Summary
Apresentado é um protocolo para o isolamento de cardiomiócitos ventriculares humanos e animais de fatias miocárrias cortadas por vibratome. Altos rendimentos de células tolerantes ao cálcio (até 200 células/mg) podem ser obtidos a partir de pequenas quantidades de tecido (<50 mgs). O protocolo é aplicável ao miocárdio exposto à isquemia fria por até 36 h.
Abstract
O isolamento de miócitos cardíacos ventriculares de corações animais e humanos é um método fundamental na pesquisa cardíaca. Cardiomiócitos animais são comumente isolados por perfusão coronária com enzimas digestivas. No entanto, isolar os cardiomiócitos humanos é um desafio porque os espécimes do miocárdio humano geralmente não permitem perfusão coronária, e protocolos alternativos de isolamento resultam em baixos rendimentos de células viáveis. Além disso, as amostras de miocárdio humano são raras e só estão disponíveis regularmente em instituições com cirurgia cardíaca no local. Isso dificulta a tradução de achados de cardiomiócitos animais para humanos. Descrito aqui é um protocolo confiável que permite o isolamento eficiente de miócitos ventriculares do miocárdio humano e animal. Para aumentar a relação superfície-volume, minimizando os danos celulares, as fatias de tecido miocárdio de 300 μm de espessura são geradas a partir de amostras do miocárdio com um vibratome. As fatias de tecido são então digeridas com protease e colagem. O miocárdio de rato foi usado para estabelecer o protocolo e quantificar os rendimentos de miócitos viáveis e tolerantes ao cálcio por contagem de células citométricas de fluxo. A comparação com o método de pedaço de tecido comumente utilizado mostrou rendimentos significativamente maiores de cardiomiócitos em forma de haste (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). O protocolo foi traduzido para o miocárdio humano falha e não falha, onde os rendimentos foram semelhantes aos do miocárdio de rato e, novamente, notavelmente maior do que com o método de pedaço de tecido (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 células/mg, p < 0,05). Notavelmente, com o protocolo apresentado é possível isolar números razoáveis de cardiomiócitos humanos viáveis (9-200 células/mg) de quantidades mínimas de tecido (<50 mgs). Assim, o método é aplicável ao miocárdio saudável e falhado tanto do coração humano quanto do animal. Além disso, é possível isolar miócitos excitáveis e contratuais de amostras de tecido humano armazenadas por até 36 h em solução cardioplégica fria, tornando o método particularmente útil para laboratórios em instituições sem cirurgia cardíaca no local.
Introduction
Uma técnica seminal que abriu caminho para importantes insights sobre a fisiologia do cardiomiócito é o isolamento de cardiomiócitos ventriculares vivos de corações intactos1. Cardiomiócitos isolados podem ser usados para estudar a estrutura e função celular normal, ou as consequências de experimentos in vivo; por exemplo, avaliar alterações na eletrofisiologia celular ou acoplamento excitação-contração em modelos animais de doença cardíaca. Além disso, cardiomiócitos isolados podem ser usados para cultura celular, intervenções farmacológicas, transferência genética, engenharia de tecidos e muitas outras aplicações. Portanto, métodos eficientes para isolamento cardiomiócito são de valor fundamental para a pesquisa cardíaca básica e translacional.
Cardiomiócitos de pequenos mamíferos, como roedores, e de mamíferos maiores, como porcos ou cães, são comumente isolados pela perfusão coronária do coração com soluções contendo colagens brutas e/ou proteases. Este foi descrito como o método "padrão ouro" para o isolamento do cardiomiócito, resultando em rendimentos de até 70% das células viáveis2. A abordagem também tem sido utilizada com corações humanos, resultando em rendimentos de cardiomiócitos aceitáveis3,,4,5. No entanto, como a perfusão coronária só é viável se o coração intacto ou uma grande cunha miocárdia contendo um ramo da artéria coronária estiver disponível, a maioria dos espécimes cardíacos humanos não são adequados para esta abordagem devido ao seu pequeno tamanho e à falta de vasculatura apropriada. Portanto, o isolamento dos cardiomiócitos humanos é desafiador.
As amostras do miocárdio humano consistem principalmente em pedaços de tecido de tamanho variável (aproximadamente 0,5 x 0,5 x 0,5 cm a 2 x 2 x 2 cm), obtidos através de biópsias endomyocárdias6,mectomias septal7,implantações VAD8, ou de corações explanados9. Os procedimentos mais comuns para isolamento cardiomiocócito começam com picar o tecido usando uma tesoura ou um bisturi. Os contatos célula-células são então interrompidos pela imersão em tampões livres de cálcio ou de baixo cálcio. Isso é seguido por múltiplas etapas de digestão com extratos de enzimas brutas ou enzimas purificadas como proteases (por exemplo, trippsina), colagenase, hialuronidase ou elastase, resultando em desintegração da matriz extracelular e liberação de cardiomiócitos. Em um passo final e crítico, uma concentração fisiológica de cálcio deve ser cuidadosamente restaurada, ou danos celulares podem ocorrer devido ao cálcio-paradoxo10,,11,12. Essa abordagem de isolamento é conveniente, mas geralmente ineficiente. Por exemplo, um estudo descobriu que quase 1 g de tecido miocárdio era necessário para obter um número suficiente de cardiomiócitos adequados para experimentos subsequentes13. Uma possível razão para baixos rendimentos é o método relativamente severo de picar o tecido. Isso pode danificar particularmente os cardiomiócitos localizados nas bordas do pedaço, embora esses miócitos sejam mais propensos a serem liberados por digestão enzimática.
Outro aspecto que pode influenciar a eficiência do isolamento e a qualidade das células obtidas a partir de espécimes humanos é a duração da isquemia tecidual. A maioria dos protocolos menciona o curto tempo de transporte para o laboratório como pré-requisito para bons resultados. Isso restringe o estudo de cardiomiócitos ventriculares humanos a laboratórios com instalações de cirurgia cardíaca próximas. Juntas, essas restrições dificultam a verificação de achados importantes de modelos animais em cardiomiócitos humanos. Protocolos de isolamento aprimorados que permitem altos rendimentos de cardiomiócitos de pequenas quantidades de tecido, de preferência sem danos graves após tempos de transporte prolongados, são, portanto, desejáveis.
