Summary
El objetivo de este protocolo es monitorear continuamente la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos y el huésped contribuyente frente a las células del donante. Esto se logra trasplantando islotes humanos en la cámara anterior del ojo (ACE) de un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor del ratón seguido de imágenes repetidas de 2 fotones.
Abstract
La toma de imágenes de células beta es un paso clave hacia la comprensión del trasplante de islotes. Aunque se han desarrollado y utilizado in vivodiferentes plataformas de imágenes para el registro de la biología de células beta, están limitadas en términos de permitir la resolución de una sola célula y grabaciones longitudinales continuas. Debido a la transparencia de la córnea, la cámara anterior del ojo (ACE) en ratones es muy adecuada para estudiar la biología celular de los islotes pancreáticos humanos y de ratón. Aquí está una descripción de cómo este enfoque se puede utilizar para realizar grabaciones longitudinales continuas de injerto y revascularización de injertos de islotes humanos individuales. Los injertos de islotes humanos se insertan en el ACE, utilizando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-ratones como receptores. Esto permite la investigación de la expansión de las células receptoras frente a las de los donantes y la contribución de las células receptoras en la promoción de la encapsulación y vascularización del injerto. Además, se describe un enfoque paso a paso para el análisis de imágenes y la cuantificación del volumen de los islotes o de la vasculatura segmentada y de las células receptoras que forman cápsulas de islotes.
Introduction
La diabetes mellitus describe un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por niveles elevados de glucosa en sangre como resultado de la producción insuficiente de insulina por pérdida o disfunción de las células beta de islotes pancreáticos, a menudo acompañadas de resistencia a la insulina. La diabetes tipo 1 (T1D) y la diabetes tipo 2 (T2D) son enfermedades complejas en las que la disfunción progresiva de las células beta causa el desarrollo de la enfermedad. T1D se precipita por un ataque autoinmune en las células beta, mientras que T2D se considera impulsado por factores metabólicos, aunque con evidencia creciente de inflamación sistémica de bajo grado1. El trasplante de islotes humanos donantes, particularmente a pacientes con T1D, ofrece la posibilidad de proporcionar control glucémico fisiológico. Sin embargo, la escasez de donantes de tejidos y el injerto deficiente de islotes han evitado que el trasplante de islotes se convierta en una opción terapéutica principal. Una proporción sustancial del injerto de islotes funcionales se pierde en el período inmediatamente posttrasplante (24-48 h) debido al entorno huésped hipoxico, inflamatorio e inmunogénico2,,3. Para evaluar la eficiencia de los métodos de intervención para la mejora de la supervivencia de los islotes, es necesario un seguimiento continuo de dichos trasplantes.
Las técnicas in vivo para imaginar y rastrear el destino de los islotes pancreáticos humanos trasplantados después del trasplante siguen siendo un desafío para la investigación de la diabetes4,,5. Hasta la fecha, las técnicas de imagen no invasiva, incluida la tomografía por emisión de positrones (PET), la resonancia magnética (RM) o la ecografía (EE.UU.) muestran un potencial para la cuantificación y evaluación funcional de islotes trasplantados en condiciones experimentales5. Sin embargo, dados los pequeños tamaños de los islotes, las mediciones cuantitativas de esas modalidades son insuficientes. La cámara anterior del ojo (ACE) como lugar de trasplante para la observación es una solución de imagen no invasiva prometedora que ofrece una resolución espacial efectivamente más alta y un monitoreo frecuente durante largos períodos de tiempo6. Este método ha sido explotado con éxito para estudiar la biología de los islotes de ratón (revisado en Yang et al.7), las respuestas inmunitarias autoinmunes8, así como el injerto de islote humano9,10.
Aquí el método de trasplante de ACE se combina con un enfoque de imágenes de 2 fotones para investigar la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos mediante grabaciones continuas y repetidas en injertos de islotes individuales hasta 10 meses después del trasplante. Las propiedades de imagen multifotónica de mayores profundidades de imagen y reducción del fotoblancarido general y el daño fotográfico superan las limitaciones de imagen de la microscopía confocal11. La cuantificación de imágenes fluorescentes implica varias etapas, incluyendo la preparación de muestras de islotes, el trasplante de islotes, la adquisición de imágenes, el filtrado de imágenes para eliminar el ruido o el fondo de los islotes, la segmentación, la cuantificación y el análisis de datos. El paso más difícil suele ser particionar o segmentar una imagen en varias partes o regiones. Esto podría implicar la separación de la señal del ruido de fondo, o las regiones de agrupación en clústeres de vóxeles en función de similitudes en el color o la forma para detectar y etiquetar los vóxeles de un volumen 3D que representa la vasculatura de islotes, por ejemplo. Una vez segmentadas, las estadísticas, como los tamaños de volumen de objetos, suelen ser fáciles de extraer. Se proporciona un método para la cuantificación y extracción de los datos de imágenes, como la segmentación y la visualización de datos. Se presta especial atención a la eliminación de la autofluorescencia en los islotes humanos y a la distinción entre la vasculatura del islote y la cápsula de islote que forma células receptoras.
