Summary
Цель этого протокола состоит в том, чтобы постоянно контролировать динамику процесса отбора островков поджелудочной железы человека и способствующих принимающей против донорских клеток. Это достигается путем пересадки человеческих островков в переднюю камеру глаза (ACE) НОД. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4-Rag2-/-получатель мыши с последующим повторным 2-фотонных изображений.
Abstract
Изображение бета-клеток является ключевым шагом на пути к пониманию трансплантации островка. Хотя различные платформы визуализации для записи биологии бета-клеток были разработаны и использованы in vivo,они ограничены с точки зрения разрешения одной клетки и непрерывных продольных записей. Из-за прозрачности роговицы, передняя камера глаза (ACE) у мышей хорошо подходит для изучения человека и мыши поджелудочной железы островка биологии клеток. Вот описание того, как этот подход может быть использован для выполнения непрерывных продольных записей прививки и реваскуляризации отдельных человеческих островк трансплантатов. Человеческие островки трансплантаты вставляются в ACE, используя NOD. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4-Rag2-/- мышив качестве получателей. Это позволяет провести исследование расширения реципиентных и донорских клеток и внести вклад клеток-реципиентов в содействие инкапсуляции и васкуляризации трансплантата. Кроме того, изложен пошаговая подход к анализу изображений и количественной оценке объема островка или сегментированных сосудов и островковых капсул, образующих клетки-получатели.
Introduction
Сахарный диабет описывает группу метаболических заболеваний, характеризующихся повышенным уровнем глюкозы в крови, как результат недостаточной выработки инсулина в результате потери или дисфункции бета-клеток островков поджелудочной железы, часто сопровождаемых резистентностью к инсулину. Тип 1 (T1D) и диабет типа 2 (T2D) являются сложными заболеваниями, при которых прогрессирующая дисфункция бета-клеток вызывает развитие болезни. T1D осаждается аутоиммунной атаки на бета-клетки, в то время как T2D считается обусловлен метаболических факторов, хотя и с увеличением доказательств низкосортногосистемного воспаления 1. Трансплантация донорских человеческих островков, особенно пациентам с Т1Д, дает возможность обеспечения физиологического гликемического контроля. Тем не менее, нехватка доноров тканей и бедных островок engraftment предотвратил островок трансплантации, чтобы стать основным терапевтическим вариантом. Значительная часть функционального пересадки островка теряется в непосредственной посттрансплантации (24-48 ч) из-за гипоксической, воспалительной, иммуногеннойсреды хозяина 2,,3. Для оценки эффективности методов вмешательства для повышения выживаемости островка необходим постоянный мониторинг таких трансплантаций.
In vivo методы для изображения и отслеживания судьбы пересаженной человеческой поджелудочной железы островки после трансплантации по-прежнему остается проблемой дляисследования диабета 4,5. На сегодняшний день неинвазивные методы визуализации, включая позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), магнитно-резонансную томографию (МРТ) или УЗИ (США), показывают потенциал для количественной и функциональной оценки пересаженных островков вэкспериментальных условиях 5. Однако, учитывая небольшие размеры островка, количественные измерения по этим условиям страдают от недостаточного разрешения. Передняя камера глаза (ACE) в качестве места трансплантации для наблюдения является перспективным неинвазивным решением для визуализации, предлагающим эффективно более высокое пространственное разрешение и частый мониторинг в течение длительныхпериодов времени 6. Этот метод был успешно использован для изучения биологии островка мыши (рассмотрены в Ян и др.7), аутоиммунныеиммунные реакции 8, а также человека островокпрививки 9,10.
Здесь метод трансплантации ACE сочетается с 2-фотонной визуализацией для исследования динамики процесса пересадки островков поджелудочной железы человека путем непрерывных и повторных записей на отдельных островктных трансплантатах в течение 10 месяцев после трансплантации. Многофотонные свойства изображений большей глубины изображения и снижение общего фотоотливов и повреждения фото преодолеть ограничения изображения конфокальные микроскопии11. Количественная оценка флуоресцентной визуализации включает в себя несколько этапов, включая подготовку островка образца, пересадку островка, получение изображений, фильтрацию изображений для удаления шума островка или фона, сегментацию, количественную оценку и анализ данных. Наиболее сложным шагом обычно является разделение или сегментация изображения на несколько частей или областей. Это может включать отделение сигнала от фонового шума или кластеризацию областей вокелей на основе сходства в цвете или форме для обнаружения и обозначения воксельов 3D-тома, который представляет собой островок сосудов, например. После сегментации статистические данные, такие как размеры объема объектов, обычно просты в извлечении. Предоставляется метод количественной оценки и извлечения данных изображений, таких как сегментация и визуализация данных. Особое внимание уделяется удалению аутофторесценции в человеческих островках и различию между островками сосудов и островковых капсул, образующих клетки-реципиенты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Региональный комитет по этике в Лунде, Швеция, одобрил исследование в соответствии с Законом об этическом обзоре исследований с участием людей. Эксперименты на животных проводились в строгом соответствии со шведской этикой экспериментов на животных и были одобрены комитетами по этике Мальмё и Лунда. От 6 до 8 недель иммунодефицит NOD. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. РОЗА-помидор. Rag2-/-) мышей-реципиентов были использованы в качестве получателей для трансплантации человеческихостровков 10.
