Denne protokollen validerer en pålitelig, lett-å-utføre og reproduserbar gnagermodell av hjernediffus aksonal skade (DAI) som induserer utbredt hvit materieskade uten kraniebrudd eller kontusjoner.
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en viktig årsak til død og funksjonshemning. Diffus aksonal skade (DAI) er den dominerende skademekanismen hos en stor andel TBI-pasienter som krever sykehusinnleggelse. DAI innebærer omfattende aksonalskade fra risting, rotasjon eller blastskade, noe som fører til rask aksonal strekkskade og sekundære aksonale endringer som er forbundet med en langvarig innvirkning på funksjonell gjenoppretting. Historisk har eksperimentelle modeller av DAI uten fokalskade vært vanskelig å designe. Her validerer vi en enkel, reproduserbar og pålitelig gnagermodell av DAI som forårsaker omfattende hvit materieskade uten kraniebrudd eller kontusjoner.
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en viktig årsak til død og funksjonshemning i USA. TBIer bidrar til ca 30% av alle skaderelaterte dødsfall1,2. De viktigste årsakene til TBI varierer blant aldersgrupper og inkluderer fall, høyhastighetskollisjoner under sport, forsettlig selvskading, motorvognkrasj og angrep1,2,3.
Hjernediffus aksonal skade (DAI) er en bestemt type TBI indusert av rotasjonsakselerasjon, risting eller blast skade av hjernen som følge av ubegrenset hodebevegelse i umiddelbar tid etter skade4,5,6,7,8. DAI innebærer omfattende aksonal skade som fører til langvarig nevrologisk svekkelse som er forbundet med dårlig resultat, tyngende helsekostnader og en 33-64% dødelighet1,2,4,5,9,10,11. Til tross for betydelig nyere forskning på patogenesen av DAI, har det ikke vært en konsensus om beste behandlingstilbud11,12,13,14.
I løpet av de siste tiårene har mange eksperimentelle modeller forsøkt å nøyaktig gjenskape ulike aspekter ved DAI11,12,15,16. Disse modellene har imidlertid begrensninger gitt den unike presentasjonen av DAI sammenlignet med andre fokusskader. Disse tidligere modellene forårsaker ikke bare aksonalskade i hvite substansregioner, men resulterer også i fokale hjerneskader. Klinisk er DAI ledsaget av mikroblødninger, noe som kan utgjøre en viktig årsak til skade på hvit substans.
Bare to dyremodeller har vist seg å gjenskape de viktigste kliniske egenskapene til DAI. Gennarelli og kolleger produserte den første laterale hoderotasjonsenheten i 1982, ved hjelp av rotasjonsakselerasjon for ikke-støt for å indusere koma med DAI i en ikke-menneskelig primatmodell15. Denne primatmodellen brukte kontrollert enkeltrotasjon for akselerasjon og retardasjon for å fortrenge hodet gjennom 60° innen 10-20 ms. Denne teknikken var i stand til å etterligne nedsatt bevissthet og utbredt aksonal skade som lignet effekten av alvorlig TBI observert i menneskelige hjerner. Men primat modeller er svært dyrt4,11,16. Basert delvis på den forrige modellen, ble en grismodell av rotasjonsakselerasjon hjerneskade designet i 1994 (Ross et al.) med lignende resultater14.
Disse to dyremodellene, selv om de produserte forskjellige presentasjoner av typisk patologi, har lagt sterkt til begrepene DAI patogenese. Rask hoderotasjon er generelt akseptert som den beste metoden for å indusere DAI, og gnagere gir en billigere modell for de raske hoderotasjonsstudiene11,16. Her validerer vi en enkel, reproduserbar og pålitelig gnagermodell av DAI som forårsaker omfattende skade på hvit materie uten kraniebrudd eller kontusjoner. Denne nåværende modellen vil muliggjøre bedre forståelse av patofysiologien til DAI og utvikling av mer effektive behandlinger.
Denne protokollen beskriver en gnagermodell av DAI. I DAI forårsaker rotasjonsakselerasjon på hjernen en skjæreffekt som utløser aksonale og biokjemiske endringer som fører til tap av aksonal funksjon i en progressiv prosess. Sekundære aksonale endringer produseres av en rask aksonal strekkskade og er variabel i deres grad og alvorlighetsgrad4,5,10. Innen timer til dager etter den primære skaden, vil biokjemiske endringer…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner takknemlig Dr. Nathan Kleeorin (Institutt for maskinteknikk, Ben-Gurion University of the Negev) for hans hjelp med de biomekaniske målingene. Også, vi takker professor Olena Severynovska, Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko og Evgenia Goncharyk av Institutt for fysiologi, Fakultet for biologi, økologi og medisin, Oles Honchar Dnipro University, Dnipro, Ukraina for hennes støtte og nyttige bidrag til våre diskusjoner.
0.01 M sodium citrate | SIGMA – ALDRICH | ||
2.5% normal horse serum | SIGMA – ALDRICH | H0146 | Liquid |
4 % buffered formaldehyde solution | |||
Anti-Amyloid Precursor Protein, C – terminal antibodyproduced in rabbit | SIGMA – ALDRICH | Lot 056M4867V | |
biotinylated secondary antibody | Vector | BA-1000-1.5 | 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin |
bone-cutting forceps | |||
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine | vector laboratory | ||
embedding cassettes | |||
ethanol 99.9 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
guillotine | |||
Hematoxylin | SIGMA – ALDRICH | H3136-25G | |
Hydrogen peroxide solution | Millipore | 88597-100ML-F | |
Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
paraffine | paraplast plus leica biosystem | Tissue embedding medium | |
phosphate-buffered saline (PBS) | SIGMA – ALDRICH | P5368-10PAK | Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl – 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C. |
Streptavidin HRP | ABCAM | ab64269 | Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry. |
xylene |