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Protocol
El Comité Regional de ética en Lund, Suecia, aprobó el estudio de acuerdo con la Ley relativa a la revisión ética de la investigación que involucra a los seres humanos. Los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con la ética sueca de los experimentos con animales y fueron aprobados por los comités de ética de Malmá y Lund. NOD inmunodeficientes de 6 a 8 semanas de edad. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-tomate. Los ratones receptores Rag2-/-) se utilizaron como receptores para el trasplante de islotes humanos10.
1. Preparación de islotes para trasplante
- Cultivo de islotes humanos en CMRL 1066 complementado con 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 50 g/ml de gentamicina, 0,25 g/ml de fungizone, ciproxfloxacino de 20 g/ml, nicotinamida de 10 mM (NIC) y suero humano 10% inactivado por calor a 37 oC en 5% co2 y aire humidificado hasta el trasplante, como se ha descrito anteriormente12.
NOTA: Los islotes deben estar libres de tejido exocrino y no tocarse entre sí en el cultivo. Los tejidos exocrinos parecen translúcidos. - El día del trasplante, transfiera los medios de cultivo que contienen los islotes a un nuevo plato de Petri utilizando un conjunto de tubos de aspirador conectado a un capilar de vidrio tirado.
NOTA: Alternativamente, utilice una pipeta de 200 l. Colorear la parte posterior de la placa Petri ayuda a que los islotes sean más fácilmente distinguibles bajo el microscopio estéreo. - Usando un microscopio estéreo, escoge 20–40 islotes por trasplante y transfiéralos a un tubo de 1,5 ml. Llene el tubo hasta la parte superior con medios de cultivo de la incubadora.
- Sellar los tubos con película de parafina y almacenar sobre hielo hasta el trasplante. Preparar una cantidad adecuada para el número de trasplantes realizados.
- Alternativamente, asegúrese de que una incubadora deCO2 esté disponible en la sala de cirugía para mantener los islotes en el cultivo y recogerlos inmediatamente antes de cada trasplante.
2. Preparación de equipos de trasplante y mesa de cirugía
NOTA: Todas las herramientas quirúrgicas deben ser autoclavadas, y la mesa de cirugía y los instrumentos desinfectados con 70% de alcohol.
- Conecte un soporte de cabeza estereotaxico a la anestesia a través de una máscara nasal y encienda la almohadilla de calentamiento.
- Conecte una jeringa hermética de Hamilton a tubos de polietileno y una cánula de ojo final contundente.
NOTA: Se recomienda llenar todas las piezas con PBS antes del montaje. Compruebe si hay burbujas de aire atrapadas y retírela si está presente. - Fije firmemente la jeringa de Hamilton a la mesa(Figura 1a)o a una base móvil (Figura 1e) y conecte el tubo al microscopio estéreo, con la cánula colgando hacia abajo (es decir, posición de espera).
NOTA: Utilice cinta quirúrgica, ya que es fácil de quitar y volver a colocar. - Prepare una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de 30 G llena de 0,1 mg/kg de solución de buprenorfina.
- Prepare una jeringa con PBS estéril. Alternativamente, utilice una pipeta.
- Deje a un lado una jaula de despertador limpia con lámpara de calefacción.
3. Anestesia y posicionamiento de ratones receptores para la cirugía
NOTA: Todos los animales fueron criados y mantenidos en un ambiente libre de patógenos en las instalaciones de animales de la Universidad de Lund.
- Anestfetar el ratón en una cámara llena de 40% O2/60% N2/3% isoflurano y transferir el ratón anestesiado a la plataforma del soporte de la cabeza en una almohadilla de calentamiento caliente (Figura 1a). Compruebe la falta de reflejos de pedal.
NOTA: La anestesia isoflurano es el método preferido de anestesia para una rápida recuperación después de la cirugía. La sala del microscopio debe estar adecuadamente ventilada para utilizar isoflurano. - Coloque el hocico del ratón en la mascarilla de anestesia conectada a 40% O2/60% N2/0.9%–1.5% máquina de anestesia isoflurano. Utilice el pulgar y el dedo para levantar ligeramente la cabeza y fijarla con las piezas metálicas en los lados. Asegúrese de que los auriculares fijan la cabeza directamente debajo de las orejas. Inyectar 0,1 mg/kg de solución de buprenorfina por vía subcutánea en la parte posterior del ratón.
NOTA: La buprenorfina se utiliza como analgésico. - Incline la cabeza de modo que el ojo a operar esté mirando hacia arriba y esté cerca del investigador.
- Retraiga suavemente los párpados del ojo para ser trasplantados usando fórceps contundentes, saque el ojo y fíjelos libremente con un par de pinzas. Asegúrese de que las puntas de las pinzas estén cubiertas con un tubo de polietileno unido a la plataforma del soporte del cabezal(Figura 1a, inserto).
- Mantenga siempre ambos ojos húmedos aplicando una gota de PBS estéril en el ojo.
- Transfiera los islotes humanos del tubo sellado de 1,5 ml (sección 1) a una placa Petri con PBS estéril y asegúrese de que los islotes estén cerca uno del otro para minimizar la cantidad de medios de cultivo celular transferidos (Figura 1c).