Descrito aqui é um protocolo de isolamento baseado na digestão enzimática de finas fatias de tecido miocárdio geradas com um vibratome14,15. Demonstramos que o isolamento de fatias de tecido é muito mais eficiente do que o de pedaços de tecido picados com tesouras. O método descrito não só permite altos rendimentos de cardiomiócitos humanos viáveis de pequenas quantidades de tecido miocárdio, mas também é aplicável a espécimes armazenados ou transportados em solução cardioplégica fria por até 36 h.
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Protocol
Todos os experimentos com ratos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso animal Mittelfranken, Baviera, Alemanha. A coleta e o uso de amostras de tecido cardíaco humano foram aprovados pelos Conselhos de Revisão Institucional da Universidade de Erlangen-Nürnberg e do Bochum ruhr-university. Os estudos foram realizados de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinque. Os pacientes deram seu consentimento por escrito informado antes da coleta de tecidos.
Ratos Wistar fêmeas (150-200 g) foram obtidos comercialmente, anestesiados pela injeção de 100 mg/kg de tiopental-sódio intraperitoneal, e eutanizados por luxação cervical seguido de toracotomia e excisão do coração. Amostras de tecido cardíaco humano foram coletadas do núcleo apical esquerdo-ventricular durante a implantação de dispositivos de assistência mecânica, da mectomia septal, da tetralogia da cirurgia corretiva fallot, ou da parede livre de ventricular esquerda de corações explantados. O protocolo a seguir descreve o isolamento do tecido ventricular humano. O isolamento dos cardiomiócitos de ratos foi realizado em conformidade, mas com enzimas diferentes (ver Tabela de Materiais). Um fluxo de trabalho esquemático do protocolo é ilustrado na Figura 1.
1. Preparação de buffers, soluções e enzimas
- Prepare buffers e soluções conforme listado na Tabela 1.
- Aqueça as soluções 1, 2, 3 e a solução modificada de Tyrode a 37 °C. Armazene a solução de corte a 4 °C até usar.
NOTA: Para 1-2 fatias de miocárdio um total de aproximadamente 15 mL, 8 mL e 5 mL de soluções 1, 2 e 3 são necessárias para o isolamento em um prato de cultura de tecido de 35 mm. Dimensione-se de acordo para isolamentos simultâneos de miócitos em vários pratos. A solução de corte pode ser congelada e mantida a -20 °C por vários meses. - Pesar 1 mg de proteinase XXIV (ver Tabela de Materiais) em um tubo de centrífuga de 15 mL pré-15 mL e armazenar no gelo até o uso. Isto é para processar uma amostra. Aumente a quantidade em conformidade. Não misture a proteína e a colagem.
- Pesar 8 mg de clsi de colagenase (ver Tabela de Materiais) em um tubo de centrífuga de 15 mL pré-15 mL e armazenar no gelo até usar. Isto é para processar uma amostra. Aumente a quantidade em conformidade. Não misture a proteína e a colagem.
ATENÇÃO: Use uma máscara facial ou trabalhe sob um capô de fumaça para evitar a inalação de pó enzimálico.
NOTA: A atividade enzimápica pode variar em lotes diferentes. Portanto, a concentração ideal pode diferir e deve ser determinada com cada enzima recém-adquirida16.
2. Armazenamento e transporte de tecido miocárdio
- Armazene e transporte amostras cardíacas humanas em solução de corte de 4 °C resfriada(Tabela 1).
- Use a mesma solução para processamento de tecidos e fatiamento de vibratome.
NOTA: As biópsias e amostras cirúrgicas do coração devem ser transferidas imediatamente para a solução de corte a 4 °C e podem ser armazenadas ou transportadas a 4 °C por um máximo de 36 h antes da aplicação deste protocolo.
3. Processamento e fatiamento do tecido
NOTA: O protocolo para corte de tecidos segue Fischer et al.15.
- Corte do bloco de tecido
ATENÇÃO: O tecido cardíaco humano é potencialmente infeccioso. Use sempre o desgaste protetor e siga as normas de segurança da sua instituição. Manuseie cuidadosamente as lâminas usadas e descarte em recipientes de segurança.- Coloque a amostra em um prato de cultura de tecido de 100 mm recheado com solução de corte frio de 20 mL e mantenha em uma placa de 4 °C resfriada.
- Remova o excesso de tecido fibroso e gordura epicártica com um bisturi. No caso de uma amostra transmural, remova as camadas de trabeculas e tecidos perto do endocárdio.
NOTA: O tecido fibroso é rígido e parece branco. A gordura é tipicamente macia e parece branca para amarela. As camadas de tecido trabecula e endocárdio podem ser identificadas a partir de sua composição de tecido solto e uma orientação de fibras não-assinadas em comparação com o miocárdio das camadas epicárardias - Para o processamento ideal de vibratome, corte blocos de tecido retangular de aproximadamente 8 mm x 8 mm x 8 mm com um bisturi de uma amostra de tecido maior. Para biópsias menores, pule esta etapa e passe para a incorporação de agarose.
- Incorporando tecido cardíaco em ponto de baixa fusão agarose
- Ferva 400 mg de ponto de baixa fusão em 10 mL de solução de corte em um béquer de vidro.
ATENÇÃO: Use luvas e óculos de segurança para evitar queimaduras. Manuseie vidros quentes apenas com desgaste de proteção térmica. - Encha uma seringa de 10 mL com o gel de agarose quente e dissolvido. Sele a seringa e deixe a agarose equilibrar-se em um banho de água de 37 °C por pelo menos 15 min.
- Use fórceps para colocar a amostra cardíaca aparada ou a biópsia em um prato limpo de cultura de tecido de 35 mm com o epicardium voltado para baixo e remover o excesso de fluido com um cotonete estéril.
- Despeje a agarose equilibrada (passo 3.2.2) sobre o tecido esvaziando a seringa. Proteja o tecido contra o movimento com fórceps enquanto derrama a agarose. Certifique-se de que o tecido está completamente imerso em agarose.
- Coloque imediatamente o prato no gelo e deixe a agarose solidificar por 10 minutos.
- Ferva 400 mg de ponto de baixa fusão em 10 mL de solução de corte em um béquer de vidro.
- Cortando o miocárdio
- Monte uma nova lâmina de barbear no suporte da lâmina do vibratome e calibrar o vibratome ajustando a z-deflexão da lâmina, se possível.