1. Островная подготовка к трансплантации
- Культурные человеческие островки в CMRL 1066 дополнены 10 мМ HEPES, 2 мМ ЛП-глутамин, 50 мкг/мл гентамицин, 0,25 мкг/мл фунгизон, 20 мкг/мл ципрокслоксацина, 10 мМ никотинамид (NIC) и 10% теплоактивированной человеческой сыворотки при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 и увлажненной воздухе до трансплантации,как описано ранее 12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Островки должны быть свободны от экзокринной ткани и не прикасаться друг к другу в культуре. Экзокринные ткани кажутся полупрозрачными. - В день трансплантации, передача культуры сми, содержащих островки в новую чашку Петри с помощью аспиратора трубки сборки подключен к вытащил стеклянный капилляр.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте трубу из 200 мкл. Окраска задней части чашки Петри помогает сделать островки более легко различимыми под стерео микроскопом. - Используя стерео микроскоп, выберите островки по 20-40 евро за трансплантацию и перенесите в трубку 1,5 мл. Заполните трубку доверху культурными медиа из инкубатора.
- Печать труб с парафиновой пленкой и хранить на льду до трансплантации. Подготовь соответствующую сумму для количества выполненных трансплантаций.
- Кроме того, убедитесь, что инкубатор CO2 доступен в хирургическом зале, чтобы сохранить островки в культуре и забрать их непосредственно перед каждой трансплантацией.
2. Подготовка оборудования для трансплантации и хирургического стола
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть автоматически, а хирургический стол и инструменты дезинфицированы 70% алкоголем.
- Подключите стереотаксис к анестезии через маску для носа и включите грелку.
- Подключите газовый шприц Гамильтона к полиэтиленовой трубе и тупой канюле для глаз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется заполнить все части PBS перед сборкой. Проверьте, в ловушке пузырьков воздуха и удалить, если присутствует. - Прикрепите шприц Гамильтона плотно к столу(рисунок 1a) или подвижному основанию(рисунок 1e)и прикрепите трубку к стерео микроскопу, с канюлей, свисающих (т.е. в положении ожидания).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте хирургическую ленту, потому что это легко удалить и прикрепить. - Приготовьте шприц 1 мл, подключенный к игле 30 G, наполненной раствором бупренорфина 0,1 мг/кг.
- Приготовьте шприц со стерильным PBS. Кроме того, используйте пипетки.
- Отложите в сторону чистую клетку для пробуждения с нагревательной лампой.
3. Анестезия и позиционирование мышей-реципиентов для хирургического вмешательства
ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были выведены и поддерживались в среде, свободной от патогенов, на животных в Лундском университете.
- Обезболить мышь в камере, наполненной 40% O2/60% N2/3% изофлюран и передать анестезированюю мышь на платформу держателя головы на теплой грелке (Рисунок 1a). Проверьте на отсутствие педалей рефлексов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлюран анестезия является предпочтительным методом анестезии для быстрого восстановления после операции. Комната микроскопа должна быть должным образом проветриваема для использования изофлюрана. - Поместите морду мыши в маску анестезии, подключенную к 40% O2/60% N2/0.9%-1.5% изофлюранная анестезия. Используйте большой палец и палец, чтобы поднять голову немного и закрепить его с помощью металлических частей по бокам. Убедитесь, что наушники зафиксировать голову прямо под ушами. Впрыснуть 0,1 мг/кг бупренорфин раствора подкожно на задней части мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бупренорфин используется в качестве анальгетика. - Наклоните голову так, чтобы глаз, на который будет работать, обращен вверх и был близок к исследователю.
- Аккуратно втягивайте веки глаза для пересадки с помощью тупых типсов, высовывайте глаз и свободно зафиксв их парой пинцетов. Убедитесь, что кончики пинцета покрыты полиэтиленовой трубкой, прикрепленной к платформе держателя головы(рисунок 1a, вставка).
- Всегда держите оба глаза мокрыми, применяя каплю стерильных PBS на глаз.
- Перенесите человеческие островки из запечатанной трубки 1,5 мл (раздел 1) в чашку Петри с стерильным PBS и убедитесь, что островки находятся близко друг к другу, чтобы свести к минимуму количество переданных средств массовой информации клеточнойкультуры (рисунок 1c).