- Recoger los islotes de 20 a 30 en la cánula ocular conectados a través de tubos de polietileno a la jeringa de Hamilton.
NOTA: Tome el menor líquido posible con los islotes. - Cuelgue el tubo boca abajo y adjúntelo al microscopio estéreo(Figura 1d). Pegue el tubo cuidadosamente para dejar que los islotes se hundan hasta el extremo del tubo hacia la cánula.
4. Procedimiento de trasplante
NOTA: Este método ha sido descrito previamente para el trasplante de islotes deratón 6. Aquí se presenta un procedimiento ligeramente modificado.
- Pellizca las almohadillas en las patas traseras para asegurarte de que el ratón esté dormido.
- Apriete los fórceps que sujetan el ojo sin interrumpir el flujo sanguíneo y aplique una gota de PBS estéril en el ojo.
- Usando una aguja de 25 G como bisturí, biselar hacia arriba, penetrar cuidadosamente sólo la mitad de la punta en la córnea y hacer una sola incisión lateral. Hacer el agujero en un ángulo hacia arriba; el orificio se sellará más fácilmente después del trasplante(Figura 1f).
- Levante cuidadosamente la córnea con la cánula precargada con islotes y aplique lentamente islotes en el ojo. Evite la inserción de la cánula en la cámara anterior para evitar daños en el iris, sino más bien empuje cuidadosamente contra la abertura corneal (Figura 1g). Retraiga lentamente la cánula de la ACE.
NOTA: Apunte a un volumen de inyección de 3-8 l. Si el volumen es demasiado grande, expondrá el ojo a una presión intraocular innecesariamente alta y puede provocar reflujo de los islotes inyectados fuera de la cámara anterior. - Cuando se enfrentan a dificultades con la inserción de los islotes debido al aumento de la presión en la cámara ocular, agrande el sitio de la incisión reforzando el sitio de la incisión lateral y volver a aplicar los islotes.
NOTA: Ocasionalmente, las burbujas de aire introducidas se pueden utilizar como soportes de espacio. - Aplique gel para los ojos en el ojo, afloje los fórceps que sujetan los ojos y deje al ratón en isoflurano en la misma posición durante 8-10 minutos para dejar que los islotes se ajusten.
- Retire los fórceps que sostienen el párpado y vuelva a colocar el párpado en su posición normal.
- Retire el ratón del soporte de la cabeza y transfiéralo a una jaula de activación.
- Cuando el ratón esté despierto y en movimiento, transfiételo de vuelta a la jaula original y manténgalo en la carcasa del animal hasta que se escanee (se recomiendan al menos 5 días).
5. Imágenes de islotes humanos implantados por microscopía de 2 fotones
NOTA: Se recomienda tomar imágenes generales del ojo con un microscopio estereoscópico de fluorescencia (Figura 2a–c) 4-5 días después del trasplante antes del trasplante antes de la toma de imágenes de 2 fotones para localizar los islotes de interés. Evite sujetar el ojo demasiado apretado tan temprano después del trasplante. Utilice imágenes de 2 fotones de 6 a 7 días después de la posttrasplante.
- Inicie el software de adquisición de imágenes (consulte Tabla de materiales). En el menú"Láser"activar el láser Mai Tai (Power "ON") y en el menú "Light Path" establecer la longitud de onda a 900 nm y aplicar una potencia láser de transmisión mínima a partir de 5%–10% de potencia láser (utilice deslizadores).
NOTA: Durante el escaneo, ajuste la potencia del láser según sea necesario. - Establezca canales verdes, naranjas y rojos. Recoger la luz de emisión simultáneamente en tres detectores no enlatados (NDD) utilizando un espejo dicrónico (LBF 760) e información del filtro de emisión de la siguiente manera: Rojo/Angiosense 680, 690–730 nm; Verde/Autofluorescencia, 500–550 nm; y Naranja/Tomate, 565–610nm(Figura 2d).
- Coloque la etapa del soporte de la cabeza en la etapa motorizada del microscopio y conecte la máscara de gas al tubo de la máquina de anestesia y el tubo conectado al sistema de ventilación. Encienda la almohadilla de calefacción.
- Anestesiar el ratón receptor, transferir a la plataforma del soporte de la cabeza, restringir el ojo para la toma de imágenes y administrar la solución de buprenorfina como se describió anteriormente (pasos 3.1–3.5).
- Ajuste los vapores de isoflurano según sea necesario. Una frecuencia de respiración de 55 a 65 respiraciones por minuto (bpm) indica una anestesia óptima. Si la anestesia es demasiado profunda, la tasa será de <50 ppm con respiración intensa o jadeo; si es demasiado ligero, la velocidad será de >70 ppm con respiración superficial. Supervise cuidadosamente los ratones durante la anestesia mediante inspección visual cada 15 min.
NOTA: La anestesia varía de ratón a ratón, entre las cepas del ratón, y a medida que avanza el tiempo bajo anestesia13. - Administrar suficiente gel para los ojos en el ojo como líquido de inmersión entre la córnea y la lente, lo que le permite acumular lentamente(Figura 2f, insertar). Evite las burbujas de aire.
NOTA: Se recomienda la iluminación lateral con una lámpara de manguera metálica flexible para ajustar el enfoque y localizar los injertos de islotes. - Para visualizar los vasos sanguíneos, administre 100 l del agente de imágenes (p. ej., Angiosense 680) por vía intravenosa en la vena de la cola utilizando una jeringa desechable de insulina de 30 G.
- En elmodo de adquisición" ajuste el tamaño del fotograma a 512 x 512 y la velocidad de escaneo.
NOTA: Los escaneos más lentos (es decir, el aumento del tiempo de permanencia) mejorarán la relación señal-ruido. - En el menú"Canales"ajuste ganancia maestra para cada PMT en Voltios para amplificar la señal hasta que se vea una imagen en la pantalla en el modo de escaneo en vivo. Cuanto mayor sea este valor, más sensible será el detector a la señal y al ruido.
NOTA: Preferiblemente, mantenga valores entre 500 y 800 V. - En el menú "Z-stack" defina el principio y el final de la pila z moviendo manualmente el foco a la parte superior del injerto de islote. Guardar posición seleccionando "Establecer primero". Muévase al último plano inferior que se puede enfocar en el injerto de islote y guarde la posición seleccionando"Establecer último". Utilice un tamaño de paso z de 2 m.
- Recopile la pila de imágenes final haciendo clic en la pestaña"Iniciar experimento"y guárdelo como archivo CZI de 8 bits (es decir, formato Carl Zeiss).
6. Imágenes de islotes humanos implantados por microscopía confocal
NOTA: El volumen total, la morfología y la plasticidad de los islotes trasplantados se pueden evaluar mediante el seguimiento de la señal de dispersión in vivo en una exploración separada (es decir, pista separada) mediante la detección de la luz de retrobatería láser10.
- Saque el divisor de haz principal (es decir, filtro LBF) y en el cuadro de diálogo"Ruta de luz"configure una pista independiente para la imagen confocal. Elija el láser Argon con longitud de onda de 633 nm y la detección en la misma longitud de onda que la luz láser. Las pilas Z se adquieren con un tamaño de paso de 2-3 m para la señal de luz de retrobatería.
- Reajuste la configuración de la pila z para asegurarse de grabar todo el islote (consulte el paso 5.10).
- Adquiera la pila de imágenes y guárdela como archivo CZI de 8 bits.
7. Análisis de imagen
NOTA: Para este paso se utilizó software comercial (consulte Tabla de materiales).
- Extracción de la autofluorescencia de islotes (Figura 3b)
- En la pestaña "Procesamiento de imágenes"elija "Aritmética de canal" y escriba "ch1-ch2". Esto crea un nuevo canal 4 (ch 4); renombrar como "Vasculature".
NOTA: El canal verde/autofluorescencia se resta del canal Rojo/Angiosense. - Repita el paso anterior y escriba "ch3-ch2" para crear un nuevo canal (ch 5); renombrar como"Tomate (todo)".
NOTA: El canal Verde/Autofluorescencia se resta del canal Naranja/Tomate.
- En la pestaña "Procesamiento de imágenes"elija "Aritmética de canal" y escriba "ch1-ch2". Esto crea un nuevo canal 4 (ch 4); renombrar como "Vasculature".
- Definición de la máscara de islote mediante dibujo manual (Figura 3c)
- Cree una nueva superficie (símbolo azul) y en el asistente elija "Editar manualmente". Mantenga el puntero en el modo"Seleccionar"y en la vista 3D haga clic en "Volumen" (en Escena)para visualizar las secciones.
- Para facilitar la discriminación fronteriza de los islotes, active todos los canales, incluido el ch 1–ch 3.
NOTA: El canal naranja/tomate es útil para definir los bordes de los islotes mediante la señal de la cápsula de tomate. Alternativamente, aumente las intensidades del canal para utilizar la autofluorescencia del islote multicanal y la señal de fondo del detector como guía. - En la pestaña "Dibujo"elija "Contorno"y haga clic en "Dibujar"para empezar a dibujar contornos alrededor del borde del islote comenzando en la posición de corte 1.
- Muévase a una nueva posición de corte y repita los contornos de dibujo. Termine con el último corte en la parte superior del islote y termine haciendo clic en la pestaña"Crear superficie". Por lo general, es suficiente parath dibujar contornos cada 10a rebanada.
- Segmentación de"Vasculatura de islote"y "Tomate de islote" fluorescencia utilizando máscara de islote ( Figura3d).
- Elija el objeto"Máscara de islot"previamente definido, vaya a la pestaña de edición (símbolode lápiz) y haga clic en la pestaña"Máscarar todo",que abre una nueva ventana.
- Elija el canal previamente nombrado "Vasculature" (ch 4) en el menú desplegable de selección de canales y active las opciones "Duplicar canal antes de aplicar la máscara", " Constanteinterior/fuera",y establezca voxels fuera de la superficie en "0.000", lo que crea un nuevo canal; renombrar como"Vasculatura de islote"(ch 6).
