الهدف من هذه المقالة هو توفير نهج موحد للحث على التمايز السلف الكبدي البشري من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. تطوير هذا الإجراء مع تركيبات وسائل الإعلام الجاهزة للاستخدام تقدم للمستخدم نظام سهل لتوليد خلايا الكبد البشري للبحوث الطبية الحيوية والترجمة.
أمراض الكبد هي قضية صحية عالمية متصاعدة. في حين أن زرع الكبد هو وسيلة فعالة للعلاج، فقد زاد معدل وفيات المرضى بسبب النقص في توافر الأعضاء المانحة. كما تؤثر ندرة الأعضاء على الإمداد الروتيني بالخلايا الكبدية البشرية للأبحاث الأساسية والعيادة. لذلك ، فإن تطوير مصادر متجددة لخلايا السلف الكبد البشري أمر مرغوب فيه وهو الهدف من هذه الدراسة. ولتطوير نظام تمايز السلف الكبدي القابل للتكرار لكي يكون قادرا على توليد ونشر السلف الكبدية البشرية على نطاق واسع. يساعد هذا البروتوكول على الإعادة إنتاج تجريبية بين المستخدمين في مجموعة من أشكال الخلايا الاستزراع ويسمح التمايز باستخدام كل من, الإنسان الجنينية والمحرضة خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات. هذه هي مزايا هامة على نظم التمايز الحالية التي من شأنها تعزيز البحوث الأساسية ويمكن أن تمهد الطريق نحو تطوير المنتجات السريرية.
أمراض الكبد تمثل تحديا صحيا عالميا، مما تسبب في ما يقرب من 2 مليون حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم1. على الرغم من وجود عدد من النظم النموذجية لدراسة الأمراض الكبدية والتدخل سريريا، إلا أن الاستخدام الروتيني للأنظمة القائمة على الخلايا محدود بسبب عيوب كبيرة (للمراجعة انظر Szkolnicka et al.2). تمثل ثقافة الخلايا الجذعية البشرية المتقدمة متعددة القدرات وأساليب تمايز الخلايا الجسدية تقنيات واعدة لتطوير أدوات للبحوث الطبية الحيوية الأساسية والمصادر المتجددة للخلايا المتمايزة للعيادة3و4.
حتى الآن، تم تطوير بروتوكولات متعددة للخلية الشبيهة بالخلايا الكبدية (HLC)5و6و7و8. هذه البروتوكولات محاولة لإعادة جوانب من نمو الكبد البشري باستخدام مزيج من جزيئات صغيرة وعوامل النمو9،10. تتكون معظم البروتوكولات من عملية تمايز تدريجية ، حيث يتم إعداد hPSCs إلى endoderm نهائي ، تليها مواصفات السلف الكبدي11و12و13وتنتهي بمواصفات HLC. تعرض مركبات الكربون الهيدروفلورية التي تنتجها هذه البروتوكولات مزيجا من الأنماط الظاهرية للجنين والبالغين. وهذا يشمل التعبير عن ألفا fetoprotein (وكالة الصحافة الفرنسية), مثل علامات خلايا الكبد مثل HNF4α والألبومين (ALB), فضلا عن قدرة استقلاب المخدرات14,15,16. ويمكن أن يختلف التمايز بين المختبرات؛ لذلك، من الضروري وضع بروتوكولات موحدة. وهذا سيمكن الباحثين من توليد وتطبيق مركبات الكربون الهيدروفلورية المشتقة من الخلايا الجذعية على نطاق واسع للبحوث الأساسية والسريرية.
تم تطوير نظام تمايز السلف الكبدي الذي يمكن تطبيقه على كل من خطوط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والمحرضة متعددة القدرات باستخدام إرشادات سهلة المتابعة. ينتج عن هذا الإجراء مجموعات متجانسة من السلف الكبدي في أشكال مختلفة من أدوات الثقافة ، بدءا من قوارير زراعة الخلايا إلى 96 لوحة بئر. ويرد أدناه بروتوكول لإنتاج سلفات كبدية مشتقة من الخلايا الجذعية في 24 و96 شكلا من أشكال الآبار.
يتم تحديد كثافة الخلية المستخدمة في البروتوكول المعروض أدناه لإحدى البئرات من صفيحة بئر 24 و96 على التوالي (انظر الجدول 1). مطلوب الأمثل من رقم الخلية البداية لتنسيقات لوحة ثقافة الخلية المختلفة وخطوط الخلية. مقترح بدء كثافة الخلية لتحسين البروتوكول هو 2 × 105 خلايا / سم2. لتحسين الكثافة، يمكن اختبار العديد من كثافات الخلايا بإضافة ± 50,000 خلية/سم2 في المرة.
ويمكن أن يمثل توليد خلايا السلف الكبدية البشرية من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات على نطاق واسع بديلا واعدا للمواد المشتقة من الجثث. توحيد البروتوكول وقابلية النسخ هما المفتاح لضمان ترجمة التكنولوجيا وتأثيرها على البحوث الطبية الحيوية. ولمعالجة هذا، ركز العمل السابق على تطوير بروتوكول تمييز تدريجي من hESC و iPSCs باستخدام إضافات ومصفوفات محددة15و23و24و25و26و27و28. من خلال القيام بذلك ، تم تحسين النمط الظاهري للخلايا الكبدية وقابلية الاستنساخ ، مما يسمح بأتمتة شبه عملية التمايز19. يتم تعزيز النظام المقدم من خلال تركيبته مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية الجاهزة ونظام تمايز خلايا الكبد سهلة.
في السابق ، تم تسليط الضوء على كثافة الخلايا متعددة القدرات قبل بدء بروتوكول التمايز كمتغير رئيسي لتحقيق مجموعة متجانسة من خلايا السلف الكبدي26. باستخدام هذا الإجراء أكثر دقة، فمن الممكن لتوليد أعداد كبيرة من السلف الكبدية المشتقة من الخلايا الجذعية بطريقة تدريجية باستخدام مجموعة من كثافات الخلايا بدءا(الجدول 1). في اليوم 5، تم التحقق من صحة التعريفي endoderm نهائي من قبل Sox17 تلطيخ (الشكل 3). تم تحقيق التمايز الفعال والقوية في endoderm نهائي مع كل من اختبار ESC وخطوط iPSC، مع أكثر من 80٪ التعبير عن Sox17(الشكل 3). في اليوم العاشر، أظهرت السلف الكبدية مورفولوجيا موحدة تشبه الحصى، وكانت علامات الخلايا الجذعية الكبدية غنية للغاية لكل من وكالة الصحافة الفرنسية وHNF4α (>86٪، الشكل 4). باستخدام مزيج من التكنولوجيات اليدوية وشبه الآلية كان من الممكن لأداء التمايز في أشكال لوحة متعددة19.
في شكله الحالي، تمايز الخلية هو مناسبة للتجارب في المختبر القائم. ومع ذلك، من المرجح أن تكون هناك حاجة إلى إثراء الخلايا قبل التطبيق السريري لضمان إعداد مجموعة متجانسة من السلف الكبدية للولادة.
وفي الختام، يوفر البروتوكول الموصوف هنا المجال بنهج موحد لإنتاج السلف الكبدية على نطاق واسع. وستركز الأعمال المستقبلية على إنتاج وسيلة جديدة للتمايز والنضج والصيانة اللاحقة ل HLC.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذه الدراسة بجوائز من شراكة تدريب الدكتوراه MRC (MR/K501293/1) ومنصة الطب التجديدي في المملكة المتحدة (MRC MR/L022974/1 وMR/K026666/1)، ومكتب كبير العلماء (TCS/16/37).
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |