Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.
Abstract
Die Bildgebung von Betazellen ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Letentransplantation. Obwohl verschiedene Bildgebungsplattformen für die Aufzeichnung der Beta-Zellbiologie entwickelt und in vivogenutzt wurden, sind sie in Bezug auf die Zulassung von Einzelzellauflösung und kontinuierlichen Längsaufnahmen begrenzt. Aufgrund der Transparenz der Hornhaut eignet sich die vordere Augenkammer (ACE) bei Mäusen gut, um die Biologie der menschlichen und Mauspankreasinsel zu untersuchen. Hier ist eine Beschreibung, wie dieser Ansatz verwendet werden kann, um kontinuierliche Längsschnittaufnahmen von Transplantationen und Revaskularisation enterblichen menschlichen Islettransplantaten durchzuführen. Menschliche Islettransplantate werden mit NOD in den ACE eingeführt. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-Mäuse als Empfänger. Dies ermöglicht die Untersuchung der Expansion von Empfänger- gegen Spenderzellen und den Beitrag von Empfängerzellen zur Förderung der Verkapselung und Vaskularisation des Transplantats. Darüber hinaus wird ein Schritt-für-Schritt-Ansatz für die Bildanalyse und Quantifizierung des Ischenvolumens oder der segmentierten Vaskulatur und der Isletkapsel bildenden Empfängerzellen skizziert.
Introduction
Diabetes mellitus beschreibt eine Gruppe von Stoffwechselerkrankungen, die durch erhöhte Blutzuckerwerte gekennzeichnet sind, als Ergebnis unzureichender Insulinproduktion durch Verlust oder Dysfunktion von Betazellen der Pankreas-Islet, oft begleitet von Insulinresistenz. Typ-1 -Diabetes (T1D) und Typ-2-Diabetes (T2D) sind komplexe Krankheiten, bei denen die fortschreitende Dysfunktion der Betazellen die Entwicklung von Krankheiten verursacht. T1D wird durch einen Autoimmunangriff auf die Beta-Zellen gefällt, während T2D als durch metabolische Faktoren angetrieben wird, wenn auch mit zunehmenden Beweisen für eine niedriggradige systemische Entzündung1. Die Transplantation von menschlichen Spenderinseln, insbesondere für T1D-Patienten, bietet das Potenzial zur physiologischen glykämischen Kontrolle. Ein Mangel an Gewebespendern und eine mangelhafte Islet-Transplantation haben jedoch verhindert, dass die Letentransplantation zu einer gängigen therapeutischen Option wird. Ein erheblicher Teil des funktionellen Islettransplantats geht in der unmittelbaren Posttransplantationsphase (24–48 h) aufgrund der hypoxischen, entzündlichen, immunogenen Wirtsumgebung2,3verloren. Um die Effizienz der Interventionsmethoden zur Verbesserung des Überlebens der Leten zu bewerten, ist eine kontinuierliche Überwachung solcher Transplantationen erforderlich.
In-vivo-Techniken, um das Schicksal transplantierter menschlicher Pankreasinseln nach der Transplantation abzubilden und zu verfolgen, bleibt für die Diabetesforschung nachwie voreine Herausforderung 4,5. Bislang zeigen nichtinvasive bildgebende Verfahren, einschließlich Positronenemissionstomographie (PET), Magnetresonanztomographie (MRT) oder Ultraschall (US), Potenzial für die Quantifizierung und funktionelle Bewertung transplantierter Inselchen unter experimentellen Bedingungen5. Angesichts der geringen Isätsgrößen leiden quantitative Messungen nach diesen Modalitäten jedoch unter unzureichender Auflösung. Die Vorderkammer des Auges (ACE) als Transplantationsstelle zur Beobachtung ist eine vielversprechende nichtinvasive bildgebende Lösung, die eine effektiv höhere räumliche Auflösung und häufige Überwachung über lange Zeiträumebietet 6. Diese Methode wurde erfolgreich genutzt, um Maus Inselbiologie zu studieren (überprüft in Yang et al.7), Autoimmunimmunreaktionen8, sowie menschliche Insel Pfropfung9,10.
Hier beiderageniert wird die ACE-Transplantationsmethode mit einem 2-Photon-Bildgebungsansatz, um die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantatprozesses durch kontinuierliche und wiederholte Aufnahmen an einzelnen Islettransplantaten bis zu 10 Monate nach der Transplantation zu untersuchen. Die Multiphotonen-Bildgebungseigenschaften größerer Bildtiefe und reduzierter Photobleich- und Fotoschäden überwinden die bildgebenden Grenzen der konfokalen Mikroskopie11. Die Quantifizierung der fluoreszierenden Bildgebung umfasst mehrere Phasen, einschließlich der Vorbereitung von Inselproben, der Inseltransplantation, der Bildaufnahme, der Bildfilterung zur Entfernung von Inselrauschen oder -hintergrund, der Segmentierung, Quantifizierung und Datenanalyse. Der schwierigste Schritt ist in der Regel die Partitionierung oder Segmentierung eines Bildes in mehrere Teile oder Regionen. Dies kann die Trennung von Signal und Hintergrundrauschen oder Clustering-Bereiche von Voxeln auf der Grundlage von Ähnlichkeiten in Farbe oder Form beinhalten, um Voxel eines 3D-Volumens zu erkennen und zu kennzeichnen, das beispielsweise die Vaskulatur der Islet darstellt. Nach der Segmentierung sind Statistiken wie Objektvolumengrößen in der Regel einfach zu extrahieren. Zur Verfügung gestellt wird eine Methode zur Quantifizierung und Extraktion der Bilddaten, wie Segmentierung und Datenvisualisierung. Besonderes Augenmerk wird auf die Entfernung der Autofluoreszenz bei menschlichen Inselchen und die Unterscheidung zwischen Inselvaskulatur und Inselkapsel bildenden Empfängerzellen.