- Repita los pasos 7.3.1 y 7.3.2 y elija el canal creado anteriormente "Tomate (todo)" (ch 5) en el menú desplegable de selección de canales para crear el nuevo canal; renombrar como"Tomate de islote"(ch 7).
- Renderizado superficial de vasculatura de islotes (Figura 3e)
- Cree una nueva superficie en el menú "Escena" y en el asistente elija "Creación automática".
- Establezca el canal de origen en"Vasculatura de islot"(ch 6) y elija la resta de fondo. La estimación automática del umbral se puede ajustar si es necesario. Compare con el canal de fluorescencia que responde (por ejemplo, mezclando la pestaña de superficie recién creada). Continúe con el asistente.
- Opcionalmente, utilice filtros. Por ejemplo, elija "Volumen"y ajuste el filtro (amarillo) en la ventana, que puede eliminar los objetos de superficie seleccionados. Finalice el asistente y asigne al nuevo objeto de superficie el nombre"Islet vasculature".
- Segmentación de "Vasculatura de tomate de islote" señal de fluorescencia ( Figura3f)
- En el objeto de superficie"Islet vasculature" creado anteriormente, vaya a la pestaña de edición y haga clic en la pestaña"Máscara todo",que abre una nueva ventana.
- Elija el canal previamente nombrado "Islet tomate" (ch 7) en el menú desplegable de selección de canales y establezca los vóxeles fuera de la superficie en "10.000", que crea el nuevo canal; renombrar como"Vasculatura de tomate de islote"(ch 8).
- Segmentación de " Cápsula detomate" señal de fluorescencia (Figura 3g)
- Elija "Channel Arithmetic's" en la pestaña "Image processing" y escriba "ch7-ch8", creando el nuevo canal; renombrar como"Cápsula de tomate"(ch 9).
NOTA: La señal de fluorescencia de"vasculaturade tomate de islote" se resta de la señal de fluorescencia total"Tomate islote".
- Elija "Channel Arithmetic's" en la pestaña "Image processing" y escriba "ch7-ch8", creando el nuevo canal; renombrar como"Cápsula de tomate"(ch 9).
- Representación superficial de"Vasculaturade tomate de islote" y "Cápsula de tomate" ( Figura3h)
- Siga el paso 7.4, y en el asistente elija los canales de origen "Vasculatura de tomate de islote" (ch 8) o "Cápsula de tomate" (ch 9) para crear nuevos objetos de superficie en consecuencia.
- Representación superficial de la superficie total del islote (Figura 3i)
- Abra el archivo de retrocayador de islotes y cree una nueva superficie.
- En el asistente, elija "Creación automática" y defina " Regiónde interés".
NOTA:"Región de interés"se utiliza para separar las señales de múltiples islotes y para definir la profundidad del islote a analizar (por ejemplo, 75 m superior). - En"Intensidad absoluta"ajuste el umbral si es necesario. El objeto de superficie se puede hacer clic en o desactivar para realizar una comprobación cruzada con la intensidad de canal correspondiente. Cierre el asistente.
- Cuantificación (Figura 3j)
- Seleccione un objeto de superficie creado en el menú "Escena" y vaya a la pestaña "Estadísticas".
- Para recuperar datos de volumen detallados en el objeto de superficie seleccionado, elija la pestaña "Detallado"y seleccione "Valores específicos"y "Volumen"en el menú desplegable. Para recuperar un valor de volumen total del objeto de superficie seleccionado, vaya a la pestaña "Detallado" y elija "Valores medios".
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Representative Results
Los islotes humanos no etiquetados fueron trasplantados a la ACE de la NOD femenina de 8 semanas de edad. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomate. RatonesreceptoresRag2 . Para prevenir el rechazo del tejido humano, se eligieron ratones noqueadores Rag2 inmunodeficientes como receptores. En estos ratones transgénicos, todas las células y tejidos expresaron una proteína de fluorescencia de tomate (mT) dirigida a la membrana que permite una identificación clara del receptor y del tejido del donante. Las imágenes repetidas de injertos de islotes mediante microscopía de 2 fotones de alta resolución podrían identificar células receptoras mT+ implicadas en el proceso de injerto y su patrón de migración dinámica.
En general, la configuración de trasplante de islotes humanos en la ACE de los ratones receptores (Figura 1a) fue similar a los trasplantes de islotes de ratón singéneos con respecto a la forma y el tamaño de los islotes(Figura 1b,c). Figura 1d,e muestra un trasplante típico con un esquema detallado que muestra el sitio de la incisión lateral (Figura 1f) y la dispersión de los islotes en la cámara ocular (Figura 1g) y un resultado representativo de los islotes de ratón inyectados (Figura 1h) o islotes humanos (Figura 1i). La tasa de injerto de los islotes humanos fue generalmente menor (30%) que la de los islotes de ratón (50-70%). Una posible razón de esta discrepancia es que la disponibilidad de islotes humanos es impredecible, generalmente con sólo un aviso de 1 día, y también que los islotes obtenidos varían en la edad del donante, el IMC del donante, la pureza (45%-86%) y el tiempo de cultivo de postisolación (2-5 días). Por el contrario, los aislamientos de islotes de ratones se pueden planificar fácilmente. Estos fueron aislados de ratones de 6 a 8 semanas de edad (es decir, adultos jóvenes) con alta pureza y tiempos cortos de cultivo nocturno. Estas discrepancias entre los injertos de ratón y de islotes humanos deben tenerse en cuenta al interpretar los resultados.