- Возьмите 20-30 островков в глазной канюле, соединенных через полиэтиленовые трубки со шприцем Гамильтона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите как можно меньше жидкости, как это возможно с островками. - Повесьте трубки вверх дном и прикрепите к стерео микроскопу(рисунок 1d). Лента трубки тщательно, чтобы островки опускаются до конца трубки к канюле.
4. Процедура трансплантации
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был ранее описан для трансплантации мышей островки6. Здесь представлена слегка измененная процедура.
- Pinch колодки на задние ноги, чтобы убедиться, что мышь спит.
- Затяните типсы, сдерживающие глаз, не нарушая кровоток и нанесите каплю стерильного PBS на глаз.
- Используя 25 G иглы в качестве скальпеля, скошенный вверх, тщательно проникают только половина кончика в роговицу и сделать один боковой разрез. Сделайте отверстие в восходящем углу; отверстие будет печать легче после пересадки (Рисунок 1f).
- Аккуратно поднимите роговицу с канюлей, предварительно нагруженной островками, и медленно нанесите островки в глаз. Избегайте вставки канюли в переднюю камеру, чтобы предотвратить повреждение радужной оболочки глаза, а нажать осторожно против отверстия роговицы (Рисунок 1g). Медленно вытягивать канюлю из ACE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель для объема инъекций 3-8 мл. Если объем слишком большой, он подвергнет глаз излишне высокому внутриглазное давление и может привести к рефлюксу вводимых островков из передней камеры. - При сталкиваются с трудностями с вставкой островков из-за повышенного давления в глазной камере, увеличить место разреза путем укрепления бокового разреза сайта и повторно островки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда, введенные пузырьки воздуха могут быть использованы в качестве держателей пространства. - Нанесите гель для глаз на глаз, ослабьте глазоудерживающих типсов и оставьте мышь на изофлюране в том же положении в течение 8-10 минут, чтобы островки установить.
- Снимите типсы, удерживав веко, и поставьте веко обратно в нормальное положение.
- Снимите мышь с держателя головы и перенесите ее в клетку пробуждения.
- Когда мышь проснется и движется, перенесите ее обратно в оригинальную клетку и держите в корпусе животного до сканирования (не менее 5 дней рекомендуется).
5. Изображение имплантированных человеческих островков с помощью 2-фотонной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Принимая обзор изображения глаза с помощью флуоресценции стереоскопический микроскоп (Рисунок 2a-c) 4-5 дней после трансплантации до 2-фотонной визуализации рекомендуется локализовать островки, представляющие интерес. Избегайте сдерживания глаз слишком плотно это рано после трансплантации. Используйте 2-фотонные изображения 6-7 дней после пересадки.
- Запустите программное обеспечение для приобретения изображений (см. таблицу материалов). В меню«Лазер»активируется лазер Mai Tai (Power »ON» и в меню«Light Path»устанавливает длину волны до 900 нм и применяет минимальную мощность лазера передачи, начиная с 5%-10% лазерной мощности (использовать ползунки).
ПРИМЕЧАНИЕ: При сканировании отрегулируйте мощность лазера по мере необходимости. - Установите зеленые, оранжевые и красные каналы. Сбор излучения света одновременно на трех недесканных детекторов (NDD) с помощью дихронического зеркала (LBF 760) и информации о фильтре выбросов следующим образом: Red/Angiosense 680, 690-730 nm; Зеленый/Автофлюоресценция, 500-550 нм; и оранжевый /помидор, 565-610nm(рисунок 2d).
- Поместите ступень держателя головы на стадию моторизованного микроскопа и соедините газовую станцию с трубами анестезиологии и трубами, подключенными к вентиляционной системе. Включите грелку.
- Обезботь мышь-получателя, перенести на платформу держателя головы, ограничить глаз для визуализации, и управлять бупренорфин решение, как описано выше (шаги 3.1-3.5).
- Отрегулируйте изофлюрановые пары по мере необходимости. Скорость дыхания 55-65 вдохов в минуту (bpm) указывает на оптимальную анестезию. Если анестезия слишком глубокая, скорость будет lt;50 bpm с тяжелым дыханием или задыхаясь; если слишком легкий, скорость будет йgt;70 bpm с поверхностным дыханием. Тщательно следите за мышами во время анестезии при визуальном осмотре каждые 15 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия варьируется от мыши к мыши, между штаммами мыши, и, как время под наркозом прогрессирует13. - Администрирование достаточно глаз гель на глаз, как погружение жидкости между роговицей и хрусталиком, что позволяет ему медленно накапливаться(рисунок 2f, вставить). Избегайте пузырьков воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Боковое освещение с помощью гибкой металлической шланговой лампы рекомендуется регулировать фокус и локализовать островки. - Чтобы визуализировать кровеносные сосуды, введите 100 МКЛ агента визуализации (например, Angiosense 680) внутривенно в хвостовую вену с помощью одноразового инсулина 30 G шприц.
