronica, la percentuale di cellule B tra le celluleimmunitarie hi CD45 nel cervello e nel midollo spinale era più alta rispetto al compartimento meningeo (Figura 4B).

Per identificare la localizzazione delle cellule B e delle cellule T all'interno del compartimento del SNC durante la TMEV-IDD cronica, i cervelli e il midollo spinale decalcificati sono stati valutati utilizzando l'immunoistochimica utilizzando il protocollo di colorazione precedentemente descritto29. Le meningi e la vascolarizzazione sono state delimitate utilizzando laminina, un componente della membrana basale29,51 e ER-TR7, un marcatore cellulare reticolare dei fibroblasti52,53. Durante l'estrazione convenzionale del cervello dalla calotta cranica, lo strato pia era intatto, ma gli strati meningei rimanenti erano esclusi (Figura 5A). Nel midollo spinale, l'estrusione idraulica ha comportato l'assenza di tutti gli strati meningei (dati non mostrati). Sia nel cervello decalcificato che nel midollo spinale, tutti gli strati meningei erano intatti (Figura 5B). Per esaminare la localizzazione delle cellule B e T nella TMEV-IDD cronica, l'espressione delle IgG è stata utilizzata per determinare la localizzazione delle cellule B commutate dall'isotipo 29 e la CD3 è stata utilizzata per visualizzare tutte le cellule T29. La costinizzazione delle IgG con ER-TR7 ha rivelato che le cellule B IgG+ commutate dall'isotipo erano presenti nel parenchima del SNC e nelle meningi (Figura 6A). Gli aggregati cellulari all'interno delle meningi ER-TR7+ contenevano più cellule B IgG+ e cellule T CD3+ (Figura 6B).

I risultati rappresentativi mostrano alte percentuali di cellule B e cellule T nei compartimenti parenchimale e meningeo nei topi TMEV-IDD cronici in contrasto con i topi trattati con sham di pari età. L'analisi IHC ha inoltre dimostrato che nel tessuto TMEV-IDD, le cellule B e le cellule T erano disperse nel parenchima, ma erano strettamente associate nelle meningi, formando aggregati infiammatori. Nei pazienti con SM progressiva, gli aggregati infiammatori meningei sono associati a lesioni tissutali adiacenti e a esiti peggiori della malattia. Nella TMEV-IDD cronica, la presenza persistente di cellule B e T nel compartimento del SNC e l'aggregazione nelle meningi possono essere associate a lesioni tissutali e progressione della malattia. Sono necessari ulteriori studi per comprendere come l'infiammazione meningea rispetto a quella parenchimale influenzi la demielinizzazione, la neurodegenerazione e la disabilità clinica.