NOTA: Este protocolo usa um vibratome com um dispositivo de calibração assistido por infravermelho para alinhar a lâmina em uma posição horizontal com mínima deflexão z (deflexão medida <0,1 μm). - Use um bisturi para extirpar um bloco de tecido agarose que se encaixe no porta-amostras do vibratome. Para garantir a estabilidade, certifique-se de que o tecido ainda esteja suficientemente imerso em agarose (margens de agarose ≥ 8 mm).
- Fixar o bloco de agarose ao suporte do espécime com uma fina camada de cola cianoacrilato e pressão suave.
- Coloque o porta-amostras com o tecido no banho de vibratome. Encha o banho com solução de corte e mantenha a 4-6 °C durante todo o processamento com gelo esmagado, preenchido no tanque de resfriamento externo do vibratome.
- Gerar fatias de 300 μm de espessura com uma velocidade de avanço de ≤0,1 mm/s, uma frequência oscilante de 80 Hz, uma amplitude lateral de 1,5 mm e um ângulo de lâmina de 15°. Ao manusear as fatias, segure a agarose em vez do próprio tecido para evitar danos teciduais. Armazene as fatias na solução de corte a 4 °C por uma máxima de 2h, se necessário.
NOTA: Os cardiomiócitos são orientados em paralelo ao epicárdio. Por isso, é importante cortar paralelamente ao epicárdio para evitar danos excessivos ao miócito. Recomenda-se descartar as primeiras 1-3 fatias, pois apenas fatias uniformes de espessura constante devem ser usadas para o isolamento. Para biópsias de tecido pequeno, no entanto, descarte apenas a primeira fatia. - Verifique o alinhamento do cardiomiócito sob um microscópio de luz padrão com uma ampliação de 40-100x.
- Monte uma nova lâmina de barbear no suporte da lâmina do vibratome e calibrar o vibratome ajustando a z-deflexão da lâmina, se possível.
4. Digestão tecidual
- Coloque a placa de calor no agitador de laboratório e aqueça-a a 37 °C. Comece o agitador de laboratório a 65 rpm.
- Dissolva a proteína (preparada na etapa 1.3) em 2 mL de solução 1 (etapa 1.1 e 1.2) e incubar a 37 °C até o uso. Não misture a proteína e a colagem.
- Dissolva a colagemnase (preparada na etapa 1.4) em 2 mL de solução 1 (etapa 1.1 e 1.2) e incubar a 37 °C até o uso. Não misture a proteína e a colagem.
ATENÇÃO: Use óculos protetores e luvas, pois enzimas dissolvidas podem causar lesões na pele e nos olhos. - Adicione cloreto de cálcio (CaCl2) à solução contendo colagenase (preparada na etapa 4.3) a uma concentração final de 5 μM.
- Use fórceps para transferir uma fatia de tecido do banho de vibratome para um prato limpo de cultura de tecido de 60 mm recheado com 5 mL de solução de corte pré-moída (passo 1.1 e 1.2) e manter no gelo.
- Remova cuidadosamente a agarose do tecido miocárdio com lâmina ou fórceps.
NOTA: Evite o excesso de tensão e o estresse da tesoura nas fatias do miocárdio, pois podem danificar os cardiomiócitos. - Para realizar a lavagem inicial, coloque um prato limpo de cultura de tecido de 35 mm na placa de calor e encha-o com 2 mL de solução pré-armada (37 °C). Transfira 1-2 fatias de miocárdio para o prato preparado com fórceps. Aspire a solução com uma pipeta de 1 mL e realize as etapas de lavagem 2x para remover os restos da solução de corte.
NOTA: Não aspire as fatias cardíacas. As soluções e as fatias devem permanecer a uma temperatura constante de 35 °C na placa de calor agitada. Ajuste a temperatura da placa de calor, se necessário. - Retire a solução 1 do prato e adicione 2 mL da solução proteinase (passo 4.2). Incubar por 12 min na placa de calor a 65 rpm.
- Lave 2x com 2 mL de solução pré-armada 1 (37 °C).
- Retire a solução 1 do prato e adicione 2 mL de solução de colagenase (etapas 4.3 e 4.4). Incubar pelo menos 30 min na placa de calor a 65 rpm.
- Verifique miócitos individuais gratuitos em 30, 35, 40 min, etc., colocando o prato sob um microscópio leve. Trabalhe rapidamente para evitar um resfriamento significativo da solução.
NOTA: O tempo de digestão necessário pode variar dependendo da constituição do tecido e do grau de fibrose. Assim que o tecido fica visivelmente macio e dissocia prontamente quando puxado suavemente, o tempo ideal de digestão foi atingido. Se houver tecido suficiente disponível, várias fatias podem ser digeridas em paralelo com os tempos variados de digestão. - Quando o tecido for digerido e os miócitos individuais estiverem visíveis (etapa 4.11), lave 2x com 2 mL de solução pré-armada 2 (37 °C) e encha novamente com 2 mL.
5. Dissociação tecidual
- Dissociar as fatias de tecido digerido com fórceps, puxando cuidadosamente as fibras.
- Pipeta cuidadosamente várias vezes com uma pipeta Pasteur de uso único (diâmetro de abertura >2 mm).
NOTA: O uso de fórceps e tubulações pode induzir estresse mecânico e causar danos cardiomiócitos. No entanto, é um passo crucial para a separação das células. Use fórceps finos para minimizar os danos celulares e dissociar cuidadosamente as fatias em pedaços menores. - Verifique se há cardiomiócitos em forma de vara liberados sob o microscópio de luz.
6. Reintrodução da concentração fisiológica de cálcio
- Aumente lentamente a concentração de cálcio de 5 μM para 1,5 mM enquanto agita a 35 °C na placa de calor. Use soluções de estoque cacl2 de 10 mM e 100 mM. Etapas recomendadas: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 μM. Permitir que as células se adaptem aos níveis de cálcio aumentados em intervalos de incubação de 5 minutos entre cada etapa.
- Remova os pedaços de tecido não digerido cuidadosamente com fórceps ou filtre a suspensão celular através de uma malha de nylon com tamanho de poros de 180 μm no final do aumento do cálcio.