- Врежиме «Приобретение»отрегулируйте размер кадра до 512 x 512 и скорость сканирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более медленное сканирование (т.е. увеличение времени обитаемого времени) улучшит соотношение сигнала к шуму. - В меню«Каналы» отрегулируйте Master Gain для каждого PMT в Вольтах, чтобы усилить сигнал до тех пор, пока изображение не будет видно на экране в режиме сканирования Live. Чем выше это значение, тем более чувствительным становится детектор для сигнала и шума.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно держать значения между 500-800 В. - Вменю «З-стек»определяют начало и конец z-стека, вручную перемещая фокус на верхнюю часть пересадки островка. Сохранить позицию, выбрав "Установить первый". Переместись к последней нижней плоскости, которая может быть сосредоточена в пересадке островка и сохранить положение, выбрав"Set Last". Используйте z-шаг размером 2 мкм.
- Соберите окончательный стек изображений, нажав навкладку «Начатьэксперимент» и сохраните как 8-битный файл C'I (т.е. формат Карла Зейса).
6. Изображение имплантированных человеческих островков с помощью конфокальные микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем, морфология и пластичность пересаженных островков можно оценить путем мониторинга сигнала рассеяния in vivo в отдельном сканировании (т.е. отдельной дорожке) путем обнаружения лазерного заднего света10.
- Вывите основной сплиттер луча (т.е. фильтр LBF) и вдиалоге «Светлыйпуть» навеяли отдельный трек для конфокальной визуализации. Выберите аргоновый лазер с длиной волны 633 нм и обнаружением на той же длине волны, что и лазерный свет. Стеки приобретаются с размером шага 2-3 мкм для сигнала света backscatter.
- Скорректировать настройки z-stack, чтобы убедиться, что для записи всего островка (см. шаг 5.10).
- Приобрети стек изображений и сохраните как 8-битный файл СЗИ.
7. Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага использовалось коммерческое программное обеспечение(см. таблицу материалов).
- Удаление островка аутофторесценции(рисунок 3b)
- В вкладке«Обработка изображений»выберите«арифметикуканала» и тип« ch1-ch2». Это создает новый канал 4 (ch 4); переименовать в"Васкулатуру".
ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый / Autofluorescence канал вычитается из красного / Angiosense канала. - Повторите предыдущий шаг иввест «ch3-ch2»,чтобы создать новый канал (ch 5); переименовать в"Томат (все)".
ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый / Autofluorescence канал вычитается из оранжевого / томатный канал.
- В вкладке«Обработка изображений»выберите«арифметикуканала» и тип« ch1-ch2». Это создает новый канал 4 (ch 4); переименовать в"Васкулатуру".
- Определение островка маска ручного рисования (Рисунок 3c)
- Создайте новую поверхность (синий символ) и в мастере выберите" Редактировать вручную". Держите указатель в режиме«Выберите»и в 3D-представлении unclick «Volume» (под сценой)для визуализации разделов.
- Для облегчения дискриминации границ островка активируйте все каналы, включая ch 1-ch 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оранжевый / Томатный канал полезен для определения границ островка по сигналу капсулы томата. Кроме того, увеличение интенсивности каналов для использования многоканального островка автофлуоресценции и детектор фонового сигнала в качестве руководства. - В вкладке«Рисунок»выберите«Контур»и нажмите«Draw»,чтобы начать рисовать контуры вокруг границы островка, начиная с позиции среза 1.
- Переместись в новое положение среза и повторите контуры рисования. Закончите с последним ломтиком в верхней части островка и в конце, нажав на вкладку«Создайтеповерхность». Обычно достаточно рисовать контуры каждые10-й срез.
- Сегментация"Островоклатура" и"Остров помидор"флуоресценцияс использованием островка маска(рисунок 3d).
- Выберите ранее определенный объект«Островнаямаска», перейдите на вкладкуредактирования (символ карандаша) инажмитена вкладку «Маска все», которая открывает новое окно.
- Выберите ранее названный канал «Vasculature»(ch 4) в меню высадки выбора канала и активируйте опции «Дубликатканала перед нанесением маски », «Constant inside/outside», и установите воксели снаружиповерхности до « 0.000», который создает новый канал; переименовать в" Остров сосуды "(ч 6).
- Повторите шаги 7.3.1 и 7.3.2 и выберите ранее созданный канал"Tomato (все)" (ch 5) в выборе канала падение вниз меню для создания нового канала; переименовать в"Остров помидор"(ч 7).
- Поверхностная визуализация островка сосуда(рисунок 3e)
- Создайте новую поверхность вменю «Сцена»,а в волшебнике выберите«Автоматическое творение».
