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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Isolement des tissus du système nerveux central et des méninges associées pour l’analyse en aval des cellules immunitaires

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

Cet article présente deux protocoles optimisés pour l’examen des cellules immunitaires résidentes et dérivées périphériques du système nerveux central, y compris le cerveau, la moelle épinière et les méninges. Chacun de ces protocoles permet de déterminer la fonction et la composition des cellules occupant ces compartiments dans des conditions d’équilibre et inflammatoires.

Abstract

Le système nerveux central (SNC) est composé du cerveau et de la moelle épinière et est enveloppé par les méninges, couches membraneuses servant de barrière entre la périphérie et le SNC. Le SNC est un site immunologiquement spécialisé, et dans des conditions d’état d’équilibre, le privilège immunitaire est le plus évident dans le parenchyme du SNC. En revanche, les méninges abritent un large éventail de cellules résidentes, y compris des cellules immunitaires innées et adaptatives. Au cours d’affections inflammatoires déclenchées par une lésion du SNC, une auto-immunité, une infection ou même une neurodégénérescence, des cellules immunitaires d’origine périphérique peuvent pénétrer dans le parenchyme et s’installer dans les méninges. On pense que ces cellules effectuent des actions à la fois bénéfiques et préjudiciables pendant la pathogenèse de la maladie du SNC. Malgré ces connaissances, les méninges sont souvent négligées lors de l’analyse du compartiment du SNC, car les méthodes conventionnelles d’extraction des tissus du SNC omettent les couches méningées. Ce protocole présente deux méthodes distinctes pour l’isolement rapide des tissus murins du SNC (c’est-à-dire le cerveau, la moelle épinière et les méninges) qui conviennent à l’analyse en aval via des techniques unicellulaires, l’immunohistochimie et les méthodes d’hybridation in situ. Les méthodes décrites fournissent une analyse complète des tissus du SNC, idéale pour évaluer le phénotype, la fonction et la localisation des cellules occupant le compartiment du SNC dans des conditions homéostatiques et pendant la pathogenèse de la maladie.

Introduction

Le système nerveux central (SNC) est un site immunologiquement spécialisé. Le parenchyme du SNC, à l’exclusion de l’espace du LCR, des méninges et du système vasculaire, est classiquement considéré comme un site privilégié par le système immunitaire 1,2,3,4,5 et est relativement dépourvu de cellules immunitaires dans des conditions homéostatiques 2,6,7. En revanche, les méninges, composées des couches de dure-mère, d’arachnoïde et de pia, sont des composants cruciaux du compartiment du SNC, participant activement à la surveillance immunitaire homéostatique et aux processus inflammatoires au cours de la pathogenèse de la maladie 3,6,7,8. Dans des conditions d’état d’équilibre, les méninges soutiennent de nombreuses cellules sentinelles immunitaires, notamment les cellules lymphoïdes innées (ILC), les macrophages, les cellules dendritiques (DC), les mastocytes, les lymphocytes T et, dans une moindre mesure, les lymphocytes B 9,10,11.

Les méninges sont des structures hautement vascularisées et contiennent des vaisseaux lymphatiques qui assurent une connexion lymphatique entre le SNC et sa périphérie 8,12,13,14. Dans les conditions inflammatoires induites par une lésion du SNC, des infections, une auto-immunité ou même une neurodégénérescence, les cellules immunitaires dérivées périphériques infiltrent le parenchyme et modifient le paysage immunitaire dans les méninges. Après l’infiltration cellulaire, les méninges peuvent représenter une niche fonctionnelle pour les cellules immunitaires dérivées périphériquement, favorisant l’agrégation des cellules immunitaires, l’activation locale des cellules immunitaires et la survie à long terme dans le compartiment du SNC. Une inflammation méningée importante est observée dans de multiples maladies affectant le SNC, y compris la sclérose en plaques (SEP)15,16,17,18,19, les accidents vasculaires cérébraux 20,21, les lésions stériles 22,23 (c.-à-d. lésions de la moelle épinière et les traumatismes crâniens), les migraines 24 et les infections microbiennes 25,26.27,28,29. Ainsi, la caractérisation des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le compartiment méningé est essentielle pour comprendre le rôle de ces cellules dans des conditions d’équilibre et de pathogenèse de la maladie.

L’extraction du cerveau, de la moelle épinière et des méninges du crâne et des corps vertébraux est techniquement difficile et prend du temps. Il n’existe actuellement aucune technique d’extraction rapide du cerveau avec les trois couches méningées intactes. Bien que la laminectomie donne une excellente morphologie du tissu de la moelle épinière et préserve les couches méningées, elle est à la fois extrêmement longue et compliquée30,31. À l’inverse, des méthodes d’extraction plus conventionnelles telles que l’ablation du cerveau du crâne et l’extrusion hydraulique de la moelle épinière facilitent l’extraction rapide du tissu du SNC, mais les méninges arachnoïdiennes et durales sont perdues avec ces techniques30,31. L’omission des couches de la dure-mère et de l’arachnoïde lors de l’isolement conventionnel des tissus du cerveau et de la moelle épinière entraîne une analyse incomplète des cellules du compartiment du SNC. Ainsi, l’identification de nouvelles techniques axées sur l’extraction rapide de tissus du SNC avec des méninges intactes est cruciale pour l’analyse optimale du compartiment du SNC.