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Protocol
Die regionale Ethikkommission in Lund, Schweden, genehmigte die Studie gemäß dem Gesetz über die ethische Überprüfung von Forschung unter Einbeziehung von Menschen. Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit der schwedischen Ethik der Tierversuche durchgeführt und von den Ethikkommissionen von Malmö und Lund genehmigt. 6 bis 8 Wochen alte immundefiziver NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-Tomate. Rag2-/-) Empfängermäuse wurden als Empfänger für die Transplantation menschlicher Inselchen10verwendet.
1. Inselvorbereitung für die Transplantation
- Kultur menschliche Inselchen in CMRL 1066 ergänzt mit 10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 50 g/ml Gentamycin, 0,25 g/ml-Pilzzone, 20 g/ml Ciproxfloxacin, 10 mM Nicotinamid (NIC) und 10 % hitzeinaktiviertes humanes Serum bei 37 °C in 5 %CO2 und befeuchteter Luft bis zur Transplantation, wie zuvorbeschrieben 12.
HINWEIS: Inselchen sollten frei von Exokringewebe sein und sich in der Kultur nicht berühren. Exokringewebe erscheinen durchscheinend. - Übertragen Sie am Tag der Transplantation Kulturmedien, die die Inselchen enthalten, mit einer Aspiratorrohr-Baugruppe, die mit einer gezogenen Glaskapillare verbunden ist, auf eine neue Petrischale.
HINWEIS: Alternativ können Sie eine 200-L-Pipette verwenden. Das Färben der Rückseite der Petrischale trägt dazu bei, dass die Inselchen unter dem Stereomikroskop leichter zu unterscheiden sind. - Mit einem Stereomikroskop wählen Sie 20 bis 40 Inselchen pro Transplantation und übertragen Sie sie in ein 1,5 ml-Rohr. Füllen Sie die Röhre nach oben mit Kulturmedien aus dem Inkubator.
- Versiegeln Sie die Rohre mit Paraffinfolie und lagern Sie sie bis zur Transplantation auf Eis. Bereiten Sie einen angemessenen Betrag für die Anzahl der durchgeführten Transplantationen vor.
- Alternativ können Sie2 sicherstellen, dass im Operationssaal ein CO2-Inkubator zur Verfügung steht, um Inselchen in Kultur zu halten und sie unmittelbar vor jeder Transplantation zu pflücken.
2. Vorbereitung von Transplantationsgeräten und Operationstisch
HINWEIS: Alle chirurgischen Werkzeuge sollten autoklaviert und der Operationstisch und die Instrumente mit 70% Alkohol desinfiziert werden.
- Schließen Sie einen stereotaxic Kopfhalter über eine Nasenmaske an die Anästhesie an und schalten Sie das Heizkissen ein.
- Schließen Sie eine gasdichte Hamilton-Spritze an Polyethylenschläuche und eine stumpfe Augenkanüle an.
HINWEIS: Es wird empfohlen, alle Teile vor der Montage mit PBS zu füllen. Überprüfen Sie, ob die Luftblasen eingeschlossen sind, und entfernen Sie sie, falls vorhanden. - Befestigen Sie die Hamilton-Spritze fest am Tisch (Abbildung 1a) oder eine bewegliche Basis (Abbildung 1e) und befestigen Sie die Schläuche am Stereomikroskop, wobei die Kanüle nach unten hängt (d. h. die Warteposition).
HINWEIS: Verwenden Sie chirurgisches Klebeband, da es leicht zu entfernen und wieder anzubringen ist. - Bereiten Sie eine 1 ml Spritze vor, die mit einer 30 G Nadel verbunden ist, die mit 0,1 mg/kg Buprenorphinlösung gefüllt ist.
- Bereiten Sie eine Spritze mit sterilem PBS vor. Alternativ können Sie eine Pipette verwenden.
- Legen Sie einen sauberen Weckkäfig mit Heizlampe beiseite.
3. Anästhesie und Positionierung von Empfängermäusen für die Operation
HINWEIS: Alle Tiere wurden in einer pathogenenfreien Umgebung in den Tieranlagen der Universität Lund gezüchtet und gepflegt.
- Anästhetisieren Sie die Maus in einer Kammer gefüllt mit 40% O2/60% N2/3% Isofluran und übertragen Sie die anästhesierte Maus auf die Kopfhalterplattform auf einem warmen Heizpad (Abbildung 1a). Prüfen Sie, ob keine Pedalreflexe mehr zur Zeit sind.
HINWEIS: Isoflurane Anästhesie ist die bevorzugte Methode der Anästhesie für eine schnelle Genesung nach der Operation. Der Mikroskopraum muss für die Verwendung von Isofluran ordnungsgemäß belüftet werden. - Legen Sie die Schnis der Maus in die Anästhesiemaske, die mit 40% O2/60% N2/0,9%–1,5% Isoflurananästhesiemaschine verbunden ist. Verwenden Sie Daumen und Finger, um den Kopf leicht nach oben zu heben und ihn mit den Metallteilen an den Seiten zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Ohrhörer den Kopf direkt unter den Ohren fixieren. 0,1 mg/kg Buprenorphinlösung subkutan auf der Rückseite der Maus injizieren.
HINWEIS: Buprenorphin wird als Schmerzmittel verwendet. - Neigen Sie den Kopf so, dass das zu operierende Auge nach oben zeigt und dem Forscher nahe ist.
- Ziehen Sie vorsichtig die Augenlider des Auges zurück, um mit stumpfer Zange transplantiert zu werden, knallen Sie das Auge heraus und fixieren Sie locker mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Pinzette mit einem Polythenrohr bedeckt sind, das an der Kopfhalterplattform befestigt ist (Abbildung 1a, Einsatz).
- Halten Sie immer beide Augen nass, indem Sie ein Tröpfchen sterilen PBS auf das Auge auftragen.
- Übertragen Sie die menschlichen Inselchen aus dem versiegelten 1,5 ml Rohr (Abschnitt 1) auf eine Petrischale mit sterilem PBS und stellen Sie sicher, dass die Inselchen nahe beieinander liegen, um die Menge der übertragenen Zellkulturmedien zu minimieren (Abbildung 1c).
- Nehmen Sie 20-30 Inselchen in der Augenkanüle auf, die über Polythene-Schläuche mit der Hamilton-Spritze verbunden ist.