- Установите исходный канал для ранее созданной"Islet vasculature"(ch 6) и выберите фоновое вычитание. При необходимости можно скорректировать автоматическую оценку порогового значения. Сравните с ответным каналом флуоресценции (например, путем смешивания в/из недавно созданной вкладки поверхности). Продолжить в мастера.
- По желанию используйте фильтры. Например, выберите"Объем"и отрегулируйте фильтр (желтый) в окне, который может удалить выбранные объекты поверхности. Закончите мастера и назовите новый поверхностный объект "Islet vasculature".
- Сегментация сигнала«Островная томатная сосуда»флуоресценции(рисунок 3f)
- В ранее созданном"Острове сосудов" поверхностного объекта перейдите на редактирование вкладки инажмитена вкладку "Маска все", которая открывает новое окно.
- Выберите ранее названный канал "Islet tomato" (ch 7) в выборе канала, опустите меню и установите воксельы внешней поверхности до" 10.000", который создает новый канал; переименовать в" Остров томатной сосуды "(ч 8).
- Сегментация сигналафлуоресценции"Томатная капсула"(рисунок 3g)
- Выберите«Канал арифметика»ввкладке«Обработка изображений» итип « ch7-ch8», создавая новый канал; переименовать в"Томатнуюкапсулу" (ch 9).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сигналфлуоресценции томатов isletвычитается из общего сигнала флуоресценцииislet tomato.
- Выберите«Канал арифметика»ввкладке«Обработка изображений» итип « ch7-ch8», создавая новый канал; переименовать в"Томатнуюкапсулу" (ch 9).
- Поверхностнаярендеринг " Остров томатной сосудоукалы" и "Томатнаякапсула " (Рисунок 3h)
- Следуйте шагу 7.4, и в мастере выберите исходные каналы «Islet tomato vasculature»(ch 8) или «Томатнаякапсула» (ch 9) для создания новых поверхностных объектов соответственно.
- Поверхностная визуализация общей поверхности островка(рисунок 3i)
- Откройте файл backscatter островкаттера и создайте новую поверхность.
- В мастере выберите«Автоматическоетворение» и определите«Регион интересов».
ПРИМЕЧАНИЕ:«Регион интереса»используется для раздяблить сигналы нескольких островков и определить глубину островка, который будет проанализирован (например, верхние 75 мкм). - В"Абсолютной интенсивности"корректировать порог, если это необходимо. Поверхностный объект можно нажать или выключить, чтобы переутомиться с соответствующей интенсивностью канала. Закрой волшебника.
- Количественная оценка(рисунок 3j)
- Выберите созданный объект поверхности вменю «Сцена»и перейдите навкладку «Статистика».
- Для получения подробных объемных данных в выбранном объекте поверхности выберите«Детальную»вкладку и выберите«Конкретныезначения» и«Том»из меню высадки. Чтобы получить общее значение объема выбранного поверхностного объекта, перейдите на вкладку«Подробная»и выберите«Средние значения».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Не помеченные человеческие островки были пересажены в ACE 8-недельной самки NOD. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. РОЗА-помидор. Rag2(ru)мышей-реципиентов. Для предотвращения отторжения тканей человека, иммунодефицит Rag2 нокаут мышей были выбраны в качестве получателей. В этих трансгенных мышей, все клетки и ткани выразили мембраны целевых томатного флуоресценции белка (MT), что позволяет четкое определение получателя и донорской ткани. Повторная визуализация островковых трансплантатов с помощью 2-фотонной микроскопии высокого разрешения может идентифицировать клетки-реципиентыmT, участвующие в процессе прививки, и их динамическую схему миграции.
В целом, трансплантация установки человеческих островков в ACE мышей-реципиентов(рисунок 1a) была похожа на сингенеические пересадки островков мыши в отношении формы и размера островка(рисунок 1b,c). Рисунок 1d,e показывает типичную трансплантацию с детальной схемой, показывающей боковой участок разреза(рисунок 1f)и рассеивание островков в глазную камеру(рисунок 1g)и репрезентативный результат инъекционных островков мыши(рисунок 1h) или человеческих островков(рисунок 1i). Уровень прививки человеческих островков, как правило, был ниже (30%) чем островки мыши (50-70%). Возможной причиной такого расхождения является то, что доступность человеческих островков непредсказуема, как правило, только с уведомлением за 1 день, а также что полученные островки различаются по возрасту донора, ИМТ донора, чистоте (45%-86%) и времени постизоляционной культуры (2-5 дней). В отличие от этого, островки изоляции от мышей можно легко спланировать. Они были изолированы от 6-8-недельных (т.е. молодых взрослых) мышей с высокой чистотой и короткими, ночными временами культуры. Эти расхождения между мышью и человеческим островков трансплантатов должны быть рассмотрены при интерпретации результатов.