Ce manuscrit présente deux méthodes d’extraction rapide du cerveau, de la moelle épinière et des méninges chez la souris, facilitant l’analyse en aval des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le parenchyme et les méninges du SNC. Ces protocoles optimisés se concentrent sur 1) l’isolement de suspensions unicellulaires pour l’analyse en aval et 2) la préparation des tissus pour le traitement histologique. L’obtention de suspensions unicellulaires du cerveau, du tissu de la moelle épinière et des méninges durales et arachnoïdiennes32 permet l’analyse simultanée des cellules résidant à la fois dans les compartiments parenchymateux et méningé. Les suspensions unicellulaires peuvent être utilisées dans différentes applications, y compris les tests de culture cellulaire pour effectuer une stimulation in vitro 33, l’immunospot enzymatique (ELISpot)28,34,35, la cytométrie en flux36,33 et la transcriptomique unicellulaire 37 ou en vrac. De plus, le protocole optimisé pour la décalcification de cerveaux entiers et de moelles épinières avec des crânes ou des colonnes vertébrales intacts, respectivement, permet une décalcification douce de l’os environnant, laissant les méninges intactes et préservant la morphologie des tissus. Cette méthode permet l’identification sélective de protéines ou d’ARN à l’aide de techniques d’immunohistochimie (IHC) ou d’hybridation in situ (ISH) dans les espaces parenchymateux et méningés. La caractérisation du phénotype, de l’état d’activation et de la localisation des cellules résidentes et des cellules immunitaires dérivées périphériques dans le SNC peut fournir des informations essentielles pour comprendre comment les types de cellules individuelles dans le compartiment du SNC contribuent à l’homéostasie et à la pathogenèse de la maladie.

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Protocol

Tous les travaux sur les animaux utilisent des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Geisel School of Medicine de Dartmouth.

1. Traitement d’échantillons de cerveau et de moelle épinière pour la décalcification

  1. Isolement d’échantillons de cerveau et de moelle épinière
    1. Euthanasier la souris par inhalation de CO2 . Assurez-vous que le débit deCO2 déplace 10 à 30 % du volume de la cage par minute.
    2. À l’aide d’une pince, soulevez le processus xiphoïde et coupez la paroi abdominale latéralement juste en dessous de la cage thoracique avec des ciseaux, en tirant vers le haut pour éviter de couper les vaisseaux sanguins ou les organes sous-jacents. Coupez le diaphragme latéralement.
    3. Coupez la cage thoracique le long des bords latéraux parallèles aux poumons jusqu’à la clavicule. À l’aide d’une pince, soulevez le sternum et serrez-le avec un hémostatique. Placez l’hémostatique sur la tête pour soulever la cage thoracique et exposer le cœur.
    4. À l’aide d’une pince, saisissez le cœur près de son sommet et faites une incision dans l’oreillette droite du cœur pour fournir une sortie. Insérez une aiguille de 25 g avec une seringue de 10 ml attachée pour administrer lentement 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée 1x dans le ventricule gauche pour perfuser la souris par voie transcardique.
      REMARQUE : La perfusion doit se produire sur 4 à 5 minutes jusqu’à ce que le foie soit débarrassé du sang. Un total de 10 mL de 1x PBS est généralement suffisant pour la perfusion, mais plus peut être utilisé si nécessaire. Un foie clair indique généralement une perfusion adéquate.
    5. À l’aide de ciseaux bien aiguisés, retirez la tête par décapitation (figure 1 ; 1). Faites une incision médiane dans la peau (Figure 1 ; 2) et retournez la peau sur les yeux pour libérer le crâne.
    6. Couper l’os nasal pour libérer la mandibule du crâne (Figure 1 ; 3). Retirez la mandibule, la langue et les yeux. Coupez le long des faces latérales du crâne pour libérer le tissu le long du méat auditif externe (Figure 1 ; 4). Taillez pour enlever tout excès de peau, de muscle et de tissu recouvrant le crâne.
    7. Séparez la cage thoracique de la colonne vertébrale en coupant parallèlement à la colonne vertébrale avec des ciseaux bien aiguisés (Figure 1 ; 5 et 6). Faites une petite incision dans la région lombaire inférieure pour isoler la colonne vertébrale (Figure 1 ; 7). Coupez et enlevez tout muscle restant le long de la colonne vertébrale pour exposer les vertèbres (Figure 1 ; 8).
      REMARQUE : L’ablation de l’excès de tissu de la colonne vertébrale et du crâne est nécessaire pour obtenir une pénétration adéquate du tampon fixateur de paraformaldéhyde (PFA) et d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
  2. Post-fixation, décalcification et cryoconservation
    1. À l’aide d’une pince, placer le cerveau avec le crâne ou la colonne vertébrale intact dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de PFA à 4 %. Placez les tubes à 4 °C pendant au moins 48 h pour une fixation adéquate.
      REMARQUE : Pour éviter une surfixation du tissu, ne pas dépasser 72 h de fixation. Les temps de fixation sont prolongés pour les échantillons osseux avant décalcification. Une fixation adéquate protégera les tissus des effets de la décalcification et assurera une meilleure morphologie des tissus.
    2. Rincez le cerveau ou la moelle épinière en retirant le tissu de l’APF à 4 % à l’aide d’une pince et en plaçant le tissu dans un tube jetable de 14 ml avec 10 ml de PBS 1x pendant 5 minutes. Transférez le cerveau ou la moelle épinière dans un tube conique de 50 mL avec 10 mL d’EDTA à 10 % (pH = 7,2 à 7,4).
      REMARQUE : L’utilisation d’un tube plus grand avec 10 mL d’EDTA donne à l’EDTA une plus grande surface de contact avec le tissu et accélère le processus de décalcification.
    3. Vérifiez quotidiennement si l’os est mou et souple : retirez le tissu de la solution d’EDTA avec une pince, placez-le sur une boîte de Pétri et testez doucement la mollesse de l’os avec une aiguille de 25 G. Si l’aiguille pénètre facilement dans l’os, le processus de décalcification est terminé.
    4. Retirez le tissu de la solution d’EDTA et transférez le cerveau ou la moelle épinière dans un tube jetable de 14 ml contenant 10 ml de 1x PBS et lavez pendant 10 minutes. Répétez le lavage.
      REMARQUE : La décalcification prend généralement 2 à 3 jours. La solution doit être changée tous les 2 à 3 jours si l’os n’est pas encore correctement décalcifié. Cependant, une incubation prolongée dans l’EDTA après la décalcification de l’os peut endommager la morphologie des tissus.
    5. Préparez des solutions de saccharose à 10 %, 20 % et 30 % en ajoutant du saccharose à 1x PBS. Par exemple, pour 10 % de saccharose, ajoutez 10 g de saccharose et portez le volume à 100 mL en utilisant du PBS stérile 1x. Conservez la solution à 4 °C jusqu’à 1 mois.
      REMARQUE : Les solutions de saccharose sont sujettes à la croissance de micro-organismes, de sorte que les échantillons ne doivent pas être stockés pendant des périodes prolongées dans ces solutions.
    6. Retirez le tissu du PBS 1x, placez-le dans 10 mL de solution de saccharose à 10 % et conservez-le à 4 °C. Laissez reposer le mouchoir pendant 24 h ou jusqu’à ce qu’il coule au fond du tube.
    7. Répétez ce processus, en déplaçant d’abord le tissu vers une solution de saccharose à 20 %, puis vers une solution de saccharose à 30 %. Laisser le tissu pénétrer dans 30 % de saccharose (au moins 24 h) et procéder à l’enrobage des tissus.
  3. Enrobage et congélation des tissus
    1. À l’aide d’une pince, retirez le tissu du saccharose à 30 %, placez-le sur une boîte de Pétri et inclinez la boîte pour éliminer tout excès de solution de saccharose sur le tissu. À l’aide d’un scalpel, coupez le tissu en segments souhaités.
    2. Créez une fine couche de composé à température de coupe optimale (OCT) au fond du cryomoule et placez le(s) morceau(s) de tissu dans le moule. Recouvrez complètement le tissu avec le composé OCT, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles.
    3. Congelez les blocs en les survolant de l’azote liquide38 ou en les plaçant sur une boue 100 % isopropanol/glace carbonique39 jusqu’à ce que le bloc soit opaque. Enveloppez les cryomoules dans du papier d’aluminium et stockez les blocs à -80 °C pour un stockage à long terme. Déplacez les blocs à -20 °C avant de les sectionner.
      REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors de la section et de l’exécution des protocoles d’histologie sur les cerveaux décalcifiés, car les couches du crâne et du méninge peuvent être perdues si les coupes sont manipulées brutalement.