Figure 1
Figura 1: Isolare il cervello e il midollo spinale per la decalcificazione. Le linee tratteggiate blu indicano i tagli effettuati per isolare il cervello con il cranio intatto (tagli 1-4) e la colonna vertebrale (tagli 5-8). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Isolamento di cervelli, midollo spinale e meningi per tecniche a singola cellula. (A) Le linee tratteggiate blu indicano i tagli effettuati per isolare la calotta cranica con meningi intatte e cervello (tagli 1-3) e colonna vertebrale (tagli 5-7). Il taglio laterale 3 viene eseguito su entrambi i lati del cranio. (B) La linea blu indica l'incisione praticata per incidere e rimuovere le meningi nella calotta cranica e i tagli praticati alla colonna vertebrale (entrambi i lati laterali) per isolare il midollo spinale e le meningi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Identificazione delle cellule immunitarie infiltranti CD45hi nei tessuti del SNC. (A) Strategia di gating per l'identificazione di cellule immunitarie infiltranti CD45hi (P1), microglia CD45 (P2) e oligodendrociti, astrociti e neuroni CD45- tra cellule vive totali nel midollo spinale di topi trattati con sham (rosso) o TMEV-IDD (blu). Cellulehi CD45 minime sono state rilevate in cervelli e midollo spinale trattati con sham. (B) Strategia di gating per l'identificazione delle cellule B CD19+ e delle cellule T CD4+ tra le cellule immunitarie infiltrantiCD45 hi (P1) in topi TMEV-IDD. Le strategie di gating erano simili per il cervello e il tessuto del midollo spinale. (C) Strategia di gating per l'identificazione delle cellulehi CD45 (P1) nelle meningi di topi trattati con sham (rosso) e TMEV-IDD cronici (blu). (D) Strategia di gating per l'identificazione delle cellule B CD19+ e delle cellule T CD4+ tra le cellule immunitarie infiltranti CD45hi (P1) nelle meningi di topi TMEV-IDD cronici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Le celluleimmunitarie hi CD45 e le cellule B CD19+ sono aumentate nei tessuti del SNC nella TMEV-IDD cronica. I riassunti dei grafici a barre dei dati di citometria a flusso ottenuti da meningi trattate con sham o TMEV-IDD, cervello e midollo spinale mostrano percentuali di cellule immunitarieinfiltranti CD45 hi (A) o percentuali di cellule B CD19+ (B). Per i tessuti TMEV-IDD, i dati della citometria a flusso sono stati ottenuti da cinque topi, con il midollo spinale e il cervello elaborati individualmente, mentre le meningi sono state raggruppate per l'analisi. Per i topi trattati con sham, i dati della citometria a flusso sono stati ottenuti da quattro topi, con il midollo spinale e il cervello elaborati individualmente, mentre le meningi sono state raggruppate per l'analisi. I dati relativi al midollo spinale e al cervello sono indicati come media ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Strati meningei intatti in cervelli decalcificati e midollo spinale. (A) Cervelli estratti dalla calotta cranica o (B) cervelli decalcificati con crani e colonne vertebrali intatti di topi cronici-TMEV-IDD sono stati valutati per DAPI (blu), marcatori meningei laminina (verde) e ER-TR7 (rosso). Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: L'aggregazione di cellule immunitarie era evidente nelle meningi durante la TMEV-IDD cronica. (A) Le colonne vertebrali decalcificate di topi cronici-TMEV-IDD sono state esaminate per la presenza di IgG (verde) per identificare le cellule immunitarie commutate dall'isotipo nel parenchima e nelle meningi ER-TR7+ (rosso). (B) Le cellule T CD3+ (verde) e le cellule B commutate con isotipo IgG+ (rosso) sono state sottoposte a costinizzazione con meningi ER-TR7+ per valutare la localizzazione all'interno del tessuto del midollo spinale. Le frecce bianche evidenziano le cellule B e T all'interno delle meningi. Barra graduata = 50 μm. I riquadri bianchi delineano le aree selezionate per le immagini ritagliate (a destra; barra della scala = 10 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I metodi per valutare la composizione cellulare nel compartimento del SNC durante l'omeostasi e la malattia sono essenziali per comprendere gli stati fisiologici e patologici del SNC. Tuttavia, nonostante fungano da importante barriera nel sistema nervoso centrale e ospitino una vasta gamma di cellule immunitarie, le meningi sono spesso omesse dall'analisi perché molti metodi convenzionali di estrazione dei tessuti per il cervello e il midollo spinale non consentono la raccolta di queste membrane. Questa omissione è una limitazione critica nel progresso della nostra comprensione della composizione cellulare e della funzione delle meningi e del suo ruolo nello stato stazionario e nelle condizioni infiammatorie. Studi recenti hanno rivelato che sia le cellule immunitarie residenti che quelle di derivazione periferica che risiedono nel compartimento meningeo svolgono un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi nel SNC, nonché nel guidare la patogenesi della malattia del SNC. Questi studi sottolineano la necessità di analizzare non solo il compartimento parenchimale ma anche gli strati meningei circostanti. I protocolli qui descritti consentono di isolare rapidamente il cervello e il midollo spinale preservando le meningi, consentendo in ultima analisi un'analisi completa a valle del compartimento del SNC utilizzando sia studi istologici che a singola cellula. I risultati rappresentativi si concentrano sulla valutazione delle cellule immunitarie nel compartimento del SNC; tuttavia, i protocolli possono essere adattati per analizzare microglia, astrociti, neuroni, periciti, cellule endoteliali o altre cellule residenti nel SNC.

Un passaggio fondamentale nei metodi descritti è l'attenta estrazione del tessuto, essenziale sia per isolare le sospensioni monocellulari pure dal cervello, dal midollo spinale e dalle meningi sia per ottenere tessuti del SNC con crani o colonne vertebrali intatti, consentendo una morfologia tissutale di alta qualità. Praticare la tecnica per ottenere sospensioni a singola cellula è la chiave per un'estrazione di tessuto di successo perché non solo migliorerà la purezza del campione, ma migliorerà anche la resa cellulare per le applicazioni a valle. Allo stesso modo, la pratica nell'isolamento dei tessuti del SNC con crani o colonne vertebrali intatti per rimuovere adeguatamente il tessuto in eccesso che circonda l'osso è un passo essenziale che garantisce una migliore fissazione, decalcificazione e crioconservazione del tessuto, tutti componenti cruciali per ottenere sezioni di tessuto con morfologia di alta qualità e bersagli antigenici intatti.