В vivo флуоресценции изображения человеческих островк трансплантатов был скомпрометирован значительными помехами от аутофторесценции тканей(рисунок 4). Визуализации процесса реваскуляризации трансплантатов человеческих островк, пересаженных ACE, с помощью агентов визуализации с использованием традиционных длин волн в видимом спектре препятствовало низкое соотношение сигнала к шуму и высокий уровень естественного аутофторесценции островка, иллюстрируется изображениями сканирования в спектральном диапазоне 500-700 нм(рисунок 4a)или чувствительным недесканным детектором ПМТ с фильтром для обнаружения декстрана TR (610-675 нм) (Рисунок 4b). Этот высокий фон не наблюдался в мышь островок трансплантатов (Рисунок 4c). NIR излучающий агент изображений Angiosense 680 показал заметно более высокое соотношение сигнала к фону из-за снижения фонового шума в диапазоне NIR 690-730 нм(рисунок 4d, Рисунок 3a). Дополнительная запись «неиспользованного» канала (т.е. 500–550 нм) может быть использована на более позднем этапе обработки изображений для удаления оставшегося фонового шума, вызванного естественным аутофторесценцией островка. 2-фотон / конфокальные настройки изображений (Рисунок 2d-f) похож наранее описанные из них 6, за исключением использования 900 нм 2-фотон возбуждения и флуоресценции обнаружения Angiosense 680, аутофторесценции, и томатные каналы с недесканированы ПМТ 1-3 (Рисунок 2d). Целесообразно измерить мощность лазерного выхода, достигающих образца для каждой установки микроскопа(рисунок 2e). Кроме того, рекомендуется изначально изображение привитых островков со стереомикроскопией(рисунок 2a-c),что поможет выбрать представляющие интерес островки и избежать 2-фотонной микроскопии изображений неудачной трансплантации.
Цель извлечения количественных данных из многих изображений состояла в том, чтобы устранить потенциальную предвзятость в выборе данных и получить статистическую силу, необходимую для выявления законного эффекта при сравнении экспериментов. Количественная оценка от флуоресцентных изображений островков поджелудочной железы включала несколько этапов, каждый из которых, возможно, повлиял на результаты в другом. Здесь было использовано интерактивное программное обеспечение для визуализации. Он содержит функции, позволяющие визуализировать объем изображения и объекты и идентификации объектов в соответствии с их морфологии или интенсивности. Рисунок 3 иллюстрирует различные шаги в сегментации изображений. Удаление аутофторесценции путем вычитания канала «автофлюоресценции» улучшило соотношение сигнала к шуму(рисунок 3a,b). Граница островка, называемая "островок маска"(рисунок 3c) и соответствующие каналы(рисунок 3d) была определена вручную. Для извлечения количественных данных использовалась сегментация томатного сигнала в островок сосудов и островок капсулы(рисунок3f,g) и окончательная визуализация поверхности(рисунок3e,h, i).
На рисунке 5 показана репрезентативная продольная визуализация сеанса одного и того же человека островка трансплантата в 2 недели, 2 месяца, 5 месяцев и 8 месяцев посттрансплантации в ACE НОД. РОЗА-помидор. Rag2-/- мышь-получатель. Иллюстрированные являются максимальные проекции интенсивности (MIP) изображения первоначально записанных данных RAW (+ Рисунок 5a), обработанные изображения после удаления островка аутофторесценции (Рисунок 5b-e, f-i), и сегментированные объекты островка, включаяqкапсулу (Рисунок 5j,m) или островок сосудов, образующих mTи клетки получателя (красный, рисунок 5n-q) и общий островок vasaturecul (зеленый, рисунок 5n).
Рисунок 1: Трансплантация островков поджелудочной железы в переднюю камеру глаза.
(a) Трансплантация установки с указанием анестезированной мыши фиксированной в стереотаксис держатель головы и открытый глаз (вставка) рядом с подготовленным шприц Гамильтон крепится к столу и стереомикроскоп готов выбрать островки мыши (b) или человеческие островки (c). d)Положение ожидания глазной канюли, загруженной островками. e)Трансплантация в процессе, и (f)схематический рисунок одного бокового разреза, используемого для тщательного подъема роговицы с кончиком глазной канюли и дозирования островков в переднюю камеру(g). Изображение глаза сразу после инъекции островков мыши(h)или человеческих островков(i). Масштабная планка 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 2: Изображение ace-имплантированных трансплантатов островков поджелудочной железы.