Las imágenes de fluorescencia in vivo de injertos de islotes humanos se vio comprometida por interferencias significativas de la autofluorescencia tisular(Figura 4). La visualización del proceso de revascularización de los injertos de islotes humanos trasplantados por ACE por agentes de imagen utilizando longitudes de onda tradicionales en el espectro visible se vio obstaculizada por una baja relación señal-ruido y un alto nivel de autofluorescencia de islotes naturales, ilustrado por imágenes de un escaneo en el rango espectral de 500–700 nm (Figura 4a) o por el detector de PMT noencanesado sensible con filtro para la detección de dextran TR (610–675 nm) (Figura 4b). Este fondo alto no se observó en injertos de islotes de ratón(Figura 4c). El agente de imágenes emisor de NIR Angiosense 680 mostró una relación señal-fondo visiblemente mayor debido a la disminución del ruido de fondo en el rango NIR 690-730 nm (Figura 4d, Figura 3a). La grabación adicional de un canal "no utilizado" (es decir, 500–550 nm) podría utilizarse en un paso posterior de procesamiento de imágenes para eliminar el ruido de fondo restante causado por la autofluorescencia de islote natural. La configuración de imágenes de 2 fotones/confocales (Figura 2d–f) es similar a las descritas anteriormente6, excepto para el uso de 900 nm 2-photon excitación y detección de fluorescencia de Angiosense 680, autofluorescencia, y canales de tomate con PMT noencaniados 1-3 (Figura 2d). Es aconsejable medir la potencia de salida láser alcanzando la muestra para cada configuración del microscopio (Figura 2e). Además, se recomienda utilizar inicialmente los islotes injertados con estereomicroscopía(Figura 2a–c),lo que ayudará a seleccionar islotes de interés y evitará imágenes de microscopía de 2 fotones de un trasplante fallido.
El propósito de extraer datos cuantitativos de muchas imágenes era eliminar el sesgo potencial en la selección de datos y obtener el poder estadístico necesario para detectar un efecto legítimo al comparar experimentos. La cuantificación de imágenes fluorescentes de islotes pancreáticos implicó varios pasos, cada uno de los cuales puede haber influido en los resultados en otro. Aquí se utilizó un software de imágenes interactivas. Contiene características que permiten la visualización de imágenes de volumen y objetos y la identificación de objetos según su morfología o intensidad. La Figura 3 ilustra los diferentes pasos en la segmentación de imágenes. La eliminación de la autofluorescencia por resta del canal de "autofluorescencia" mejoró la relación señal-ruido (Figura 3a,b). El límite del islote denominado "máscara de islote" (Figura 3c) y los canales correspondientes (Figura 3d) se definieron manualmente. La segmentación de la señal de tomate en la vasculatura del islote y la cápsula de islotes (Figura 3f,g) y renderizado superficial final (Figura 3e,h,i) se utilizó para extraer datos cuantitativos.
La Figura 5 muestra una sesión de imagen longitudinal representativa del mismo injerto de islote humano a las 2 semanas, 2 meses, 5 meses y 8 meses después de la posttrasplante en la ACE de un NOD. ROSA-tomate. Rag2-/- ratón receptor. Se ilustran las imágenes de proyecciones de intensidad máxima (MIP) de los datos RAW grabados originalmente (Figura 5a), imágenes procesadas después de la eliminación de la autofluorescencia del islote (Figura 5b–e, f–i), y objetos de islotes segmentados incluyendo cápsula (Figura 5j,m) o vasculatura islote formando mT+ células receptoras (rojo, Figura 5n–q) y vasculatura islolla total (verde, Figura 5n–q).
Figura 1: Trasplante de islotes pancreáticos en la cámara anterior del ojo.
(aa ) Configuración de trasplante que muestra ratón anestesiado fijo en el soporte de cabeza estereotaxico y el ojo expuesto (inserción) junto a la jeringa De Hamilton preparada fijada a la mesa y el estereomicroscopio listo para recoger islotes de ratón (b) o islotes humanos (c). (d) Posición de espera de la cánula ocular cargada con islotes. (e) Trasplante en curso, y (f) dibujo esquemático de una sola incisión lateral utilizada para levantar cuidadosamente la córnea con la punta de la cánula del ojo y dispensar islotes en la cámara anterior (g). Imagen del ojo inmediatamente después de la inyección de islotes de ratón (h) o islotes humanos (i). Barra de escala a 500 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de injertos de islotes pancreáticos implantados en ACE.