Una limitazione del nostro protocollo per l'isolamento delle sospensioni unicellulari dalle meningi è che si concentra sull'ottenimento delle meningi durali e aracnoidee32,54 omettendo l'isolamento della pia, che rimane attaccata al cervello o al midollo spinale attraverso i processi astrocitari. Sebbene le cellule che risiedono nella pia madre siano una componente essenziale del compartimento meningeo, si è deciso di escludere la pia madre durante la preparazione della sospensione unicellulare a causa dell'ampio lasso di tempo necessario per isolarla adeguatamente55. Allo stesso modo, il protocollo si concentra solo sull'ottenimento di meningi nella porzione superiore del cranio ed esclude l'isolamento delle meningi invaginanti nel cervello e nel plesso coroideo. La raccolta delle meningi invaginanti e del plesso coroideo può essere condotta secondo i protocolli precedentemente pubblicati55, sebbene sia una procedura che richiede tempo. In entrambi i casi la scelta di omettere parte degli strati meningei è dovuta alla quantità di tempo necessaria per isolarli. La tempistica del protocollo utilizzato per preparare le sospensioni a singola cellula necessarie per le applicazioni a valle come la citometria a flusso, i saggi di coltura cellulare e il sequenziamento dell'RNA (RNAseq) è fondamentale per migliorare la vitalità cellulare e la qualità dei dati. Pertanto, a seconda della specifica domanda di ricerca, è necessario trovare un equilibrio tra il tempo di isolamento del campione e l'accuratezza nell'estrazione delle meningi. Nell'attuale protocollo, si ottengono solo preparati in sospensione a singola cellula dalle meningi della dura e dell'aracnoide, il che limita la capacità di estrapolare i risultati alla totalità delle meningi del SNC. Tuttavia, se questi metodi vengono utilizzati in combinazione con l'analisi IHC o ISH di intere sezioni di tessuto con i tre strati di meningi, è possibile ottenere una comprensione più approfondita delle dinamiche cellulari e molecolari nei compartimenti parenchimali e meningei.

Un'altra limitazione del protocollo è il basso numero di cellule ottenuto dalle meningi durali e aracnoidee, soprattutto in condizioni omeostatiche. Tuttavia, se il numero di cellule nel midollo spinale, nel cervello o nelle meningi è ritenuto troppo basso per l'analisi di una particolare popolazione di cellule bersaglio, il numero minimo di cellule richiesto per tale analisi può essere determinato stimando il numero totale di eventi richiesti per una data precisione (ad esempio, un coefficiente di variazione del 5%) come descritto nella letteratura precedente specializzata nell'analisi di eventi rari56. Questi calcoli possono quindi essere utilizzati per determinare se i campioni di più animali devono essere raggruppati per acquisire un numero di cellule sufficiente per analizzare la popolazione cellulare di interesse.

I metodi descritti forniscono un progresso essenziale nello studio della dinamica cellulare all'interno del compartimento del SNC, estendendo le analisi per includere il compartimento meningeo comunemente trascurato. Questi protocolli consentono l'estrazione individuale del cervello, del midollo spinale e delle meningi durali e aracnoidee per generare sospensioni unicellulari. Inoltre, il protocollo di decalcificazione consente l'analisi istologica di sezioni di tessuto comprendenti il tessuto cerebrale o del midollo spinale compresi i tre strati meningei. L'utilizzo dell'EDTA fornisce un processo di decalcificazione lento ma delicato, che è più appropriato per i campioni in cui è richiesta una morfologia tissutale di alta qualità (ad esempio, IHC e ISH). Il protocollo utilizza un pH di 7,2-7,4 per rallentare il tasso di decalcificazione e garantire il mantenimento della morfologia del tessuto intatto, un chiaro vantaggio rispetto agli acidi forti e deboli (ad esempio, acido cloridrico e acido tricloroacetico), che hanno un tempo di decalcificazione più breve, ma influiscono sulla qualità della morfologia del tessuto.

I metodi futuri che cercano di isolare le sospensioni unicellulari dalle meningi dovrebbero concentrarsi sullo sviluppo di protocolli per ridurre il tempo necessario per isolare completamente lo strato piale dai tessuti del SNC e dalle meningi invaginanti nel cervello. Ottenere il complesso completo dei tre strati meningei non solo aumenterà il numero di cellule per qualsiasi analisi, ma fornirà anche una valutazione più completa delle cellule immunitarie residenti e infiltranti che occupano le meningi, che racchiudono il SNC. Allo stesso tempo, i futuri protocolli incentrati sulla preparazione di cervelli e midollo spinale decalcificati dovrebbero cercare di identificare nuovi agenti volti ad accelerare la decalcificazione dei tessuti, preservando al contempo la qualità della morfologia dei tessuti. Tuttavia, nel complesso, le applicazioni a valle che analizzano le sospensioni a singola cellula del SNC, comprese le meningi doppie e aracnoidee, eseguite in combinazione con l'analisi completa della sezione tissutale, possono fornire una comprensione dettagliata del fenotipo, della funzione e della localizzazione delle cellule all'interno del compartimento del SNC.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il personale del Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) di Dartmouth per la loro cura esperta dei topi utilizzati per questi studi. Il Bornstein Research Fund ha finanziato questa ricerca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

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Immunologia e infezione Numero 159 meningi sistema nervoso centrale decalcificazione immunoistochimica sospensione unicellulare cellule immunitarie topi
Isolamento dei tessuti del sistema nervoso centrale e delle meningi associate per l'analisi a valle delle cellule immunitarie
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DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, … More

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

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