a)Экспериментальнаяустановка изображения стерео микроскопа флуоресцентных. Widefield (b)или флуоресцентноеизображение ( c)B6. РОЗА- томатные островки трансплантатов. d)Упрощенная схема траектории излучения света. LBF: фильтр лазерной блокировки (основной сплиттер пучка); LP: Длинный пас; BP: Полоса пройти; PMT: Photomultiplier. e)Мощностьлазерного выхода сильно зависит от длины волны. Диаграмма показывает фактическую мощность лазерного выхода в ваттах (W), связанную с уровнем мощности лазерного луча (%), измеренный для установки микроскопа. Круг: 800 нм, квадрат: 900 нм, треугольник: 1000 нм. (f)Экспериментальная установка изображений, показывающая мышь-получателя с помощью привитых ACE островков (вставки), установленных на моторизованной сцене коммерческим микроскопом. Масштабная планка 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сегментация изображения человеческого островка, привитого в ACE НОД. РОЗА-помидор. Rag2-/- мышь-получатель.
a)Оригинальная запись: Показана 3D визуализация стека изображений человеческого островка с объединенными каналами или оптическими секциями разделенных каналов Angiosense 680 (ch 1), аутофторесценция (ch 2) и томат (ch 3). b)3D визуализация стека изображений с объединенными каналами или оптическими секциями с разделенными каналами "Vasculature" (ch 4) и "Tomato (all)" (ch 5) после удаления аутофторесценции. c)Островная маска (желтая). (d)3D визуализация стека изображений с объединенными или разделенными каналами "островок сосуда" (ch 6, белый), "островок помидор" (ch 7, красный). e)Поверхностный объект "островок сосуда ", созданныйиз ch 6. (f) 3D визуализация стека изображений с объединенными каналами "островок сосудов" (ch 6, зеленый) и "островок томатной сосудатуры" (ч 8, красный). gg) 3D рендеринг "томатной капсулы" (ch 9) после вычитания канала ch 7-ch 8 или оптической секции с объединенными каналами "томатнаякапсула " (ch 9, белый), островок томатной сосудатуры (ch 8, красный) и островка сосуда (ch 6, зеленый). h)поверхностнаявизуализация томатной капсулы (созданной из ch 9) и островка томатной сосудатуры (созданной из ch 8). i)сегментация островка от сигнала backscatter человека, показывающего выбор "Регионинтереса "(слева) и сегментированный поверхностный объект (средний) по сравнению с интенсивностью канала (справа). j)извлечение данных из вкладки статистики. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Аутофторесценция человеческих островков.
Человеческие островки(a,b,d)или островки мыши B6(c)были пересажены в ACE NOD. Rag2-/- или B6 реципиент мышей и вводили с декстран TR ( a -c) или Angiosense 680 изображений агента (d) для визуализации кровеносных сосудов.a а)сканирование трансплантата островка человека в диапазоне от 500-700 нм с 2-фотонным возбуждением на 900 нм. Максимальное изображение проекции изображения (MIP) изображения человека(b)или мыши островка трансплантата(c) возбужденных на 900 нм и обнаружены с фильтром TR (610-675 нм) NDD. d)MIPтрансплантата островка человека возбужденный на 900 nm и обнаружение с фильтром Angiosense 680 (690-730 nm) NDD. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Пересаженные человеческие островки постепенно переаскуляризируются и инкапсулируются мТ, выражают клетки реципиентного происхождения.
Человеческие островки пересажены в переднюю глазную камеру NOD. РОЗА-помидор. Rag2и реципиент мышей, были изображены неоднократно на срок до 8 месяцев. Angiosense 680 был введен для визуализации сосудов. a)Максимальныепроекции интенсивности (MIP) исходных записанных RAW данных сплита (сосуды, аутофторесценция, мТ) или слитых каналов и сигнала света на 5 месяцев после пересадки. MIPS общей васкулатуры в одиночку (b-e)или слились с мембранно-целевой томатной флуоресценцией(mT) (f-i)после удаления островка автофлюренции (зеленый, a). 3D визуализации сегментированных островок томатной капсулы(j-m)и островка томатной сосудатуры (красный) или общей островка сосуда (зеленый)(n-q) в указанные моменты времени посттрансплантации. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представлен метод изучения процесса пересадки клеток поджелудочной железы человека путем наблюдения за вовлечением реципиентной и донорской ткани. После минимальной инвазивной операции имплантации человеческих островков в переднюю камеру иммунодефицитного мышиного глаза, мышь быстро восстанавливается в течение нескольких минут после операции. Процедура проводится на одном глазу. Как правило, с 5-7 дней после пересадки и далее роговица достаточно исцелил для выполнения интравитальной визуализации.