HINWEIS: Nehmen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich mit den Inseln auf. - Hängen Sie die Schläuche auf den Kopf und befestigen Sie sie am Stereomikroskop (Abbildung 1d). Kleben Sie die Schläuche sorgfältig, damit die Inselchen bis zum Ende der Röhre in Richtung der Kanüle sinken.
4. Transplantationsverfahren
HINWEIS: Diese Methode wurde zuvor für die Transplantation von Mausinseln6beschrieben. Hier wird ein leicht modifiziertes Verfahren vorgestellt.
- Kneifen Sie die Pads an den Hinterbeinen, um sicherzustellen, dass die Maus schläft.
- Ziehen Sie die Zange, die das Auge zurücksperrt, ohne den Blutfluss zu stören, und tragen Sie ein Tröpfchen steriler PBS auf das Auge auf.
- Mit einer 25 G Nadel als Skalpell nach oben abschrägen, vorsichtig nur die Hälfte der Spitze in der Hornhaut durchdringen und einen einzigen seitlichen Schnitt machen. Machen Sie das Loch in einem Aufwärtswinkel; das Loch wird nach der Transplantation leichter versiegeln (Abbildung 1f).
- Heben Sie die Hornhaut vorsichtig mit der mit Inselchen vorinstallierten Kanüle an und tragen Sie die Inselchen langsam ins Auge. Vermeiden Sie das Einsetzen der Kanüle in die vordere Kammer, um eine Beschädigung der Iris zu verhindern, sondern drücken Sie vorsichtig gegen die Hornhautöffnung (Abbildung 1g). Ziehen Sie die Kanüle langsam vom ACE ab.
HINWEIS: Ziel für ein Injektionsvolumen von 3–8 l. Wenn das Volumen zu groß ist, setzt es das Auge einem unnötig hohen Augeninnendruck aus und kann zu einem Rückfluss der injizierten Inselchen aus der vorderen Kammer führen. - Bei Schwierigkeiten beim Einsetzen der Inselchen aufgrund des erhöhten Drucks in der Augenkammer, vergrößern Sie die Einschnittstelle durch Verstärkung der seitlichen Einschnittstelle und erneute Anwendung der Inselchen.
HINWEIS: Gelegentlich können eingeführte Luftblasen als Raumhalter verwendet werden. - Tragen Sie Augengel auf das Auge auf, lösen Sie die augenberuhigenden Zangen und lassen Sie die Maus auf Isofluran in der gleichen Position für 8–10 min, um die Inselchen setzen zu lassen.
- Entfernen Sie die Zange, die das Augenlid hält, und bringen Sie das Augenlid wieder in seine normale Position.
- Entfernen Sie die Maus aus dem Kopfhalter und übertragen Sie sie in einen Weckkäfig.
- Wenn die Maus wach ist und sich bewegt, übertrage sie zurück in den ursprünglichen Käfig und halte bis zum Scannen im Tiergehäuse auf (mindestens 5 Tage werden empfohlen).
5. Bildgebung von implantierten menschlichen Inseln durch 2-Photonenmikroskopie
HINWEIS: Es wird empfohlen, die interessierten Inselchen 4–5 Tage nach der Transplantation 4–5 Tage nach der Transplantation mit einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 2a–c) zu erstellen. Vermeiden Sie es, das Auge so früh nach der Transplantation zu fest zu halten. Verwenden Sie 2-Photonen-Bildgebung 6–7 Tage nach der Transplantation.
- Starten Sie die Bildaufnahmesoftware (siehe Tabelle der Materialien). Aktivieren Sie im Menü"Laser" den Mai Tai Laser (Power "ON") und im Menü "Lichtpfad" die Wellenlänge auf 900 nm und wenden Sie eine minimale Übertragungslaserleistung ab 5%–10% Laserleistung an (verwenden Sie Schieberegler).
HINWEIS: Stellen Sie beim Scannen die Laserleistung nach Bedarf ein. - Setzen Sie grüne, orange und rote Kanäle. Sammeln Sie Emissionslicht gleichzeitig auf drei nicht descanned Detektoren (NDD) mit einem dichronen Spiegel (LBF 760) und Emissionsfilterinformationen wie folgt: Rot/Angiosense 680, 690–730 nm; Grün/Autofluoreszenz, 500–550 nm; orange/Tomato, 565–610nm (Abbildung 2d).
- Stellen Sie die Kopfhalterstufe auf die motorisierte Mikroskopstufe und schließen Sie die Gasmaske an die Schläuche der Anästhesiemaschine und der mit dem Lüftungssystem angeschlossenen Schläuche an. Schalten Sie das Heizkissen ein.
- Anästhesisieren Sie die Empfängermaus, übertragen Sie sie auf die Kopfhalterplattform, halten Sie das Auge für die Bildgebung zurück und verabreichen Sie buprenorphinlösung wie oben beschrieben (Schritte 3.1–3.5).
- Stellen Sie isoflurane-Dämpfe nach Bedarf ein. Eine Atemrate von 55 bis 65 Atemzügen pro Minute (bpm) deutet auf eine optimale Anästhesie hin. Wenn die Anästhesie zu tief ist, wird die Rate <50 bpm mit schwerem Atmen oder Vergasen sein; wenn zu leicht, wird die Rate >70 bpm mit oberflächlicher Atmung sein. Sorgfältige Überwachung von Mäusen während der Anästhesie durch visuelle Inspektion alle 15 min.
HINWEIS: Die Anästhesisierung variiert von Maus zu Maus, zwischen Mausstämmen und mit fortschreitender Zeit unter Anästhesie13. - Verabreichen Sie genügend Augengel auf das Auge als Tauchflüssigkeit zwischen der Hornhaut und der Linse, so dass es sich langsam ansammeln kann (Abbildung 2f, einfügen). Vermeiden Sie Luftblasen.
HINWEIS: Seitenbeleuchtung mit einer flexiblen Metallschlauchlampe wird empfohlen, um den Fokus einzustellen und Islettransplantate zu lokalisieren. - Zur Visualisierung der Blutgefäße werden 100 l des Bildgebungsmittels (z. B. Angiosense 680) intravenös in die Schwanzvene mit einer Einweg-Insulin-30-G-Spritze verabreicht.