7. Remoção de agente de desacoplamento mecânico
- Pare a agitação e remova lentamente um terço da solução (~700 μL) do topo com uma pipeta de 1.000 μL. Evite aspiração dos cardiomiócitos.
NOTA: Se o tecido não digerido for removido, os cardiomiócitos se acumularão no centro do prato, o que facilita a aspiração de solução livre de células. Se não, transfira a solução celular para um tubo de centrífuga de 15 mL e permita que as células sedimentem por 10 minutos a 35 °C, depois aspire 700 μL do supernascedor e descarte, resuspense as células, transfira-as de volta para um prato de cultura de tecido de 35 mm e proceda com o passo 7.2. - Adicione 700 μL de solução 3 às células, retome a agitação na placa de calor e incuba por 10 minutos.
- Repita as etapas 7.1 e 7.2.
- Transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 mL e permita que os cardiomiócitos se sedimentem por um mínimo de 10 minutos e um máximo de 30 minutos à temperatura ambiente ou gire a 50 x g por 1 min. Remova o supernatante completamente e resuspend na solução modificada de Tyrode ou no buffer de experimentação desejado.
NOTA: Os cardiomiócitos podem ser armazenados na solução modificada de Tyrode(Tabela 1) por várias horas a 37 °C e 5% de CO2 antes de usar. - Verifique a qualidade da célula com um microscópio de luz padrão em 40x e 200x de ampliação.
NOTA: Cerca de 30 a 50% dos cardiomócitos devem ser em forma de haste, lisos sem blebs de membrana e exibir estrias cruzadas claras. Apenas 5 a 10% das células viáveis devem apresentar contrações espontâneas.
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Representative Results
Para verificar a eficiência do isolamento, o protocolo foi utilizado com miocárdio de rato e o número resultante de miócitos viáveis foi comparado com os números obtidos pelo isolamento via perfusão coronária e pelo isolamento de pequenos pedaços de tecido (isolamento de pedaços, Figura 2). O isolamento dos pedaços e o isolamento das fatias de tecido foram realizados dos mesmos corações. Para o isolamento via perfusão coronária, no entanto, todo o coração foi usado. A perfusão coronária rendeu cardiomiócitos predominantemente em forma de vara e transversal. Com isolamentos de fatias do miocárdio, observou-se menor proporção de células em forma de vara, mas o número total ainda era alto. Em contraste, após o isolamento de pedaços de tecido, apenas poucas células em forma de vara foram recuperadas (Figura 2A). A citometria de fluxo foi utilizada para comparar quantitativamente os resultados. Devido ao seu tamanho relativamente grande e estriação cruzada, os cardiomócitos normalmente apresentam grandes valores tanto para a dispersão para a frente quanto para o lado. Essas propriedades foram usadas para contar miócitos em forma de vara com um analisador de células citométricas de fluxo, aplicando um esquema simples de gating que discriminava a forma de vara de cardiomiócitos hipercontratados e arredondados. (Figura Suplementar 1). Parcelas de pontos representativas são retratadas em Figura 2B. A análise estatística mostrou contagens distintamente maiores no portão de cardiomiocócito CM1 para isolamento de fatias do que de pedaços de tecido (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, respectivamente; n =3 isolamentos; p < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (Figura 2C). Assim, o isolamento dos cardiomiócitos das fatias de tecido não atinge o rendimento obtido pela perfusão coronária, mas resulta em um número consideravelmente maior de miócitos em forma de vara do que o isolamento de pedaços de tecido, fornecendo células suficientes para experimentos subsequentes. Além da contagem celular, foram quantificados parâmetros estruturais de cardiomiócitos de ratos. Comprimento celular, a largura celular e o comprimento do sarcomere não foram diferentes em células isoladas por perfusão ou de fatias de tecido (comprimento = 110,0 ± 5,4 μm vs. 99,4 ± 3,2 μm, p > 0,05; largura = 33,9 ± 1,9 μm vs. 30,6 ± 1,2 m, p > 0,05, para n = 19 e n = 21 células, respectivamente; comprimento sarcomere = 1,62 ± 0,04 μm vs. 1,68 ± 0,04 μm, p = 0,28, n = 24 e n = 23 células, respectivamente)Figura Suplementar 2A-C). Usando miócitos carregados fluo-4 submetidos à estimulação do campo elétrico17 parâmetros funcionais também foram avaliados (Figura Suplementar 2D–F). Tempo médio de ativação (27,5 ± 1,5 vs. 23,6 ± 2,5 ms, n = 100 vs. n = 31 células; perfusão vs. fatia, p > 0,05) (Figura Suplementar 2D) e encurtamento relativo (12,2 ± 1,1 vs. 11,3 ± 2,5%, n = 42 vs. n= 7 células, perfusão vs. fatia, p > 0,05) (Figura Suplementar 2F) de cardiomiócitos que responderam à estimulação não diferiram significativamente entre os dois grupos. A amplitude transitória de cálcio (ca normalizado máximo2+, F/F0) (Figura Suplementar 2E) foi ligeiramente aumentado em cardiomiócitos isolados de fatias quando comparados aos cardiomiócitos isolados por perfusão (4,9 ± 0,2 vs. 5,7 ± 0,3, n = 104 vs. n = 25 células, perfusão vs. fatia, p. < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (Figura Suplementar 2G). Para avaliar a qualidade celular após o cultivo, foi determinado o percentual de miócitos contraídos em resposta à estimulação do campo elétrico após 48 h na cultura celular17. A fração das células que respondem foi reduzida em aproximadamente metade em ambos os grupos (41,9 ± 3,6% vs. 31,5 ± 2,3%, perfusão vs. fatia, p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (Figura Suplementar 2H).