2. Préparation des méninges et des tissus du SNC pour la coloration par cytométrie en flux

  1. Extraction de la calotte crânienne et du cerveau
    1. À l’aide de ciseaux bien aiguisés, retirez la tête par décapitation (figure 2A ; 1). À l’aide de ciseaux, faites une incision médiane dans la peau (Figure 2A ; 2) et retournez la peau sur les yeux pour libérer le crâne.
    2. Placez les ciseaux à l’intérieur du foramen magna et commencez à couper le crâne latéralement le long des cortex vers le bulbe olfactif, en gardant les incisions au-dessus du méat auditif externe et de la mandibule (Figure 2A ; 3). Effectuez les mêmes incisions du côté opposé, les incisions se rejoignant au niveau du bulbe olfactif pour libérer la calotte crânienne du cerveau (Figure 2A ; 3).
    3. À l’aide d’une pince, retirez la calotte crânienne et placez-la dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de milieu RPMI froid complété par 25 mM de HEPES. Gardez le tube sur de la glace.
    4. À l’aide d’une pince incurvée, placez la pince sous la base du cerveau et soulevez-la pour libérer le cerveau de la calotte. Placez le cerveau dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de RPMI froid complété par 25 mM HEPES. Gardez le tube sur de la glace jusqu’au traitement.
  2. Extraction du tissu de la colonne vertébrale et de la moelle épinière
    1. À l’aide d’une pince et de ciseaux bien aiguisés, séparez la cage thoracique de la colonne vertébrale en coupant parallèlement à la colonne vertébrale (figures 2A ; 4 et 5). Faites une petite incision dans la région lombaire inférieure pour isoler la colonne vertébrale (figure 2A ; 6). Coupez et enlevez tout muscle restant le long de la colonne vertébrale pour exposer les vertèbres (figure 2A ; 7).
    2. Placez les ciseaux chirurgicaux extra-fins à l’intérieur de la colonne vertébrale et coupez le long du bord latéral de la colonne (Figure 2C). Coupez complètement le bord latéral opposé pour diviser la colonne vertébrale en une partie antérieure et une partie postérieure.
      REMARQUE : La moelle épinière restera attachée à la colonne vertébrale.
    3. À l’aide d’une pince, retirez lentement et soigneusement la moelle épinière de la colonne vertébrale et placez le tissu dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de RPMI froid avec 25 mM de HEPES. Transférez les parties antérieure et postérieure de la colonne vertébrale dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de RPMI froid avec 25 mM de HEPES.
  3. Enlever les méninges pour préparer des suspensions unicellulaires
    1. À l’aide d’une pince, retirez la calotte crânienne du support RPMI. À l’aide d’une pince tranchante (pince #7 ; Table des matériaux), entaillez le pourtour du bord extérieur de la calotte crânienne (figure 2B) et retirez les méninges du bord de la calotte crânienne, en grattant pour enlever les méninges durales et arachnoïdiennes. Placez les méninges sur une boîte de Pétri.
      REMARQUE : L’ablation des méninges du cerveau et de la moelle épinière nécessite de la pratique. Si l’utilisateur éprouve des difficultés à extraire les méninges, utilisez un microscope à dissection pour faciliter le retrait.
    2. Retirez la colonne vertébrale du tube. À l’aide d’une pince tranchante, entaillez les bords de la colonne vertébrale pour libérer les méninges et décollez les méninges du bord de la vertèbre à l’aide d’une pince courbée. Placez les méninges sur une boîte de Pétri.
    3. Placer une crépine en maille de nylon dans un tube conique de 50 ml. Déplacez les méninges dans la passoire et ajoutez 3 mL de RPMI complété par 25 mM HEPES. À l’aide du piston d’une seringue de 5 ml, broyer le tissu et le milieu à travers la passoire.
    4. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, laver la crépine avec 2 à 3 mL supplémentaires de milieu RPMI/HEPES jusqu’à ce que tous les tissus visibles aient traversé la crépine.
      REMARQUE : Pour obtenir un nombre de cellules adéquat pour l’analyse par cytométrie en flux, il peut être nécessaire de regrouper les méninges de plusieurs animaux. Dans cette expérience (Figure 3 et Figure 4), les méninges du cerveau et de la moelle épinière de 4 à 5 souris ont été regroupées. Si les échantillons sont regroupés, des milieux supplémentaires seront nécessaires pour broyer le tissu à travers la crépine en nylon afin d’éviter la surchauffe du tissu.
    5. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, transférer les cellules et le milieu dans un tube conique neuf de 15 ml. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, laver le tube conique de 50 mL avec 5 mL de milieu pour recueillir les cellules restantes. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules.
    6. À l’aide d’une pipette Pasteur sous vide, aspirer le surnageant en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire et remettre les cellules en suspension dans un volume et un tampon appropriés.
    7. Pour compter la suspension unicellulaire, diluer un petit volume de cellules (c.-à-d. 5 à 10 μL) à l’aide d’un colorant d’exclusion au bleu de trypan (dilution 1 :10) et d’un RPMI. Ajouter 10 μL de dilution dans l’hémocytomètre.
    8. Comptez les cellules comme décrit précédemment40,41, en faisant la moyenne d’au moins deux grilles de 16 carrés pour plus de précision.