- Passen Sie imErfassungsmodusdie Bildgröße auf 512 x 512 und die Scangeschwindigkeit an.
HINWEIS: Langsamere Scans (d. h. erhöhung der Verweilzeit) verbessern das Signal-Rausch-Verhältnis. - Passen Sie im Menü "Kanäle" Master Gain für jedes PMT in Volt s an, um das Signal zu verstärken, bis ein Bild im Live-Scanmodus auf dem Bildschirm angezeigt wird. Je höher dieser Wert, desto empfindlicher wird der Detektor signal- und geräuscharm.
HINWEIS: Bewahren Sie vorzugsweise Werte zwischen 500–800 V auf. - Definieren Sie im Menü "Z-Stack" den Anfang und das Ende des Z-Stacks, indem Sie den Fokus manuell an die Spitze des Islettransplantats verschieben. Position speichern, indem Sie "Set First" auswählen. Wechseln Sie zur letzten unteren Ebene, die im Islettransplantat fokussiert werden kann, und speichern Sie die Position, indem Sie"Letzte festlegen"auswählen. Verwenden Sie eine Z-Schritt-Größe von 2 m.
- Sammeln Sie den endgültigen Bildstapel, indem Sie auf die Registerkarte"Experiment starten"klicken und als 8-Bit-CZI-Datei (d. h. im Carl Zeiss-Format) speichern.
6. Bildgebung implantierter menschlicher Inselchen durch konfokale Mikroskopie
HINWEIS: Das Gesamtvolumen, die Morphologie und die Plastizität transplantierter Inselchen können durch Überwachung des In-vivo-Streusignals in einem separaten Scan (d. h. separater Spur) durch Detektion von Laser-Rückstreulicht10beurteilt werden.
- Nehmen Sie den Hauptstrahl-Splitter (d. h. LBF-Filter) heraus und richten Sie im Dialog "Lichtpfad" eine separate Spur für die konfokale Bildgebung ein. Wählen Sie den Argon-Laser mit einer Wellenlänge von 633 nm und einer Detektion bei der gleichen Wellenlänge wie das Laserlicht. Z-Stacks werden mit einer Schrittgröße von 2–3 m für Das Rückstreulichtsignal erworben.
- Passen Sie die Z-Stack-Einstellungen an, um sicherzustellen, dass die gesamte Islet aufzeichnet (siehe Schritt 5.10).
- Erfassen Sie den Image-Stack und speichern Sie ihn als 8-Bit-CZI-Datei.
7. Bildanalyse
HINWEIS: Für diesen Schritt wurde kommerzielle Software (siehe Materialtabelle)verwendet.
- Entfernen der Selbstfluoreszenz der Islet (Abbildung 3b)
- Wählen Sie auf der Registerkarte "Bildverarbeitung" "Kanalarithmetik" und geben Sie "ch1-ch2" ein. Dadurch entsteht ein neuer Kanal 4 (ch 4); Umbenennung in "Vaskulature".
HINWEIS: Der Grün/Autofluoreszenzkanal wird vom Red/Angiosense-Kanal subtrahiert. - Wiederholen Sie den vorherigen Schritt und geben Sie "ch3-ch2" ein, um einen neuen Kanal zu erstellen (ch 5); Umbenennen in "Tomate (alle)".
HINWEIS: Der Grün/Autofluoreszenzkanal wird vom Orange/Tomato-Kanal subtrahiert.
- Wählen Sie auf der Registerkarte "Bildverarbeitung" "Kanalarithmetik" und geben Sie "ch1-ch2" ein. Dadurch entsteht ein neuer Kanal 4 (ch 4); Umbenennung in "Vaskulature".
- Definieren der Skelettmaske durch manuelles Zeichnen (Abbildung 3c)
- Erstellen Sie eine neue Oberfläche (blaues Symbol) und wählen Sie im Assistenten "Manuell bearbeiten" aus. Halten Sie den Zeiger im Modus"Wählen" und deaktivieren Sie in der 3D-Ansicht "Volume" (unter Szene), um Abschnitte zu visualisieren.
- Um die Diskriminierung an der Grenze der Iseue zu erleichtern, aktivieren Sie alle Kanäle, einschließlich ch 1–ch 3.
HINWEIS: Der Orange/Tomaten-Kanal ist nützlich, um Inselränder durch das Tomato Capsule Signal zu definieren. Alternativ können Sie die Kanalintensität erhöhen, um die Autofluoreszenz der Multikanal-Insel und das Hintergrundsignal des Detektors als Anleitung zu verwenden. - Wählen Sie auf der Registerkarte "Zeichnung""Kontur " aus und klicken Sie auf "Zeichnen", um Konturen um den kleinen Rahmen zu zeichnen, beginnend mit Schnittposition 1.
- Wechseln Sie zu einer neuen Slice-Position, und wiederholen Sie Zeichnungskonturen. Beenden Sie das Segment mit dem letzten Slice oben auf der Kleinen und enden, indem Sie auf die Registerkarte "Oberfläche erstellen"klicken. In der Regel reicht es aus, konturen alle10. Scheiben zu zeichnen.
- Segmentierung von "Islet Vasculature" und "Islet Tomato" Fluoreszenz mit Islet-Maske (Abbildung 3d).
- Wählen Sie das zuvor definierte Objekt"Islet-Maske", gehen Sie zur Bearbeitungsregisterkarte (Bleistiftsymbol), und klicken Sie auf die Registerkarte"Maske alle", die ein neues Fenster öffnet.
- Wählen Sie den zuvor benannten Kanal "Vasculature" (ch 4) im Dropdown-Menü der Kanalauswahl und aktivieren Sie die Optionen "Duplizieren Sie den Kanal, bevor Sie Maske anwenden", " Konstanteinnen/außen", und setzen Sie Voxel außerhalb der Oberfläche auf" 0.000", wodurch ein neuer Kanal erstellt wird; Isletvasculature(ch 6) umbenennen.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.3.1 und 7.3.2 und wählen Sie den zuvor erstellten Kanal"Tomate (alle)" (ch 5) im Dropdown-Menü der Kanalauswahl aus, um den neuen Kanal zu erstellen; IsletTomato(ch 7) umbenennen.
- Oberflächenwiedergabe der Ispaltung (Abbildung 3e)
- Erstellen Sie eine neue Oberfläche im Menü "Szene" und wählen Sie im Assistenten "Automatische Erstellung".
- Legen Sie den Quellkanal auf"Islet Vasculature" (ch 6) fest und wählen Sie die Hintergrundsubtraktion aus. Die automatische Schwellenwertschätzung kann bei Bedarf angepasst werden. Vergleichen Sie mit dem antwortenden Fluoreszenzkanal (z. B. durch Ein-/Ausblenden der neu erstellten Oberflächenregisterkarte). Fahren Sie im Assistenten fort.
- Optional verwenden Sie Filter. Wählen Sie beispielsweise "Volumen" und passen Sie den Filter (gelb) im Fenster an, wodurch ausgewählte Flächenobjekte entfernt werden können. Beenden Sie den Assistenten, und benennen Sie das neue Oberflächenobjekt "Islet vasculature".
- Segmentierung von "Islet Tomato Vasculature" Fluoreszenzsignal (Abbildung 3f)
- Wechseln Sie im zuvor erstellten Oberflächenobjekt"Islet vasculature" zur Registerkarte Bearbeiten und klicken Sie auf die Registerkarte"Maske alle", die ein neues Fenster öffnet.
- Wählen Sie den zuvor benannten Kanal "Islet tomato" (ch 7) im Dropdown-Menü der Kanalauswahl und setzen Sie Voxel außerhalb der Oberfläche auf "10.000", wodurch der neue Kanal erstellt wird; Umbenennung in "Islet tomato vasculature" (ch 8).
- Segmentierung von "Tomatenkapsel" Fluoreszenzsignal (Abbildung 3g)
- Wähle "Channel Arithmetic's" in der Registerkarte" Bildverarbeitung" und tippe "ch7-ch8" ein, um den neuen Kanal zu erstellen; Umbenennen in "Tomatenkapsel" (ch 9).
HINWEIS: Das Fluoreszenzsignal "Islet Tomato Vasculature" wird vom gesamten "Islet Tomato" Fluoreszenzsignal subtrahiert.
- Wähle "Channel Arithmetic's" in der Registerkarte" Bildverarbeitung" und tippe "ch7-ch8" ein, um den neuen Kanal zu erstellen; Umbenennen in "Tomatenkapsel" (ch 9).
- Oberflächendarstellung von "Islet Tomato Vasculature" und "Tomato capsule" (Abbildung 3h)
- Folgen Sie Schritt 7.4, und wählen Sie im Assistenten quellkanäle "Islet Tomato Vasculature" (ch 8) oder "Tomato capsule" (ch 9), um neue Oberflächenobjekte entsprechend zu erstellen.
- Oberflächendarstellung der gesamten Isletoberfläche (Abbildung 3i)
- Öffnen Sie die Rückstreudatei der Islet, und erstellen Sie eine neue Oberfläche.
- Wählen Sie im Assistenten "Automatische Erstellung" und definieren Sie " Regionof interest".
ANMERKUNG:"Region of interest" wird verwendet, um die Signale mehrerer Inselchen zu trennen und die Tiefe der zu analysierenden Insel zu definieren (z. B. oben 75 m). - Passen Sie in "Absolute Intensität" den Schwellenwert bei Bedarf an. Das Oberflächenobjekt kann an- oder abgeklickt werden, um es mit der entsprechenden Kanalintensität abzukreuzen. Schließen Sie den Assistenten.
- Quantifizierung (Abbildung 3j)
- Wählen Sie ein erstelltes Oberflächenobjekt im Menü "Szene" aus, und wechseln Sie zur Registerkarte "Statistiken".
- Um detaillierte Volumendaten im ausgewählten Oberflächenobjekt abzurufen, wählen Sie die Registerkarte "Detaillierte" und "Spezifische Werte" und "Volumen" aus dem Dropdown-Menü aus. Um einen Gesamtvolumenwert des ausgewählten Flächenobjekts abzurufen, wechseln Sie zur Registerkarte "Detaillierte" und wählen Sie "Durchschnittswerte".
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Representative Results
Nicht gekennzeichnete menschliche Inselchen wurden in den ACE der 8 Wochen alten Hündin NOD transplantiert. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-Tomate. Rag2-Empfängermäuse. Um eine Abstoßung menschlichen Gewebes zu verhindern, wurden immundefiziende Rag2-Knockout-Mäuse als Empfänger ausgewählt. Bei diesen transgenen Mäusen exprimierten alle Zellen und Gewebe ein membranspezifisches Tomatenfluoreszenzprotein (mT), das eine klare Identifizierung des Empfängers und des Spendergewebes ermöglicht. Die wiederholte Abbildung von Islettransplantaten durch hochauflösende 2-Photonenmikroskopie konnte mT+ Empfängerzellen identifizieren, die am Transplantationsprozess beteiligt sind, und ihr dynamisches Migrationsmuster.
Im Allgemeinen war die Transplantation von menschlichen Inselchen in den ACE der Empfängermäuse (Abbildung 1a) ähnlich wie bei syngenischen Mausinseltransplantationen in Bezug auf Inselform und -größe (Abbildung 1b,c). Abbildung 1d,e zeigt eine typische Transplantation mit einem detaillierten Schaltplan, der die seitliche Einschnittstelle (Abbildung 1f) und die Streuung von Inselchen in die Augenkammer zeigt (Abbildung 1g) und ein repräsentatives Ergebnis injizierter Mausinseln (Abbildung 1h) oder menschlicher Inselchen (Abbildung 1i). Die Pfropfrate menschlicher Inselchen war im Allgemeinen niedriger (30 %) als die von Mausinseln (50–70%). Ein möglicher Grund für diese Diskrepanz ist, dass die Verfügbarkeit menschlicher Inseln unvorhersehbar ist, in der Regel mit nur einer Frist von 1 Tag, und auch, dass die erhaltenen Inseln in Spenderalter, Spender-BMI, Reinheit (45%-86%) und Postisolationskulturzeit (2–5 Tage) variieren. Im Gegensatz dazu können Islet-Isolationen von Mäusen leicht geplant werden. Diese wurden von 6-8 Wochen alten (d.h. jungen Erwachsenen) Mäusen mit hoher Reinheit und kurzen, über Nacht-Kulturzeiten isoliert. Diese Diskrepanzen zwischen Maus- und menschlichen Inseltransplantaten sollten bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden.
In vivo Fluoreszenz-Bildgebung von menschlichen Islettransplantaten wurde durch erhebliche Interferenzen durch Gewebeautofluoreszenz beeinträchtigt (Abbildung 4). Die Visualisierung des Revaskularisationsprozesses von ACE-transplantierten menschlichen Islettransplantaten durch Bildgebungsmittel unter Verwendung traditioneller Wellenlängen im sichtbaren Spektrum wurde durch ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis und ein hohes Maß an natürlicher Islet-Autofluoreszenz behindert. dargestellt durch Bilder eines Scans im Spektralbereich von 500–700 nm (Abbildung 4a) oder durch den empfindlichen nicht descanned PMT-Detektor mit Filter zur Detektion von Dextran TR (610–675 nm) (Abbildung 4b). Dieser hohe Hintergrund wurde bei Mausinseltransplantaten nicht beobachtet (Abbildung 4c). Das NIR emittierende Bildgebungsmittel Angiosense 680 zeigte ein sichtbar höheres Signal-Hintergrund-Verhältnis aufgrund von Abnahmen des Hintergrundrauschens im NIR-Bereich 690–730 nm (Abbildung 4d, Abbildung 3a). Die zusätzliche Aufnahme eines "unbenutzten" Kanals (d.h. 500–550 nm) könnte in einem späteren Bildverarbeitungsschritt verwendet werden, um verbleibende Hintergrundgeräusche zu entfernen, die durch natürliche Inselautofluoreszenz verursacht werden. Die 2-Photon/konfokale Bildgebung Setup (Abbildung 2d–f) ist ähnlich wie zuvor beschrieben6, außer für die Verwendung von 900 nm 2-Photon Anregung und Fluoreszenz-Detektion von Angiosense 680, Autofluoreszenz, und Tomatenkanäle mit nicht descanned PMTs 1-3 (Abbildung 2d). Es ist ratsam, die Laserausgangsleistung zu messen, die die Probe für jedes Mikroskop-Setup erreicht (Abbildung 2e). Weiterhin wird empfohlen, die gepfropften Inselchen zunächst mit Stereomikroskopie abzubilden (Abbildung 2a–c), was bei der Auswahl von Interessierten hilft und 2-Photonenmikroskopiebilder einer erfolglosen Transplantation vermeidet.
Der Zweck der Extraktion quantitativer Daten aus vielen Bildern bestand darin, potenzielle Verzerrungen bei der Datenauswahl zu beseitigen und die statistische Macht zu erlangen, die erforderlich ist, um einen legitimen Effekt beim Vergleich von Experimenten zu erkennen. Die Quantifizierung durch fluoreszierende Bildgebung von Pankreasinseln umfasste mehrere Schritte, von denen jede die Ergebnisse in einem anderen beeinflusst haben könnte. Hier kam interaktive Bildgebungssoftware zum Einsatz. Es enthält Funktionen, die die Visualisierung von Volumenbildern und Objekten und die Identifizierung von Objekten entsprechend ihrer Morphologie oder Intensität ermöglichen. Abbildung 3 zeigt die verschiedenen Schritte in der Bildsegmentierung. Die Entfernung der Autofluoreszenz durch Subtraktion des "Autofluoreszenz"-Kanals verbesserte das Signal-Rausch-Verhältnis (Abbildung 3a,b). Die Ispisegrenze namens "Islet-Maske" (Abbildung 3c) und die entsprechenden Kanäle (Abbildung 3d) wurden manuell definiert. Die Segmentierung des Tomatensignals in die Isletvaskulatur und die Isletkapsel (Abbildung 3f,g) und die endgültige Oberflächenwiedergabe (Abbildung 3e,h,i) wurde verwendet, um quantitative Daten zu extrahieren.
Abbildung 5 zeigt eine repräsentative Längsbildgebungssitzung desselben menschlichen Islettransplantats nach 2 Wochen, 2 Monaten, 5 Monaten und 8 Monaten Nachtransplantation in den ACE eines NOD. ROSA-Tomate. Rag2-/- Empfängermaus. Illustriert sind Projektionen mit maximaler Intensität (MIP) von ursprünglich aufgezeichneten RAW-Daten (Abbildung 5a), verarbeitete Bilder nach der automatischen Fluoreszenzentfernung der Islet (Abbildung 5b–e, f–i) und segmentierte Islet-Objekte einschließlich Kapsel (Abbildung 5j,m) oder Islet Vaskulatur bildend mT+ Empfängerzellen (rot, Abbildung 5n-q) und Gesamtislet Vaskulatur (grün, Abbildung 5n–q).
Abbildung 1: Transplantation von Pankreasinseln in die vordere Kammer des Auges.
(a) Transplantations-Setup zeigt anästhesierte Maus, die in stereotaxic Kopfhalter und das exponierte Auge (Einset) neben der vorbereiteten Hamilton-Spritze am Tisch befestigt und das Stereomikroskop bereit, Maus-Inseln (b) oder menschliche Inselchen (c) zu pflücken (d) Warteposition der augenkanülen mit Inselchen beladen. (e) Transplantation in Bearbeitung, und (f) schematische Zeichnung eines einzigen seitlichen Schnitts verwendet, um sorgfältig die Hornhaut mit der Spitze der Augenkanüle zu heben und geben Inselchen in die vordere Kammer (g). Bild des Auges unmittelbar nach der Injektion von Mausinseln (h) oder menschlichen Inselchen (i). Maßstabsleiste = 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bildgebung von ACE-implantierten Pankreas-Islet-Transplantaten.