(a) Configuración experimental de imágenes de microscopio estéreo fluorescentes. Widefield (b) o imagen fluorescente (c) de B6. ROSA-injertos de islotes de tomate. (d) Esquema simplificado de la trayectoria de la luz de emisión. LBF: Filtro de bloqueo láser (divisor de haz principal); LP: Pase largo; BP: Paso de banda; PMT: Fotomultiplicación. (e) La potencia de salida láser depende en gran medida de la longitud de onda. El diagrama muestra la potencia de salida láser real en vatios (W) relacionada con el nivel de potencia del rayo láser (%), medido para la configuración del microscopio. Círculo: 800 nm, cuadrado: 900 nm, triángulo: 1.000 nm. (f) Configuración experimental de imágenes que muestra el ratón receptor con islotes injertados en ACE (inserción) montados en la etapa motorizada un microscopio comercial. Barra de escala de 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Segmentación de imagen de un islote humano injertado en el ACE de un NOD. ROSA-tomate. Rag2-/- ratón receptor.
(a) Grabación original: Se muestra una representación 3D de una pila de imágenes de un islote humano con canales combinados o secciones ópticas de canales divididos Angiosense 680 (ch 1), autofluorescencia (ch 2) y tomate (ch 3). (b) Representación 3D de pila de imágenes con canales combinados o secciones ópticas con canales divididos "Vasculatura" (ch 4) y "Tomate(todos)" (ch 5) después de la eliminación de autofluorescencia. (c) Máscara de islote (amarillo). (d) Representación 3D de pila de imágenes con canales combinados o divididos "vasculatura de islotes" (ch 6, blanco), "tomate islote"(ch 7, rojo). (e) Objeto de superficie "vasculatura de islote" creado a partir de ch 6. (f) Representación 3D de pila de imágenes con canales combinados "vasculatura de islotes" (ch 6, verde) y "vasculatura de tomate islote" (ch 8, rojo). (g) Representación 3D de " cápsula detomate" (ch 9) después de la resta del canal ch 7–ch 8 o sección óptica con canales combinados " cápsulade tomate" (ch 9, blanco), vasculatura de tomate de islote (ch 8, rojo), y vasculatura islote (ch 6, verde). (h) Renderizado superficial de cápsula de tomate (creada a partir de ch 9) y vasculatura de tomate de islote (creada a partir de ch 8). (i) Segmentación del islote de la señal de retrocatter de islotes humanos que muestra la selección de "Región de interés" (izquierda) y el objeto de superficie segmentada (medio) en comparación con la intensidad del canal (derecha). (j) Recuperación de datos de la pestaña de estadísticas. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Autofluorescencia de islotes humanos.
Los islotes humanos (a,b,d) o B6 islotes de ratón (c) fueron trasplantados a la ACE de NOD. Rag2-/- o B6 ratones receptores e inyectado con dextrano TR (a–c) o angiosense 680 agente de imágenes (d) para la visualización de los vasos sanguíneos. (a)- escaneo del injerto de islotes humanos en el rango de 500-700 nm con excitación de 2 fotones a 900 nm. Imagen máxima de proyección de imagen (MIP) del injerto de islote humano (b) o ratónexcitadoa 900 nm y detectado con el filtro TR (610–675 nm) del NDD. (d) MIP de un injerto de islote humano excitado a 900 nm y detección con el filtro Angiosense 680 (690–730 nm) del NDD. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Los islotes humanos trasplantados se revascularan progresivamente y se encapsulan mediante células que expresan mT de origen receptor.
Islotes humanos trasplantados en la cámara ocular anterior de NOD. ROSA-tomate. Los ratones receptores Rag2,−/− fueron imágenes repetidamente durante un máximo de 8 meses. Angiosense 680 se inyectó para la visualización de la vasculatura. (a) Proyecciones de intensidad máxima (MIP) de datos RAW originales registrados de canales divididos (vasculatura, autofluorescencia, mT) o canales combinados y señal de luz de retrotransplanación a los 5 meses de posttrasplante. MIPS de vasculatura total solo (b–e) o fusionado con fluorescencia de tomate dirigida a membrana (mT) (f–i) después de la eliminación de la autoflourescencia del islote (verde, a). Representaciones 3D de cápsula de tomate de islote segmentado (j–m) y vasculatura de tomate de islotes (rojo) o vasculatura total de islotes (verde) (n–q) en los puntos de tiempo indicados después de la trasplante. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se presenta un método para estudiar el proceso de injerto de células de islotes pancreáticos humanos observando la participación del tejido receptor y donante. Después de una cirugía mínima invasiva que implanta islotes humanos en la cámara anterior de un ojo de ratón inmunodeficient, el ratón se recupera rápidamente en cuestión de minutos después de la cirugía. El procedimiento se realiza en un ojo. Generalmente, de 5 a 7 días después de la posimplantación en adelante, la córnea está lo suficientemente curada para realizar imágenes intravitales.