      NOTA : Dans la figure 3, par exemple, des cellules groupées et granulées des méninges ont été remises en suspension dans 250 μL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (1 x PBS avec 1 % de FBS) pour la coloration de surface en aval. Les cellules ont été diluées à l’échelle 1 :10 pour le comptage (5 μL de cellules, 5 μL de bleu de trypan, 40 μL de RPMI). Cette dilution a permis d’obtenir entre 50 et 100 cellules par 16 grilles carrées, ce qui garantit un comptage plus précis des cellules, car les cellules ne sont ni trop denses, ni trop superposées, ni trop clairsemées. Le nombre de cellules nucléées provenant de méninges cérébrales et méninges de la moelle épinière regroupées par souris était le suivant : pour les méninges de souris traitées par simulacre = 100 000 à 150 000 cellules et pour les méninges de souris atteintes de la maladie démyélinisante induite par le virus de l’encéphalomyélite murine de Theiler (TMEV-IDD) = 300 000 à 350 000 cellules. Le nombre de cellules varie en fonction de la précision du prélèvement, du traitement et de la présence d’une inflammation méningée.
    9. Passez à la technique unicellulaire souhaitée telle qu’une surface FACS (Figure 3)14,36,42,43,44, des protocoles de coloration intracellulaire 33,45, de la stimulation in vitro, des essais de culture cellulaire 33,46,47, du test ELISPOT 28,34,35 et des tests en vrac ou unicellulaires transcriptomique 37,48.
      REMARQUE : Gardez tous les tubes sur de la glace entre les étapes de traitement.
  4. Préparation de suspensions unicellulaires de tissus cérébraux et de moelle épinière
    1. Transférez le tissu du cerveau ou de la moelle épinière avec le milieu vers le haut de la boîte de Pétri de 100 mm en versant le tissu et le milieu à partir du tube. À l’aide d’une pince, déplacez le tissu au fond de la boîte de Pétri. Hacher finement le cerveau ou la moelle épinière à l’aide d’une lame de rasoir stérile. À l’aide de la lame de rasoir, déplacez le tissu haché vers le fond de l’assiette en grattant pour rassembler le tissu.
      REMARQUE : Pour le protocole de digestion enzymatique ci-dessous, jusqu’à deux moelles épinières peuvent être regroupées pour le traitement. Les cerveaux doivent être traités individuellement.
    2. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, ajouter 3 mL de RPMI additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) dans la boîte de Pétri. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, pipeter de haut en bas pour remettre le tissu en suspension dans le milieu et transférer dans un tube conique de 15 mL.
      REMARQUE : Si l’application en aval est l’analyse de séquençage de l’ARN ou la culture cellulaire d’une seule cellule ou en vrac, les lots de FCS doivent être testés pour s’assurer que les cellules ne sont pas activées avant l’analyse. Alternativement, les cellules peuvent être traitées en utilisant 1x PBS avec 0,04% BSA au lieu de RPMI avec 10% FCS.
    3. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, laver la boîte de Pétri avec 2 mL supplémentaires de milieu pour recueillir tout tissu résiduel et transférer dans un tube conique pour obtenir un volume total de 5 mL. Gardez les tubes sur de la glace entre les étapes de traitement.
    4. À l’aide d’une pipette, remettre en suspension la poudre de collagénase I dans le milieu Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) pour obtenir la concentration désirée (c.-à-d. 100 mg/mL). Ajouter la collagénase de type I dans le tube conique contenant l’échantillon de tissu haché pour obtenir la concentration finale désirée (c.-à-d. 50 μL pour 1 mg/mL).
      REMARQUE : Des concentrations plus élevées de collagénase augmenteront les rendements cellulaires, mais peuvent cliver les marqueurs de surface cellulaire. Par conséquent, les lots de collagénase I doivent être titrés pour déterminer la concentration optimale nécessaire pour obtenir le plus grand nombre de cellules viables avec tous les marqueurs de surface cellulaire requis intacts. Par exemple, la collagénase I a été testée à des concentrations finales de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL et 2 mg/mL sur des échantillons de cerveau ou de moelle épinière. La viabilité cellulaire a été déterminée à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de trypan et les marqueurs de surface cellulaire CD45, CD19 et CD4 ont été évalués par cytométrie en flux. Une concentration de 1 mg/mL de collagénase I a permis d’obtenir le nombre de cellules vivantes le plus élevé tout en conservant tous les marqueurs de surface cellulaire d’intérêt. Ainsi, cette concentration a été utilisée pour d’autres expériences examinant ces types de cellules.
    5. Remettre délicatement en suspension la poudre de DNase I en utilisant du chlorure de sodium de 0,15 M jusqu’à la concentration de base souhaitée. Ajouter la DNase I remise en suspension dans le tube conique contenant l’échantillon de tissu haché pour obtenir une concentration finale de 20 U/mL.
      REMARQUE : Les lots de DNase I varient selon les unités d’activité par mL. La concentration à ajouter à l’échantillon de tissu changera en fonction des unités d’activité par millilitre du flacon de stock. La concentration finale souhaitée par échantillon est de 20 U/mL.
    6. Placez les tubes dans un portoir à tubes au bain-marie à 37 °C et incubez-les pendant 40 min. Retournez les tubes toutes les 15 minutes pour bien mélanger le tissu avec les enzymes. Après incubation, ajouter 500 μL d’EDTA 0,1 M (pH = 7,2) dans chaque tube pour une concentration finale de 0,01 M EDTA et incuber pendant 5 min supplémentaires pour inactiver la collagénase.
    7. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter 9 mL de RPMI complété par 10 % de FCS dans chaque tube pour porter le volume de chaque tube à ~14,5 mL. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. À l’aide d’une pipette Pasteur sous vide, aspirer le surnageant en prenant soin de ne pas toucher la pastille de cellule.
    8. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, ajouter 3 mL de solution de gradient de densité isotonique à 100 % dans le tube contenant la pastille cellulaire. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter un milieu RPMI 10 % FCS supplémentaire pour porter le volume final à 10 mL et remettre en suspension la pastille cellulaire pour créer une couche de solution de gradient de densité isotonique à 30 %.
      REMARQUE : Préparer le milieu à gradient de densité isotonique 100 % à l’avance, aliquote, et conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois. Pour préparer la solution de gradient de densité isotonique à 100 %, diluer le milieu de gradient de densité (tableau des matériaux) avec un tampon de dilution du milieu de gradient de densité. Préparer le tampon de dilution du milieu à gradient de densité (80,0 g/L de NaCl, 3,0 g/L de KCl ; 0,73 g/L de Na 2 HP0 4, 0,20 g/L de KH2HP04 ; 20,0 g/L de glucose) et stériliser le filtre à l’aide d’un système de filtration sous vide. Préparez la solution de gradient de densité isotonique à 100 % en mélangeant 1 partie de tampon de dilution de gradient de densité et 9 parties de milieu de gradient de densité. Bien mélanger.
    9. Retournez et mélangez bien chaque tube avant d’ajouter la sous-couche de solution de gradient de densité isotonique à 70 %. Insérez une pipette sérologique de 1 mL contenant 1 mL de solution de gradient de densité isotonique à 70 % dans le fond du tube. Déposer lentement 1 mL de la solution, en prenant soin de ne pas faire de bulles. Retirez lentement la pipette sérologique du tube, en prenant soin de ne pas perturber le gradient.
      REMARQUE : Pour la sous-couche à 70 %, la solution de gradient de densité isotonique à 100 % doit être diluée à 70 % à l’aide d’un média RPMI (c.-à-d. 7 mL de solution de gradient de densité isotonique à 100 % et 3 mL de substrat RPMI bien mélangés). De plus, la création d’une sous-couche propre et non perturbée à 70 % est essentielle pour l’élimination des débris de myéline et pour l’obtention de suspensions unicellulaires pures à l’interface du gradient après centrifugation.
    10. Centrifuger à 800 x g pendant 30 min à 4 °C sans frein. Aspirer le surnageant, y compris la couche de débris de myéline, jusqu’à ce qu’il reste 2 à 3 ml dans le tube, en prenant soin de ne pas perturber la couche cellulaire. Prélever la couche cellulaire entre le gradient de densité de 30 et 70 % à l’aide d’une pipette de 1 mL et la transférer dans un nouveau tube conique de 15 mL.
    11. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter le milieu FPS à 10 % RPMI pour porter le volume final à 15 mL. Centrifuger 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
      REMARQUE : Au cours de cette étape, les couches cellulaires de deux tubes peuvent être regroupées si nécessaire. Ne mettez pas en commun plus de deux tubes, sinon les cellules ne granuleront pas en raison d’une concentration de milieu à gradient haute densité.
    12. Aspirez le surnageant avec précaution pour ne pas perturber la pastille cellulaire. Remettre les cellules en suspension dans un volume/tampon approprié pour les compter à l’aide d’un hémocytomètre (p. ex., remettre en suspension une seule moelle épinière dans 250 μL de tampon FACS pour la coloration de la surface en aval) (figure 3).
    13. À l’aide d’une pipette de 1 ml, transférez les suspensions cellulaires dans le haut d’un tube supérieur filtrant (tableau des matériaux) et laissez les cellules filtrer vers le fond du tube pour éliminer les débris de myéline restants.
    14. À l’aide d’un colorant d’exclusion au bleu de trypan, diluez et comptez les cellules sur un hémocytomètre en faisant la moyenne d’au moins deux grilles de 16 carrés pour une précisionde 40,41.
    15. Procédez à la technique d’analyse unicellulaire souhaitée.
      REMARQUE : À l’aide de diverses formes de collagénase (c.-à-d. D, type I, type II, type IV), les cellules immunitaires, la microglie (Figure 3), les astrocytes, les péricytes, les cellules endothéliales49 et les neurones50 peuvent tous être isolés efficacement. Le nombre de cellules nucléées obtenues pour les résultats était le suivant à l’aide de l’enzyme collagénase I titrée : cerveau entier traité par simulacre = 500 000 à 600 000 cellules ; Cerveau entier TMEV-IDD = 800 000 à 1 000 000 de cellules ; Moelle épinière entière traitée par simulacre = 150 000 à 200 000 cellules ; Moelle épinière TMEV-IDD entière = 300 000 à 400 000. Le nombre de cellules varie en fonction de la précision du prélèvement, du traitement et de la présence ou non d’une inflammation du SNC.

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Representative Results

Cette expérience représentative visait à quantifier les lymphocytes B et T et à décrire la localisation des lymphocytes B et T dans les compartiments méningés et parenchymateux du SNC dans des conditions homéostatiques ainsi que dans un modèle murin de SEP progressive (c’est-à-dire TMEV-IDD). Le TMEV-IDD a été induit chez des souris SJL femelles âgées de 5 semaines par une infection intracrânienne avec 5 x 106 unités formant la plaque (PFU) de TMEV BeAn, comme décrit précédemment29.

La présente étude a évalué les lymphocytes B et T dans les méninges, le cerveau et la moelle épinière au cours d’un TMEV-IDD chronique au jour 120 après l’infection. Des souris simulées de même âge ont été utilisées comme témoins. L’étude était composée de deux expériences. Le premier s’est concentré sur l’obtention de suspensions unicellulaires pour l’évaluation par cytométrie en flux, une technique bien établie pour analyser et quantifier la composition cellulaire en évaluant la surface cellulaire et/ou les antigènes intracellulaires (n = 4 simulés ; n = 5 TMEV-IDD). La deuxième expérience s’est concentrée sur la description de la localisation des lymphocytes B et T dans le compartiment du SNC en utilisant l’immunohistochimie sur des tissus cérébraux et de la moelle épinière décalcifiés (n = 3 traités par simulacre ; n = 8 TMEV-IDD).

À la suite de l’isolement de suspensions unicellulaires provenant du cerveau, de la moelle épinière et de méninges regroupées (cerveau et moelle épinière) de souris traitées par TMEV-IDD et de souris traitées par simulacre, un protocole de coloration de surface a été appliqué à tous les échantillons. Brièvement, les suspensions unicellulaires ont été incubées avec un colorant d’exclusion de viabilité fixable (780) pendant 15 min, lavées, bloquées avec un bloc Fc en présence de sérum de souris pendant 15 min, et colorées avec des anticorps conjugués pour les marqueurs de surface cellulaire, y compris CD45 (30-F11 ; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3 ; PE-CF594) et CD4 (GK1.5 ; PE) pendant 30 min comme décrit précédemment28,29. Les cellules ont ensuite été lavées et analysées à l’aide d’un cytomètre en flux28,29. L’évaluation de la viabilité a été effectuée comme décrit précédemment28. L’expression de CD45 a été évaluée pour distinguer les cellules immunitaires infiltrantes (P1) de CD45hi d’origine périphérique de la microglie CD45 (P2) et des neurones, astrocytes et oligodendrocytes CD45-, dans le cerveauet la moelle épinière (P3 ; Graphique 3A). Chez les souris traitées par simulacre, peu de cellulesCD45 hi étaient présentes dans la moelle épinière et les tissus cérébraux. Dans les méninges, le même seuil de déclenchement de l’expression de CD45hi utilisé pour les données sur le cerveau et la moelle épinière a été appliqué pour identifier les cellules immunitairesCD45 hi (P1 ; Graphique 3C) et exclure les cellules non immunitaires présentes dans les méninges (c’est-à-dire les fibroblastes, les cellules endothéliales). Chez les souris traitées simulées, peu de cellulesHI CD45 (<0,1 %) étaient présentes dans les méninges. Parmi les cellules immunitairesà haute teneur en CD45 dans les tissus du SNC TMEV-IDD, les lymphocytes B et les lymphocytes T CD4 ont été identifiés par l’expression de surface de CD19 et de CD4, respectivement (Figure 3B-D). Dans tous les tissus du SNC TMEV-IDD, des pourcentages accrus de cellulesimmunitaires CD45 ont été observés par rapport aux souris traitées par simulacre (Figure 4A). Au cours de la TMEV-IDD chronique, le pourcentage de lymphocytes B parmi les cellules immunitairesCD45 du cerveau et de la moelle épinière était plus élevé que dans le compartiment méningé (Figure 4B).

Afin d’identifier la localisation des lymphocytes B et des lymphocytes T dans le compartiment du SNC au cours d’une TMEV-IDD chronique, des cerveaux et des moelles épinières décalcifiés ont été évalués à l’aide de l’immunohistochimie en utilisant le protocole de coloration décrit précédemment29. Les méninges et le système vasculaire ont été délimités à l’aide de la laminine, un composant de la membrane basale29,51 et de l’ER-TR7, un marqueur des cellules réticulaires des fibroblastes52,53. Lors de l’extraction conventionnelle du cerveau de la calotte crânienne, la couche de pia était intacte, mais les couches méningées restantes ont été exclues (Figure 5A). Dans la moelle épinière, l’extrusion hydraulique a entraîné l’absence de toutes les couches méningées (données non présentées). Dans les cerveaux et les moelles épinières décalcifiés, toutes les couches méningées étaient intactes (figure 5B). Pour examiner la localisation des lymphocytes B et T dans le TMEV-IDD chronique, l’expression des IgG a été utilisée pour déterminer la localisation des lymphocytes B à commutation isotypique 29, et CD3 a été utilisé pour visualiser tous les lymphocytes T29. La cocoloration des IgG avec ER-TR7 a révélé la présence de lymphocytes B IgG+ à commutation isotypique dans le parenchyme du SNC et les méninges (Figure 6A). Les agrégats cellulaires à l’intérieur des méninges ER-TR7+ contenaient plusieurs lymphocytes B IgG+ et des lymphocytes T CD3+ (figure 6B).

Les résultats représentatifs montrent des pourcentages élevés de lymphocytes B et de lymphocytes T dans les compartiments parenchymateux et méningés chez les souris chroniques TMEV-IDD par rapport aux souris traitées par simulacre apparié selon l’âge. L’analyse IHC a en outre démontré que dans le tissu TMEV-IDD, les lymphocytes B et les lymphocytes T étaient dispersés dans le parenchyme, mais étaient étroitement associés dans les méninges, formant des agrégats inflammatoires. Chez les patients atteints de SEP progressive, les agrégats inflammatoires méningés sont associés à des lésions tissulaires adjacentes et à une aggravation de l’issue de la maladie. Dans le cas d’un TMEV-IDD chronique, la présence persistante de lymphocytes B et de lymphocytes T dans le compartiment du SNC et l’agrégation dans les méninges peuvent être associées à des lésions tissulaires et à la progression de la maladie. D’autres études sont nécessaires pour comprendre comment l’inflammation méningée par rapport à l’inflammation parenchymateuse affecte la démyélinisation, la neurodégénérescence et l’invalidité clinique.