(a) Experimentelle fluoreszierende Stereomikroskop-Bildgebung. Widefield (b) oder fluoreszierendes Bild (c) von B6. ROSA-Tomaten-Islet-Transplantate. (d) Vereinfachtes Schema des Emissionslichtwegs. LBF: Laserblockierfilter (Hauptstrahlteiler); LP: Langer Pass; BP: Bandpass; PMT: Photomultiplier. (e) Die Laserausgangsleistung hängt stark von der Wellenlänge ab. Diagramm zeigt die tatsächliche Laserleistung in Watt (W) bezogen auf den Leistungspegel des Laserstrahls (%), gemessen für den Mikroskopaufbau. Kreis: 800 nm, quadratisch: 900 nm, Dreieck: 1.000 nm. (f) Experimentelle bildgebende Einrichtung, die die Empfängermaus mit ACE-gepfropften Inselchen (Einsatz) zeigt, die auf der motorisierten Bühne ein kommerzielles Mikroskop montiert ist. Maßstabsleiste = 100 m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bildsegmentierung einer menschlichen Islet, die im ACE eines NOD transplantiert wird. ROSA-Tomate. Rag2-/- Empfängermaus.
(a) Originalaufnahme: Gezeigt wird eine 3D-Wiedergabe eines Bildstapels einer menschlichen Islet mit zusammengeführten Kanälen oder optischen Abschnitten der geteilten Kanäle Angiosense 680 (ch 1), Autofluoreszenz (ch 2) und Tomate (ch 3). (b) 3D-Rendering von Bildstapeln mit zusammengeführten Kanälen oder optischen Abschnitten mit geteilten Kanälen "Vaskulature" (ch 4) und "Tomato(all)" (ch 5) nach Autofluoreszenzentfernung. (c) Islet-Maske (gelb). (d) 3D-Rendering des Bildstapels mit zusammengeführten oder geteilten Kanälen "Islet Vaskulature" (ch 6, weiß), "Islet Tomato" (ch 7, rot). (e) Oberflächenobjekt "Islet Vaskulature" erstellt aus ch 6. (f) 3D-Rendering des Bildstapels mit zusammengeführten Kanälen "Islet Vaskulature" (ch 6, grün) und "Islet Tomato Vasculature" (ch 8, rot). (g) 3D-Rendering von "Tomatenkapsel" (ch 9) nach Kanalsubtraktion ch 7–ch 8 oder optischem Abschnitt mit zusammengeführten Kanälen "Tomatenkapsel" (ch 9, weiß), Inseltomatenvaskulatur (ch 8, rot) und Inselvaskulatur (ch 6, grün). (h) Oberflächenwiedergabe von Tomatenkapseln (erstellt aus ch 9) und Der Islet-Tomatenvaskulatur (erstellt aus ch 8). (i) Islet-Segmentierung vom Rückstreusignal der menschlichen Insel, das die Auswahl von "Region of Interest" (links) und dem segmentierten Oberflächenobjekt (Mitte) im Vergleich zur Kanalintensität (rechts) anzeigt. (j) Abrufen von Daten aus der Registerkarte Statistik. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Autofluoreszenz menschlicher Inselchen.
Menschliche Inselchen (a,b,d) oder B6 Mouse Inselchen (c) wurden in den ACE von NOD transplantiert. Rag2-/- oder B6-Empfängermäuse und mit Dextran TR (a–c) oder Angiosense 680 Bildgebungsmittel (d) zur Visualisierung von Blutgefäßen injiziert. (a) - Scan des menschlichen Islettransplantats im Bereich von 500–700 nm mit 2-Photonen-Erregung bei 900 nm. Maximale Bildprojektion (MIP) von Human (b) oder MausInsel transplantiert (c) bei 900 nm angeregt und mit dem TR-Filter (610–675 nm) der NDD erkannt. (d) MIP eines menschlichen Ischentransplantats bei 900 nm angeregt und Mit dem Angiosense 680 Filter (690–730 nm) des NDD detektiert. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Transplantierte menschliche Inselchen werden nach und nach revaskularisiert und durch mT-exektierte Zellen mit Empfängerursprung gekapselt.
Menschliche Inselchen, die in die vordere Augenkammer von NOD transplantiert wurden. ROSA-Tomate. Rag2Rag2-Empfängermäuse wurden wiederholt für bis zu 8 Monate abgebildet. Angiosense 680 wurde für die Visualisierung der Vaskulatur injiziert. (a) Maximale Intensitätsprojektionen (Maximum Intensity Projections, MIP) der ursprünglich aufgezeichneten RAW-Daten der Split (Vaskulatur, Autofluoreszenz, mT) oder zusammengeführten Kanälen und des Rückstreulichtsignals nach 5 Monaten nach der Transplantation. MIPS der gesamtvaskulaturen allein (b–e) oder verschmolzen mit membrangezielter Tomatenfluoreszenz (mT) (f–i) nach der Einzelgänger-Autofloureszenzentfernung (grün, a). 3D-Renderings von segmentierten Islet-Tomatenkapseln (j–m) und Einer eiserntomatenvaskulatur (rot) oder der gesamten Isletvaskulatur (grün) (n–q) zu angegebenen Zeitpunkten nach der Transplantation. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Eine Methode wird vorgestellt, um den Prozess der Pfropfzelltransplantation der menschlichen Pankreas-Islet-Zell-Transplantation zu untersuchen, indem die Beteiligung von Empfänger- und Spendergewebe beobachtet wird. Nach einer minimalinvasiven Operation, bei der menschliche Inselchen in die vordere Kammer eines immungeschwächten Mausauges implantiert wurden, erholt sich die Maus innerhalb weniger Minuten nach der Operation schnell. Das Verfahren wird auf einem Auge durchgeführt. In der Regel wird die Hornhaut ab 5–7 Tagen nach der Implantation ausreichend geheilt, um eine intravitale Bildgebung durchzuführen.