Em seguida, o protocolo foi aplicado ao miocárdio humano. O número de cardiomiócitos ventriculares humanos isolados em forma de vara e viáveis obtidos a partir de fatias de tecido foi comparado com o número obtido a partir de pedaços de tecido dos mesmos espécimes do miocárdio(Figura 3). Descobrimos que o isolamento das fatias do miocárdio produziu uma grande proporção em forma de vara e apenas uma pequena proporção de cardiomiócitos arredondados(Figura 3A). Contamos miócitos em forma de vara a partir de imagens de campo largo e normalizamos seu número pelo peso molhado do tecido usado para o isolamento. A quantificação mostrou que o isolamento das fatias do miocárdio resultou em um número notavelmente maior de miócitos em forma de vara do que o isolamento de pedaços de tecido (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 células/mg, n = 7 isolamentos, p < 0,05, emparelhado t-test de duas caudas) (Figura 3B). Além disso, a viabilidade foi avaliada com um ensaio de viabilidade MTT14, normalizando a absorção fotométrica formazan à quantidade total de proteína no lysate celular. A quantificação fotométrica confirmou uma viabilidade de miocíte substancialmente maior após o isolamento das fatias do miocárdio (4,76 ± 0,47 vs. 1,09 ± 0,18 AU, n = 3 isolamentos, p < 0,05, emparelhado t-test)(Figura 3C).
No total, o método foi aplicado a espécimes miocárdios de 30 corações humanos com tempos de transporte de até 36 h. De 23 das 30 células viáveis das 30 amostras foram obtidas para experimentos subsequentes (ver também Tabela Suplementar 1). Um exemplo de um experimento mal sucedido (ou seja, <100 células por prato) é mostrado na Figura Suplementar 3. Aqui, a maioria das células não tolerava cálcio extracelular elevado e hipercontratado. Foram avaliadas a contratude em miócitos de 14 isolamentos e, em dois casos, as células não responderam à estimulação elétrica. Note-se que a técnica não só trabalhou com grandes espécimes obtidos de corações adultos, mas também com pequenas biópsias (apenas 40 mg) de corações infantis(Figura Suplementar 4).
Para demonstrar que as células humanas isoladas com o protocolo descrito podem ser submetidas à análise estrutural, elas foram manchadas com alfa-actinina, o canal de cálcio tipo L (LTCC) e o receptor de ryanodina (RyR), bem como a membrana celular e os núcleos, de acordo com um método de coloração descrito recentemente nos miócitos de rato17 (Figura 4). A coloração de alfa-actinina revelou um padrão de linha Z densa e regular e um comprimento médio de sarcomere de 1,92 ± 0,06 μm em cardiomiócitos de repouso (n = 4, Figura 4A). LTCC e RyR apresentaram aglomerados claros e foram, como esperado, colocados perto da membrana celular e túbulos(Figura 4B).
O corante potencialiométrico FluoVolt18 e o corante sensível ao cálcio Fluo-417 foram utilizados para demonstrar que os cardiomiócitos humanos isolados com o protocolo descrito eram excitáveis e poderiam ser utilizados para estudos sobre eletrofisiologia celular ou acoplamento excitação-contração(Figura 5). Foram analisadas formas e duração do potencial de ação (AP)(Figura 5A,B). Os valores de 50% e 90% de duração de AP (APD50: 400,6 ± 41,1 ms, APD90: 748,9 ± 56,6 ms, n = 10 células) estavam na faixa relatada por outros para cardiomiócitos ventriculares de corações humanos falhando4,,6,,7,9. Os transitórios de cálcio registrados pela varredura da linha confocal das células carregadas de Fluo4(Figura 5C,D) mostraram uma clara insolação após a estimulação e uma relação sinal-ruído aceitável. A amplitude transitória de cálcio (máxima F/F0) foi de 2,9 ± 0,5 (n = 31 células). O encurtamento do cardiomiócito por contração pode ser visto no exemplo da deflexão da borda celular inferior, que teve uma média de 4,6 ± 0,8% (n = 31 células).
Figura 1: Fluxo de trabalho do protocolo de isolamento de fatias de tecido cardíaco humano. Blocos de tecido ou biópsias do miocárdio humano (canto superior esquerdo) são incorporados em agarose de ponto de fusão baixa e fatias de 300 μm de espessura são geradas com a lâmina oscilante de um vibratome (meio superior). As fatias são transferidas para um prato de cultura e removidas da agarose circundante (canto superior direito). A digestão tecidual é realizada a ~35 °C e 65 rpm em uma placa aquecida e agitada (meio, esquerda) e inclui: (passo 4.8) Incubação em solução nominalmente livre de cálcio suplementada com proteinase, (passo 4.10) Digestão da matriz extracelular com colagenase, (passo 5) Dissociação e liberação de cardiomiócitos individuais com fórceps e pipetas. (passo 6) Aumento lento da concentração extracelular de cálcio de 5 μM para 1,5 mM em intervalos de 5 min. (passo 7) Remoção stepwise do monoxime de uncoupler mecânico 2,3-butanedione (BDM). Cardiomiócitos humanos em forma de vara e transversais são recuperados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Rendimentos de cardiomiócito de fatia do miocárdio, perfusão e isolamento de pedaços. (A) Micrografias de luz representativas de cardiomiócitos de rato isolados por perfusão coronária (Perfusão), do tecido cortado de vibratome (fatias do miocárdio) ou de tecido picado (pedaços de tecido). (B) Respectivos lotes representativos de ponto de citometria de fluxo de isolamentos cardiomiócitos descritos em A. A área de dispersão lateral (SSC-Area) e a área de dispersão dianteira (FSC-Area) foram utilizadas como indicadores de granularidade e tamanho celular, respectivamente. O esquema de gating do portão CM1 para cardiomiócitos é indicado pela linha preta e as respectivas frações de contagem total em porcentagem são exibidas. (C) Erro padrão das frações de cardiomiócitos (CM1) avaliados pela análise fluxo-citométrica conforme descrito em B a partir de n = 3 isolamentos celulares por grupo. O isolamento de fatias de miocárdio e pedaços de tecido foi realizado a partir dos mesmos corações (emparelhado t-test de duas caudas). O isolamento por perfusão foi realizado a partir de corações inteiros de diferentes animais e comparado pelo teste t de duas caudas não não verificado. *p < 0,05, após correção de comparação múltipla. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação do rendimento e viabilidade dos cardiomiócitos humanos após isolamento de fatias miocáridas e pedaços de tecido picado. (A) Imagem representativa de cardiomiócitos ventriculares humanos tolerantes ao cálcio após isolamento de fatias de tecido. Cardiomiócitos em forma de vara e estriados são predominantes (seta preta), com apenas poucas células arredondadas e hipercontratadas (seta branca). (B) Quantificação de miócitos tolerantes ao cálcio, em forma de vara isolados em paralelo, seja de fatias de miocárdio ou pedaços de tecido contados a partir de micrografias de campo largo e normalizados ao peso úmido do material de entrada (em miligramas) de n = 7 isolamentos emparelhados. (C) Quantificação da viabilidade do cardiomiócito por medição fotométrica da absorvância de corante formazan após o ensaio MTT. A absorvância foi normalizada à quantidade total de proteína, avaliada pelo ensaio BCA de n = 3 isolamentos emparelhados. *p < 0,05, **p < 0,01 (teste t-de duas-caudas emparelhado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Caracterização microestrutural de cardiomiócitos humanos após isolamento. (A) Imagem microscópica confocal representativa após a imunossuagem de alfa-actinina (verde) e mancha nuclear com 4′,6-diamidin-2-fenilôndol (DAPI, azul). O comprimento do sarcomere foi de 1,92 ± 0,06 μm (n = 4 miócitos), determinado pela análise do espectro Fourier. (B) Imagens microscópicas confocal representativas de um coimito de cardiomiócito ventricular humano fixo detido para canal de cálcio tipo L (LTCC) e receptor de ryanodo cardíaco (RyR). A sobreposição de RyR e LTCC (sobreposição) e a coloração da matriz extracelular com agglutina de germe de trigo (WGA, magenta) também são mostradas. Os núcleos estavam manchados com DAPI (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Potencial de ação e cálcio intracelular transitório em miócitos ventriculares humanos. (A) Imagem confocal bidimensional de um cardiomiócito humano isolado carregado com o corante potencialiométrico FluoVolt (verde, comprimento de onda de excitação de 488 nm). A caixa vermelha indica um elemento do sistema t-tubular que foi medido com uma varredura de linha rápida durante a estimulação do campo elétrico a 0,5 Hz. (B) Fluorescência fluoVolt mediada e normalizada na linha de base (F/F0) de cinco potenciais de ação consecutivos obtidos por imagens confocalizadas como descrito em A. (C) Imagem de varredura de linha de um cardiomiócito humano isolado carregado com o corante sensível ao cálcio Fluo-4 AM (comprimento de onda de excitação de 488 nm) ao longo do eixo celular longitudinal. A intensidade da fluorescência é mostrada em valores cinzentos [UA] e os pontos azuis indicam o aumento máximo da intensidade de fluorescência (dF/dtmax) de cada pixel ao longo da linha digitalizada. A taxa amostral foi de 529 Hz. (D) Transitório de cálcio obtido pela média da fluorescência de cada pixel ao longo da linha digitalizada da imagem em C e normalização aos valores da linha de base antes da estimulação (F/F0). Todos os experimentos foram realizados à temperatura ambiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Composição em mmol/L | Suplementos | Ph | Volume necessário em mL |
| Solução 1 | 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glicose, 70 ácido glutamico, 20 taurina, 10 beta-hidroxibutirato, 30 BDM | 2 mg/ml de glésia bovina albumina | 7.3 com KOH | 300 |
| Solução 2 | 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glicose, 70 ácido glutamico, 20 taurina, 10 beta-hidroxibutirato, 0,005 CaCl2,30 BDM | 10 mg/ml de glésia bovina albumina | 7.3 com KOH | 300 |
| Solução 3 | 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glicose, 70 ácido glutamico, 20 taurina, 10 beta-hidroxibutirato, 1,5 CaCl2 | 10 mg/ml de glésia bovina albumina | 7.3 com KOH | 300 |
| Solução modificada de Tyrode | 130 NaCl, 0.4 Nah2PO4, 5.8 NaHCO3, 5.4 KCl, 0.5 MgCl2, 1.5 CaCl2, 25 HEPES, 22 glicose | 2 mg/ml de glésia bovina albumina | 7.3 com NaOH a 5 % DE CO2 | 100 |
| Solução de corte | 138 NaCl, 0.33 Nah2PO4, 5.4 KCl, 2 MgCl2, 0.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glicose, 30 BDM | 7.3 com NaOH | 500 |
Tabela 1: Buffers e Soluções. Composição dos buffers e soluções necessários.
Figura Suplementar 1: Validação do esquema de gating cardiomiócito (CM1). Parcelas de pontos da citometria de fluxo, medindo a área de dispersão para a frente e para o lado (FSC-A, SSC-A) indicando tamanho e granularidade das células detectadas em uma amostra de controle (CTRL) de cardiomiócitos de rato isolados por perfusão e após incubação de cardiomiócitos da mesma preparação para 15 min a 37 °C em solução modificada de Tyrode contendo 100 mM de cálcio (cálcio). O alto cálcio extracelular causa hipercontratação e arredondamento de cardiomiócitos em forma de vara, resultando em uma redução das células (87,6% vs. 6,00%) no portão definido (CM1). Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 2: Características do cardiomiócito isolados por perfusão ou de fatias. O comprimento celular (A) e a largura celular(B) foram determinados a partir de cardiomiócitos de rato fixados diretamente após o isolamento via perfusão ou de fatias do miocárdio por microscopia (n = 19 e n = 21 células, respectivamente). O comprimento do sarcomere (C) foi determinado a partir de imagens microscópicas após a imunossuagem com análise alfa-actinina e Fourier (n = 24 e n = 23 células, respectivamente). O tempo médio de ativação(D),o máximo F/F0 (E) e o encurtamento relativo (F) foram avaliados a partir de cardiomiócitos carregados fluo-4 isolados por perfusão ou de fatias do miocárdio e responsivos à estimulação elétrica (n = 100/31 miócitos em D, n = 104/25 miócitos em E e n = 42/7 miócitos em F). A fração de cardiomiócitos em forma de vara(G)que se contraíram em estimulação elétrica, avaliada pela contagem do número total de células em forma de haste e das células contratuais em dez campos de visão em ampliação de 200x em um microscópio de luz padrão foi avaliada para perfusão e isolamento de fatias (n = 452/276 células, respectivamente). (H) Análise realizada em G mas após 48h de cultivo (n = 371/329 células, respectivamente). Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 3: Isolamento do cardiomiócito humano com baixo rendimento. Imagem representativa do microscópio leve de miócitos de um isolamento com células predominantemente hipercontratadas (azul) ou arredondadas (preto) e apenas poucas células em forma de vara e estriadas (brancas). Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 4: Isolamento cardiomiócito de biópsias cardíacas infantis. (A) Imagem de uma biópsia endomyocárgia (peso molhado aproximadamente 40 mg) obtida durante cirurgia corretiva para tetralogia de Fallot em um bebê. (B) Fatia do miocárdio do tecido mostrado em A,embutido em agarose. (C) Cardiomiócitos isolados de uma fatia do miocárdio, como mostrado em B. Clique aqui para baixar este número.