Figure 1
Figure 1 : Isolement des cerveaux et de la moelle épinière pour la décalcification. Les lignes pointillées bleues indiquent les incisions pratiquées pour isoler le cerveau avec le crâne intact (coupes 1 à 4) et la colonne vertébrale (coupes 5 à 8). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Isolement des cerveaux, de la moelle épinière et des méninges pour les techniques unicellulaires. (A) Les pointillés bleus indiquent les coupes pratiquées pour isoler la calotte crânienne avec les méninges et le cerveau intacts (coupes 1 à 3) et la colonne vertébrale (coupes 5 à 7). La coupe latérale 3 est faite de part et d’autre du crâne. (B) La ligne bleue indique l’incision pratiquée pour marquer et enlever les méninges de la calotte crânienne et les incisions faites dans la colonne vertébrale (les deux côtés latéraux) pour isoler la moelle épinière et les méninges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Identification des cellules immunitaires CD45hi infiltrant dans les tissus du SNC. (A) Stratégie de déclenchement pour l’identification des cellules immunitaires infiltrantes CD45hi (P1), de la microglieCD45 lo (P2) et des oligodendrocytes, astrocytes et neurones CD45--, parmi le nombre total de cellules vivantes de la moelle épinière provenant de souris traitées simulées (rouges) ou TMEV-IDD (bleues). Des cellulesCD45 Hi minimes ont été détectées dans des cerveaux et des moelles épinières traités par simulacre. (B) Stratégie de déclenchement pour l’identification des lymphocytes B CD19+ et des lymphocytes T CD4+ parmi les cellules immunitairesinfiltrantes CD45 hi (P1) chez les souris TMEV-IDD. Les stratégies de déclenchement étaient similaires pour les tissus du cerveau et de la moelle épinière. (C) Stratégie de déclenchement pour l’identification des cellulesCD45 hi (P1) dans les méninges des souris traitées par simulacre (rouge) et des souris TMEV-IDD chroniques (bleu). (D) Stratégie de déclenchement pour l’identification des lymphocytes B CD19+ et des lymphocytes T CD4+ parmi les cellules immunitaires infiltrantes CD45hi (P1) dans les méninges des souris TMEV-IDD chroniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Augmentation des cellules immunitairesCD45 et des lymphocytes B CD19+ dans les tissus du SNC dans le TMEV-IDD chronique. Les graphiques à barres récapitulatifs des données de cytométrie en flux obtenues à partir de méninges, de cerveaux et de moelle épinière traités par simulacre ou TMEV-IDD montrent des pourcentages de cellules immunitaires infiltrantes CD45hi (A) ou des pourcentages de cellules B CD19+ (B). Pour les tissus TMEV-IDD, les données de cytométrie en flux ont été obtenues à partir de cinq souris, la moelle épinière et le cerveau étant traités individuellement, tandis que les méninges ont été regroupées pour analyse. Pour les souris traitées simulées, les données de cytométrie en flux ont été obtenues à partir de quatre souris, la moelle épinière et le cerveau étant traités individuellement, tandis que les méninges ont été regroupées pour analyse. Les données sur la moelle épinière et le cerveau sont présentées sous forme de moyenne ± MEB. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Couches méningées intactes dans des cerveaux et des moelles épinières décalcifiés. (A) Des cerveaux extraits de la calotte crânienne ou (B) des cerveaux décalcifiés avec des crânes et des colonnes vertébrales intacts de souris atteintes de TMEV-IDD chronique ont été évalués pour le DAPI (bleu), les marqueurs méningés laminine (vert) et ER-TR7 (rouge). Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : L’agrégation des cellules immunitaires était évidente dans les méninges au cours d’un TMEV-IDD chronique. (A) Des colonnes vertébrales décalcifiées de souris atteintes de TMEV-IDD chronique ont été examinées pour détecter la présence d’IgG (en vert) afin d’identifier les cellules immunitaires à changement d’isotype dans le parenchyme et dans les méninges ER-TR7+ (en rouge). (B) Les lymphocytes T CD3+ (vert) et les lymphocytes B à commutation isotypique IgG+ (rouge) ont été cocolorés avec des méninges ER-TR7+ afin d’évaluer la localisation dans le tissu de la moelle épinière. Les flèches blanches mettent en évidence les lymphocytes B et T à l’intérieur des méninges. Barre d’échelle = 50 μm. Les cases blanches délimitent les zones sélectionnées pour les images recadrées (à droite ; barre d’échelle = 10 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les méthodes d’évaluation de la composition cellulaire dans le compartiment du SNC au cours de l’homéostasie et de la maladie sont essentielles pour comprendre les états physiologiques et pathologiques du SNC. Cependant, bien qu’elles constituent une barrière importante dans le SNC et qu’elles abritent un large éventail de cellules immunitaires, les méninges sont souvent omises de l’analyse car de nombreuses méthodes conventionnelles d’extraction de tissus pour le cerveau et la moelle épinière ne permettent pas la collecte de ces membranes. Cette omission est une limite critique dans l’avancement de notre compréhension de la composition cellulaire et de la fonction des méninges et de leur rôle dans les conditions d’état d’équilibre et inflammatoires. Des études récentes ont révélé que les cellules immunitaires résidentes et dérivées périphériques résidant dans le compartiment méningé jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie dans le SNC, ainsi que dans la pathogenèse de la maladie du SNC. Ces études soulignent la nécessité d’analyser non seulement le compartiment parenchymateux mais aussi les couches méningées environnantes. Les protocoles décrits ici permettent d’isoler rapidement le cerveau et la moelle épinière tout en préservant les méninges, ce qui permet une analyse complète en aval du compartiment du SNC à l’aide d’études histologiques et unicellulaires. Les résultats représentatifs se concentrent sur l’évaluation des cellules immunitaires dans le compartiment du SNC ; cependant, les protocoles peuvent être adaptés pour analyser la microglie, les astrocytes, les neurones, les péricytes, les cellules endothéliales ou d’autres cellules résidentes du SNC.