En este protocolo, la calidad de los injertos de islotes humanos es crítica. La calidad de los islotes humanos y, por lo tanto, el resultado del trasplante pueden variar dependiendo de la edad del donante, el IMC y el proceso de aislamiento, así como el momento del cultivo de los islotes antes y después de la llegada. Los islotes humanos procesados a partir de páncreass de donantes de órganos aprobados para trasplantes clínicos y fines de investigación se utilizaron con el consentimiento de los donantes. Se obtuvieron después de un proceso de digestión del páncreas y purificación de islotes descrito en otroslugares 12. Al igual que los islotes murinos aislados, estos islotes se someten a una serie de ataques celulares como isquemia, estrés mecánico, pérdida de proteínas del sótano y interrupción parcial de las células endoteliales intra-islotes (CE) durante el paso de digestión enzimática14,,15. A pesar de mejorar constantemente las condiciones de cultivo y la recuperación de un gran número de islotes humanos de alta calidad, el tiempo de trasplante sigue siendo un factor crítico. Durante los primeros días de cultivo, los islotes humanos muestran una pérdida significativa de ECs intra-islotes y en seis días de cultivo sólo se pueden detectar pequeñas estructuras endoteliales en el núcleo del islote16. Esta pérdida de células endoteliales intra-islotes podría constituir un factor crítico en la reducción del injerto de islotes humanos, porque las ECs de los islotes donantes son actores importantes en el proceso de revascularización17.
Mantener la esterilidad durante el procedimiento de trasplante es fundamental para evitar infecciones oculares en el NOD inmunocomprometido. ROSA-tomate. Rag2-/- ratones. Por lo general, los procedimientos de trasplante se realizan en condiciones limpias utilizando guantes, bata de laboratorio, cubierta de la cabeza y máscara bucal, pero no dentro de un gabinete de bioseguridad. Todas las soluciones utilizadas son filtradas estériles, y las jeringas, cánulas, tubos y gasas se enjuagan en 70% de etanol. Las jaulas de despertador están autoclavadas. Aunque no se puede garantizar la total esterilidad debido al manejo manual del ratón durante el procedimiento, la contaminación de los islotes o las infecciones oculares no han tenido problemas con este procedimiento.
La anestesia estable y adecuada es un factor importante y crítico para reducir los movimientos oculares y la deriva durante la adquisición de datos de baja velocidad de fotogramas, y la eficacia puede variar entre diferentes agentes anestésicos18. Bajo la ligera anestesia general de isoflurano, el ojo ocasionalmente se mueve de manera lenta y aumenta la profundidad de la anestesia (del 1 al 2%) generalmente puede reducir los movimientos oculares. La clara ventaja de usar anestesia inhalable es su efecto rápido y tiempo de recuperación. Sin embargo, debe señalarse que el uso de isoflurano puede alterar la secreción de insulina19.
El análisis y la segmentación de imágenes, o la partición de una imagen en varias regiones, son desafiantes y están sujetos a posibles sesgos en la selección de datos20. La segmentación tiene como objetivo identificar objetos como la "vasculatura de islotes" para la cuantificación. Aquí, se aplicaron métodos basados en el umbral de intensidad a regiones seleccionadas (es decir, "intensidad absoluta") o diferencias de intensidad para encontrar bordes (es decir, "sustracción de fondo"). Actualmente, no existen soluciones universales para la segmentación en microscopía fluorescente. Un enfoque es experimentar con software comercial que admita una variedad de métodos. Si se produce un error en el umbral debido a la variación de la intensidad de fondo, los pequeños cambios en la configuración de captura de imágenes pueden mejorar los resultados de segmentación.
Una limitación del método radica en el hecho de que el injerto humano es reemplazado más rápidamente por células receptoras y, de hecho, completamente reconstituido por células endoteliales receptoras del ratón. Esto impediría los estudios de interacciones celulares humanas si el objetivo es estudiar las células inmunitarias humanas transferidas de forma adoptiva que migran al parénquima de los islotes a través de interacciones con células endoteliales humanas. Sin embargo, tanto en injertos de ratón como de islotes humanos, se produce una revascularización similar del receptor y sigue el diferente plan 3D anatómico específico para la especie.
Las tasas de éxito de la terapia de reemplazo de células beta han seguidomejorando. Sin embargo, varios desafíos en la evaluación de la eficiencia del injerto de islotes y la supervivencia in vivo siguen sin resolverse debido a la falta de tecnologías de imagen intravital adecuadas. La cámara ocular anterior es un sitio de trasplante útil, que apoya la imagen in vivo repetida y a largo plazo de las células de los islotes para el estudio de la morfología de los islotes, los patrones de vascularización, la función de las células beta y la muerte de células beta a una resolución celular.
El protocolo para el estudio del proceso de injerto de trasplantes de islotes humanos en el sitio de trasplante de ACE aquí reportado permite el seguimiento longitudinal de injertos de islotes humanos con una resolución considerablemente mayor que la obtenida con otras plataformas longitudinales alternativas como MRI21,,22, PET23,SPECT24o Bioluminiscencia25.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación, El área de investigación estratégica Exodiab, Dnr 2009-1039, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica Dnr IRC15-0067 a LUDC-IRC, la Sociedad Fisiográfica Real en Lund, Diabetesf-rbundet y Barndiabetesf-rbundet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
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