В этом протоколе, качество человеческих островок трансплантатов имеет решающее значение. Качество островка человека и, таким образом, результат трансплантации могут варьироваться в зависимости от возраста донора, ИМТ и процесса изоляции, а также времени островка культуры до и после прибытия. Человеческие островки, обработанные из поджелудочной железы донора органов, одобренные для клинической трансплантации и исследовательских целей, использовались с согласия доноров. Они были получены после процесса пищеварения поджелудочной железы и очистки островка описаны в другомместе 12. Как и изолированные островки мурина, эти островки подвергаются ряду клеточных нападений, таких как ишемия, механический стресс, потеря подвальных белков, и частичное нарушение внутри островковых эндотелиальных клеток (ЭК) во время энзиматическойпищеварения шаг 14,15. Несмотря на постоянное улучшение культурных условий и восстановление большого количества высококачественных человеческих островков, время трансплантации остается критическим фактором. В первые дни культуры, человеческие островки показывают значительную потерю внутри островков ECs и на шесть дней культуры только небольшие эндотелиальные структуры в ядре островка могут бытьобнаружены 16. Эта потеря внутри островковых эндотелиальных клеток может представлять собой критический фактор в снижении прививки человеческих островков, потому что донорские островки ЭК являются важными игроками в процессе реваскуляризации17.
Поддержание стерильности во время процедуры трансплантации имеет решающее значение, чтобы избежать глазных инфекций в ослабленном иммунитетом NOD. РОЗА-помидор. Rag2-/- мыши. Как правило, процедуры трансплантации проводятся в чистых условиях с использованием перчаток, лабораторного пальто, головной крышки и маски для рта, но не внутри шкафа биобезопасности. Все использованные растворы являются стерильными фильтрованными, а шприцы, канюли, трубки и марля промываются 70% этанола. Пробуждение клетки autoclaved. Хотя полная стерильность не может быть гарантирована из-за ручного обращения с мышью во время процедуры, островок загрязнения или глазных инфекций не были проблемы с этой процедурой.
Стабильная и адекватная анестезия является важным и критическим фактором для уменьшения движений глаз и дрейфа во время получения данных низкой частоты кадров, и эффективность может варьироваться между различными обезболивающимиагентами 18. Под светом, общей изофлюрановой анестезией, глаз время от времени движется медленно и увеличивается глубина анестезии (от 1 до 2%) может, как правило, уменьшить движения глаз. Явным преимуществом использования ингаляционной анестезии является ее быстрый эффект и время восстановления. Следует отметить, однако, что использование изофлюран может изменить секрецию инсулина19.
Анализ изображений и сегментация, или разделение изображения на несколько регионов, являются сложными и подвержены потенциальному уклону в выборе данных20. Сегментация направлена на определение объектов, таких как "островок васкулатуры" для количественной оценки. Здесь методы, основанные на пороге интенсивности, применялись для выбора регионов (т.е. "абсолютной интенсивности") или различий интенсивности для найдите края (т.е. "фоновое вычитание"). В настоящее время универсальных решений для сегментации флуоресцентной микроскопии не существует. Один из подходов заключается в эксперименте с коммерческим программным обеспечением, которое поддерживает целый ряд методов. Если пороговое значение не удается из-за изменения интенсивности фона, то небольшие изменения в настройках захвата изображения могут улучшить результаты сегментации.
Ограничение метода заключается в том, что человеческий трансплантат быстрее заменяется клетками-получателями и, по сути, полностью воссоздается эндотелиальными клетками получателя мыши. Это исключило бы изучения взаимодействий людских клеток если цель изучить adoptively перенесенные людские иммунные клетки мигрирующие в parenchyma островка через взаимодействия с людскими endothelial клетками. Однако, как в мыши и человека островок трансплантатов, аналогичные реваскуляризации происходит от получателя и следует различным анатомическим 3D план, характерный для вида.
Показатели успешности заместительной терапии бета-клеток продолжаютулучшаться. Тем не менее, различные проблемы в оценке эффективности прививки островка и выживания in vivo остаются нерешенными из-за отсутствия соответствующих интравитальных технологий визуализации. Передняя глазная камера является полезным местом трансплантации, поддерживая повторную и долгосрочную визуализацию островковых клеток для изучения морфологии островка, моделей васкуляризации, функции бета-клеток и смерти бета-клеток при клеточном разрешении.
Протокол для изучения процесса прививки человеческих островков трансплантации в месте трансплантации ACE сообщили здесь позволяет продольный мониторинг человеческих островков трансплантатов со значительно более высоким разрешением, чем полученные с другими альтернативными продольнымиплатформами, такимикакМРТ 21 ,22, ПЭТ23, SPECT24, или Биолюминесценция25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Шведским исследовательским советом, Стратегическим исследовательским районом Экзодиаб, Dnr 2009-1039, Шведским фондом стратегических исследований Dnr IRC15-0067 в LUDC-IRC, Королевским физикографическим обществом в Лунде, Diabetesf'rbundet и Barndiabetesf'rbundet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al.
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