Une étape critique dans les méthodes décrites est l’extraction minutieuse du tissu, essentielle à la fois pour isoler les suspensions unicellulaires pures du cerveau, de la moelle épinière et des méninges et pour obtenir des tissus du SNC avec des crânes ou des colonnes vertébrales intacts, permettant une morphologie tissulaire de haute qualité. La pratique de la technique d’obtention de suspensions unicellulaires est la clé d’une extraction tissulaire réussie, car elle permettra non seulement d’améliorer la pureté de l’échantillon, mais aussi d’améliorer les rendements cellulaires pour les applications en aval. De même, la pratique de l’isolement des tissus du SNC avec des crânes ou des colonnes vertébrales intacts pour éliminer adéquatement l’excès de tissu entourant l’os est une étape essentielle qui assure une meilleure fixation, décalcification et cryoconservation des tissus, tous des composants cruciaux pour obtenir des coupes de tissus avec une morphologie de haute qualité et des cibles antigéniques intactes.

L’une des limites de notre protocole d’isolement des suspensions unicellulaires des méninges est qu’il se concentre sur l’obtention de méninges durales et arachnoïdiennes32,54 tout en omettant l’isolement de l’apie, qui reste attachée au cerveau ou à la moelle épinière via des processus astrocytaires. Bien que les cellules résidant dans la pie-mère soient une composante essentielle du compartiment méningé, il a été décidé d’exclure la pie-mère lors de la préparation de la suspension unicellulaire en raison du temps considérable nécessaire pour l’isoler adéquatement55. De même, le protocole se concentre uniquement sur l’obtention de méninges dans la partie supérieure du crâne et exclut l’isolement des méninges invaginantes dans le cerveau et le plexus choroïde. Le prélèvement des méninges invaginantes et du plexus choroïde peut être effectué selon les protocoles précédemment publiés55, bien qu’il s’agisse d’une procédure qui prend du temps. Dans les deux cas, le choix d’omettre une partie des couches méningées était dû au temps nécessaire pour les isoler. Le moment choisi pour préparer les suspensions unicellulaires nécessaires aux applications en aval telles que la cytométrie en flux, les tests de culture cellulaire et le séquençage de l’ARN (RNAseq) est essentiel pour améliorer la viabilité cellulaire et la qualité des données. Par conséquent, en fonction de la question de recherche spécifique, un équilibre doit être trouvé entre le temps d’isolement de l’échantillon et la minutie de l’extraction des méninges. Dans le protocole actuel, seules des préparations de suspension unicellulaire à partir des méninges dures et arachnoïdiennes sont obtenues, ce qui limite la capacité d’extrapoler les résultats à l’ensemble des méninges du SNC. Cependant, si ces méthodes sont utilisées en combinaison avec l’analyse IHC ou ISH de coupes de tissus entiers avec les trois couches de méninges, une compréhension plus approfondie de la dynamique cellulaire et moléculaire dans les compartiments parenchymateux et méningés peut être acquise.

Une autre limite du protocole est le faible nombre de cellules obtenues à partir des méninges durales et arachnoïdiennes, en particulier dans des conditions homéostatiques. Cependant, si le nombre de cellules dans la moelle épinière, le cerveau ou les méninges est jugé trop faible pour l’analyse d’une population de cellules cibles particulière, le nombre minimal de cellules requis pour cette analyse peut être déterminé en estimant le nombre total d’événements requis pour une précision donnée (par exemple, un coefficient de variation de 5 %) tel que décrit dans la littérature antérieure spécialisée dans l’analyse des événements rares56. Ces calculs peuvent ensuite être utilisés pour déterminer si des échantillons provenant de plusieurs animaux doivent être regroupés afin d’acquérir un nombre suffisant de cellules pour analyser la population cellulaire d’intérêt.

Les méthodes décrites constituent une avancée essentielle dans l’étude de la dynamique cellulaire dans le compartiment du SNC en étendant les analyses au compartiment méningé, souvent négligé. Ces protocoles permettent l’extraction individuelle du cerveau, de la moelle épinière et des méninges durales et arachnoïdiennes pour générer des suspensions unicellulaires. De plus, le protocole de décalcification permet des analyses histologiques de coupes de tissus comprenant des tissus cérébraux ou de moelle épinière, y compris les trois couches méningées. L’utilisation de l’EDTA permet d’obtenir un processus de décalcification lent mais doux, ce qui est le plus approprié pour les échantillons où une morphologie tissulaire de haute qualité est requise (par exemple, IHC et ISH). Le protocole utilise un pH de 7,2 à 7,4 pour ralentir le taux de décalcification et assurer le maintien d’une morphologie tissulaire intacte, un net avantage par rapport aux acides forts et faibles (par exemple, l’acide chlorhydrique et l’acide trichloracétique), qui ont un temps de décalcification plus court, mais ont un impact sur la qualité de la morphologie des tissus.

Les méthodes futures visant à isoler les suspensions unicellulaires des méninges devraient se concentrer sur l’élaboration de protocoles visant à raccourcir le temps nécessaire pour isoler complètement la couche piale des tissus du SNC et des méninges invaginantes dans le cerveau. L’obtention du complexe complet des trois couches méningées permettra non seulement d’augmenter le nombre de cellules pour toute analyse, mais fournira également une évaluation plus complète des cellules immunitaires résidentes et infiltrantes occupant les méninges, qui entourent le SNC. Parallèlement, les futurs protocoles axés sur la préparation de cerveaux et de moelles épinières décalcifiés devraient chercher à identifier de nouveaux agents visant à accélérer la décalcification des tissus tout en préservant la qualité de la morphologie des tissus. Cependant, dans l’ensemble, les applications en aval analysant les suspensions unicellulaires du SNC, y compris les méninges doubles et arachnoïdiennes, effectuées en combinaison avec une analyse complète des coupes tissulaires, peuvent fournir une compréhension détaillée du phénotype, de la fonction et de la localisation des cellules dans le compartiment du SNC.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le personnel du Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) de Dartmouth pour les soins spécialisés qu’ils ont prodigués aux souris utilisées pour ces études. Cette recherche a été financée par le Fonds de recherche de Bornstein.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

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References

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Immunologie et infection Numéro 159 méninges système nerveux central décalcification immunohistochimie suspension unicellulaire cellules immunitaires souris
Isolement des tissus du système nerveux central et des méninges associées pour l’analyse en aval des cellules immunitaires
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DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

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