In diesem Protokoll ist die Qualität der menschlichen Islettransplantate entscheidend. Die Qualität der menschlichen Leten und damit das Transplantationsergebnis kann je nach Alter des Spenders, Dem BMI und Isolationsprozess sowie der Zeit der Isletkultur vor und nach der Ankunft variieren. Mit Zustimmung der Spender wurden menschliche Inselchen verwendet, die aus Organspender-Pankreasen verarbeitet wurden, die für klinische Transplantationen und Forschungszwecke zugelassen waren. Sie wurden nach einem Prozess der Pankreasverdauung und Der an anderer Stelle beschriebenen Islet-Reinigung erhalten12. Ähnlich wie isolierte murinische Inselchen, unterziehen sich diese Inseln einer Reihe von zellulären Angriffen wie Ischämie, mechanischer Belastung, Verlust von Kellerproteinen und teilweiser Störung von intra-islet Endothelzellen (ECs) während der enzymatischen Verdauung Schritt14,15. Trotz ständig verbesserter Kulturbedingungen und der Erholung einer großen Anzahl hochwertiger menschlicher Inseln bleibt die Zeit bis zur Transplantation ein entscheidender Faktor. Während der ersten Tage der Kultur zeigen menschliche Inselchen einen signifikanten Verlust von Intra-Islet-ECs und an sechs Tagen Kultur können nur kleine endotheliale Strukturen im Inselkern nachgewiesen werden16. Dieser Verlust von intra-islet endotheliale Zellen könnte einen entscheidenden Faktor bei der reduzierten Transplantation von menschlichen Inseln darstellen, da Spenderinsel-ECs wichtige Akteure im Revaskularisationsprozess sind17.
Die Aufrechterhaltung der Sterilität während des Transplantationsverfahrens ist entscheidend, um Augeninfektionen im immungeschwächten NOD zu vermeiden. ROSA-Tomate. Rag2-/- Mäuse. In der Regel werden Transplantationsverfahren unter sauberen Bedingungen mit Handschuhen, Labormantel, Kopfbedeckung und Mundmaske durchgeführt, jedoch nicht innerhalb eines Biosicherheitsschranks. Alle verwendeten Lösungen sind steril gefiltert, und Spritzen, Kanülen, Schläuche und Gaze werden in 70% Ethanol gespült. Wachkäfige sind autoklaviert. Während volle Sterilität kann nicht durch die manuelle Handhabung der Maus während des Verfahrens garantiert werden, Inselkontamination oder Augeninfektionen waren keine Probleme mit diesem Verfahren.
Stabile und adäquate Anästhesie ist ein wichtiger und kritischer Faktor für die Verringerung von Augenbewegungen und Drift bei der Datenerfassung mit niedriger Framerate, und die Wirksamkeit kann zwischen verschiedenen Anästhesiemitteln variieren18. Unter Licht, allgemeine isofluranische Anästhesie, bewegt sich das Auge gelegentlich in einer langsam rollenden Weise und erhöhte Tiefe der Anästhesie (von 1-2%) kann in der Regel Augenbewegungen reduzieren. Der klare Vorteil der Verwendung von inhalierbarer Anästhesie ist seine schnelle Wirkung und Erholungszeit. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass die Verwendung von Isofluran die Insulinsekretion verändern kann19.
Die Bildanalyse und -segmentierung oder die Partitionierung eines Bildes in mehrere Regionen sind eine Herausforderung und unterliegen einer potenziellen Verzerrung bei der Datenauswahl20. Die Segmentierung zielt darauf ab, Objekte wie die "Islet Vaskulatur" für die Quantifizierung zu identifizieren. Hier wurden Methoden, die auf dem Intensitätsschwellenwert basierten, auf ausgewählte Regionen (d. h. "absolute Intensität") oder Intensitätsunterschiede angewendet, um Kanten zu finden (d. h. "Hintergrundsubtraktion"). Derzeit gibt es keine universellen Lösungen für die Segmentierung in der fluoreszierenden Mikroskopie. Ein Ansatz besteht darin, mit kommerzieller Software zu experimentieren, die eine Reihe von Methoden unterstützt. Wenn schwellenwertbedingt aufgrund von Variation der Hintergrundintensität fehlschlägt, können kleine Änderungen an den Bildaufnahmeeinstellungen die Segmentierungsergebnisse verbessern.
Eine Einschränkung der Methode liegt in der Tatsache, dass das menschliche Transplantat schneller durch Empfängerzellen ersetzt und in der Tat vollständig durch Mausempfänger-Endothelzellen rekonstituiert wird. Dies würde Studien über menschliche Zellinteraktionen ausschließen, wenn das Ziel darin besteht, adoptiv übertragene menschliche Immunzellen zu untersuchen, die über Wechselwirkungen mit menschlichen Endothelzellen in das Isletparenchym wandern. Sowohl bei Maus- als auch bei menschlichen Inseltransplantaten tritt jedoch eine ähnliche Revaskularisation vom Empfänger auf und folgt dem für die Art spezifischen anatomischen 3D-Plan.
Die Erfolgsraten der Beta-Zellersatztherapie haben sich weiterverbessert. Dennoch bleiben verschiedene Herausforderungen bei der Bewertung der Effizienz der Islettransplantation und des Überlebens in vivo ungelöst, da es an geeigneten intravitalen Bildgebungstechnologien fehlt. Die vordere Augenkammer ist eine nützliche Transplantationsstelle, die die wiederholte und langfristige In-vivo-Bildgebung von Isletzellen für die Untersuchung der Isletmorphologie, Vaskularisationsmuster, Betazellfunktion und Betazelltod bei zellulärer Auflösung unterstützt.
Das hier vorgestellte Protokoll zur Untersuchung des Transplantationsprozesses menschlicher Inseltransplantationen an der ACE-Transplantationsstelle ermöglicht eine Längsüberwachung von Transplantaten menschlicher Inselen mit einer wesentlich höheren Auflösung als die, die mit anderen alternativen Längsplattformen wie MRT21,22, PET23, SPECT24oder Biolumineszenz25erhalten wurde.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom Schwedischen Forschungsrat, Strategic Research Area Exodiab, Dnr 2009-1039, der Schwedischen Stiftung für Strategische Forschung Dnr IRC15-0067 an LUDC-IRC, der Royal Physiographic Society in Lund, Diabetesförbundet und Barndiabetesförbundet unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
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