Tabela Suplementar 1: Dados do paciente humano. Uma lista do número de amostras de pacientes humanos incluídas neste estudo é dada. As amostras foram categorizadas de acordo com os tipos de cirurgia, idade, etiologia da doença e tempo de transporte, com o respectivo número total de amostras e o número de isolamentos de miócitos bem sucedidos. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Embora o isolamento dos cardiomiócitos vivos tenha sido estabelecido há mais de 40 anos e ainda seja um pré-requisito para muitas abordagens experimentais na pesquisa cardíaca, continua a ser uma técnica difícil com resultados imprevisíveis. O isolamento cardiomiocócito através da perfusão das artérias coronárias com solução enzimópica é comumente usado para corações de animais pequenos e produz um grande número de células viáveis. No entanto, isso requer um sistema e experiência relativamente complexos. Além disso, a maioria das amostras de tecido humano não são adequadas para este método, devido ao seu pequeno tamanho ou à ausência de ramos da artéria coronária, o que torna desejáveis novos métodos para o isolamento dos cardiomiócitos humanos. O protocolo descrito aqui baseia-se na geração atraumática de finas fatias de tecido cardíaco, que são então submetidas à digestão enzimática. Pode ser aplicado a amostras de miocárdio de corações animais e miocárdio humano, como núcleos apical da implantação de dispositivo de assistência à esquerda, Biópsias endomiocárdicas da miectomia septal, ou corações explantados (ver Tabela Suplementar 1), e produzem quantidades suficientes de cardiomiócitos viáveis e tolerantes ao cálcio que podem ser usados para experimentos subsequentes, como o cultivo de cardiomioces17.
Uma das principais razões para maiores rendimentos de miócitos de fatias de tecido cortadas por vibratome do que de pedaços de tecido picado pode ser um menor grau de dano de miócito durante o corte. Quando a perfusão coronária não é possível, cortar ou picar a amostra de tecido é necessário para aumentar a superfície de contato para digerir enzimas. As dimensões de fatia de aproximadamente 8 mm x 8 mm x 0,3 mm permitem um bom acesso de enzimas devido a uma relação superfície-volume relativamente grande (~7 mm-1). Utilizando uma tesoura, uma relação superfície-volume semelhante (~6 mm-1) pode ser alcançada picando as amostras em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm x 1 mm x 1 mm. Embora o dano de miócito em fatias e pedaços picados antes da digestão enzimática não tenha sido quantificado, cortar um vibratome provavelmente causa consideravelmente menos danos porque permite o corte suave na direção da fibra. Na verdade, estima-se que em fatias cortadas por vibratome menos de 5% dos miócitos estão danificados19. Os resultados mostram que os cardiomiócitos humanos podem ser isolados de forma muito eficiente com o protocolo fornecido, com uma proporção muito maior de células viáveis em comparação com pedaços de tecido. Isto está de acordo com um protocolo que usou fatias de tecido atrial20. Nosso método produz até 200 miócitos ventriculares tolerantes ao cálcio por miligrama de tecido e fornece a possibilidade de armazenar ou transportar tecido cardíaco por até 36 horas antes do isolamento. Isso torna o protocolo aplicável para laboratórios sem cirurgia cardíaca no local e, assim, amplia as possibilidades de colaborações.
Etapas críticas no protocolo são o processamento correto do miocárdio para fatias em um vibratome e sua digestão, bem como os passos finais de reintrodução e lavagem de cálcio do BDM. Em contraste com outros métodos19,21, o tecido cardíaco é incorporado em agarose com uma baixa temperatura de fusão para evitar movimento durante o procedimento de corte14,15. Isso foi necessário para estabilizar o bloco tecidual e gerar fatias uniformes. Ao incorporar o tecido, a agarose ainda deve ser líquida, mas a temperatura não deve exceder 37-38 °C para evitar danos celulares por hipertermia. Por outro lado, se a agarose estiver muito fria (<35 °C), ela não se liga bem ao bloco tecidual e pode quebrar durante o corte. Para testar a viabilidade do miócito após o processamento do vibratome, sugere-se um simples ensaio MTT que permite uma avaliação rápida da viabilidade celular por microscopia leve e também para quantificação por análise fotométrica14,22. Danos cardiomiócitos também podem ocorrer durante a reintrodução do cálcio extracelular após um período de incubação na solução sem cálcio23,24. Este fenômeno paradoxo do cálcio em células isoladas pode ser mitigado por um lento aumento dos níveis de cálcio para permitir que os cardiomiócitos se adaptem. Esta etapa deve ser realizada cuidadosamente durante a agitação contínua a 35 °C e com intervalos de 5 min. Hipotermia leve (21 °C) aumenta a tolerância ao cálcio dos cardiomiócitos de rato durante a reintrodução, o que está de acordo com os relatórios anteriores25. No entanto, os cardiomiócitos humanos não apresentaram grandes diferenças na tolerância ao cálcio a 35 °C ou 21 °C. O uso de BDM durante o corte, digestão e reintrodução do cálcio previne a contração do miócito e o gasto energético celular, bem como a hipercontratação e, portanto, é protetor. No entanto, para experimentos subsequentes que avaliam a contratilidade cardíaca ou o acoplamento excitação-contração, o BDM precisa ser removido26. Uma lavagem gradual foi aplicada para minimizar hipercontrações espontâneas. O BDM pode ser omitido, mas isso aumentará significativamente a quantidade de miócitos hipercontratados, como observado em experimentos e estudos anteriores6.
O protocolo descrito usa uma solução que contém alto potássio e apenas traços de sódio para digestão. Esta solução deu os maiores rendimentos de cardiomiócitos em forma de vara e estriadas cruzadas. Para digestão enzimática, no entanto, exigiu maior concentração de colagenase (4 mg/mL) em comparação com a digestão na solução normal de Tyrode (1,5 mg/mL). O sódio extracelular elevado pode levar à sobrecarga intracelular de sódio, exacerbando os efeitos negativos do paradoxo do cálcio, reduzindo assim o rendimento celular27. Por isso, sugere-se o uso de soluções com alto potássio e baixo sódio. Uma alta concentração extracelular de magnésio é frequentemente empregada nos protocolos de isolamento cardiomiocócito3,,28, e tem sido demonstrada para reduzir a lesão isquemia-reperfusão29,30 e melhorar a função cardíaca após longos períodos de isquemia fria31. Portanto, a solução aplicada aqui também contém uma alta concentração de magnésio (10 mM). No entanto, foi demonstrado que excitabilidade, força de contração e velocidade de condução podem ser reduzidas por altas concentrações de magnésio32. Embora esses efeitos tenham se mostrado reversíveis, os efeitos sobre cardiomiócitos isolados não podem ser excluídos. Assim, o uso de magnésio em concentrações fisiológicas (1-2 mM), pode resultar em um menor rendimento geral das células, mas melhorar a excitabilidade.
O tempo ideal de digestão é bastante variável, pois a quantidade de matriz extracelular ou fibrose pode variar consideravelmente no miocárdio de falha humana. Caso o tecido ainda esteja firmemente conectado no momento da dissociação, com apenas poucos miócitos viáveis liberados, aumentando o tempo de digestão em passos de 5 minutos e verificando regularmente miócitos livres e recomenda-se a textura das fatias. Se o tecido permanecer indigesto após períodos prolongados (>45 min), recomenda-se aumentar a concentração de colagem em etapas de 1 mg/mL ou testar um lote de enzimas diferente16. Os respectivos valores apresentados neste trabalho podem servir como cartilha para um isolamento robusto dos cardiomiócitos, mas as condições para o rendimento e a viabilidade ideais podem ser refinadas em cada laboratório, levando em conta a grande variabilidade das atividades enzimáticos e constituições teciduais. Uma vantagem do método é que devido às pequenas quantidades de tecido necessário e ao simples fluxo de trabalho em pequenos lotes, vários testes podem ser realizados em paralelo. Assim, um protocolo ideal pode ser alcançado rapidamente.
A geração de fatias de miocárdio de alta qualidade requer um vibratome de alta precisão. A necessidade de um cortador de tecido de alta precisão ou vibratome é uma possível desvantagem do método, pois não está facilmente disponível em todos os laboratórios. O dispositivo utilizado para este estudo é descrito com mais detalhes em outros lugares14,15. Diferentes dispositivos têm sido usados com sucesso para gerar fatias de miocárdio por outros grupos33,34,35. Assim, se as configurações de velocidade de avanço, amplitude da lâmina e frequência de oscilação podem ser atendidas e uma orientação horizontal da lâmina com uma deflexão z abaixo de 0,1 μm estiver disponível, o corte e o isolamento bem sucedidos devem ser viáveis com outras vibratomias. Além disso, o corte de tecidos é elaborado e prolonga significativamente a duração do protocolo (aproximadamente 1-2 h). O uso de BDM como agente de desacoplamento mecânico tem efeitos protetores reduzindo a exposição à energia celular, lesão isquêmica e hipercontratação26,,36,,37. Embora o efeito inotrópico negativo do BDM tenha se mostrado rapidamente reversível após a lavagem38,39, não está claro se o BDM pode ter consequências desconhecidas na função cardiomiócito40. Este estudo mostra que as células podem ser isoladas com alto rendimento após tempos de armazenamento de tecidos de até 36 horas e que os cardiomiócitos humanos podem ser cultivados por até três dias após o isolamento com este método17. Não notamos diferenças funcionais ou estruturais entre miócitos com tempos de armazenamento curtos e longos. No entanto, isso não foi avaliado sistematicamente. Por outro lado, para corações inteiros de coelho, mostrou-se que as diferenças funcionais entre corações frescos e corações expostos à isquemia fria em solução extracelular contendo 30 mM BDM eram insignificantes31, e o mesmo pode ser verdade neste caso.
O protocolo apresentado fornece uma base sólida para todos os tipos de experimentos com cardiomiócitos ventriculares isolados e pode ser especialmente valioso para pesquisas em amostras de miocárdio humanos. Com algumas adaptações, o isolamento de outras células cardíacas, como fibroblastos ou células endoteliais também parece possível41. Por exigir apenas pequenas quantidades de tecido que podem ser enviados em solução de armazenamento a frio de outros laboratórios, a aplicação do protocolo pode reduzir o número de animais de laboratório sacrificados. Na verdade, o protocolo foi aplicado com sucesso ao tecido cardíaco de coelho e suíno. Além disso, à medida que os experimentos com fatias de tecido miocárdio cultivadas a longo prazo aumentam21,,33,42 e são constantemente melhorados para fornecer condições ideais de cultura15,,43,44, o método pode ser prontamente aplicado após o cultivo da fatia. O isolamento de células únicas do miocárdio cultivado pode, portanto, ajudar a caracterizar alterações nos cardiomiócitos após intervenções farmacológicas ou físicas in vitro.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Andreas Dendorfer, do Centro walter-Brendel de Medicina Experimental, LMU Munique, por ajuda com o protocolo de corte. Por fornecer amostras de tecido miocárdio humano gostaríamos de agradecer Ghazali Minabari e Christian Heim do Departamento de Cirurgia Cardíaca do Hospital Universitário Erlangen, Hendrik Milting do Instituto Erich & Hanna Klessmann, Ruhr-University Bochum e Muhannad Alkassar do Departamento de Cardiologia Pediátrica, Hospital Universitário Erlangen. Pelo apoio com a citometria de fluxo, gostaríamos de agradecer a Simon Völkl e colegas do Centro de Pesquisa Translacional (TRC), Hospital Universitário Erlangen. Também gostaríamos de agradecer a Lorenz McCargo e Celine Grüninger do Instituto de Fisiologia Celular e Molecular Erlangen pelo excelente suporte técnico.
Este trabalho foi apoiado pelo DZHK (Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular), pelo Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) do Hospital Universitário da Universidade de Erlangen-Nürnberg, e pela Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
| Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
| CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
| Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
| Glucose | Merck | 50-99-7 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
| L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
| Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
| MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
| FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
| Enzymes | |||
| Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
| Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
| Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
| Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
| Material | |||
| Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
| Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
| Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
| Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
| Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
| TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
| TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
| Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |
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