Het doel van dit artikel is om een gestandaardiseerde aanpak te bieden om menselijke hepatische voorloperdifferentiatie van pluripotente stamcellen te induceren. De ontwikkeling van deze procedure met kant-en-klare mediaformuleringen biedt de gebruiker een gemakkelijk systeem om menselijke levercellen te genereren voor biomedisch onderzoek en vertaling.
Leverziekte is een escalerend wereldwijd gezondheidsprobleem. Hoewel levertransplantatie een effectieve manier van therapie is, is de sterfte onder patiënten toegenomen als gevolg van tekorten in de beschikbaarheid van donororganen. Orgaanschaarste beïnvloedt ook de routinematige toevoer van menselijke hepatocyten voor fundamenteel onderzoek en de kliniek. Daarom is de ontwikkeling van hernieuwbare bronnen van menselijke levervoorlopercellen wenselijk en is het doel van deze studie. Om op grote schaal effectief menselijke levervoorlopers te kunnen genereren en inzetten, werd een reproduceerbaar hepatisch voorloperdifferentiatiesysteem ontwikkeld. Dit protocol helpt experimentele reproduceerbaarheid tussen gebruikers in een reeks celkweekformaten en maakt differentiatie mogelijk met behulp van zowel menselijke embryonale als geïnduceerde pluripotente stamcellijnen. Dit zijn belangrijke voordelen ten opzichte van de huidige differentiatiesystemen die het fundamenteel onderzoek zullen verbeteren en de weg kunnen effenen voor klinische productontwikkeling.
Leverziekte vormt een wereldwijde gezondheidsuitdaging, die wereldwijd ongeveer 2 miljoen sterfgevallen per jaar veroorzaakt1. Hoewel er een aantal modelsystemen bestaan om leverziekten te bestuderen en klinisch in te grijpen, wordt het routinematige gebruik van celgebaseerde systemen beperkt door belangrijke nadelen (voor een overzicht zie Szkolnicka et al.2). Geavanceerde humane pluripotente stamcel (hPSC) cultuur en somatische celdifferentiatiemethoden vertegenwoordigen veelbelovende technologieën om hulpmiddelen te ontwikkelen voor fundamenteel biomedisch onderzoek en hernieuwbare bronnen van gedifferentieerde cellen voor de kliniek3,4.
Tot op heden zijn meerdere protocollen voor hepatocyt-achtige cel (HLC) differentiatie ontwikkeld5,6,7,8. Deze protocollen proberen aspecten van de menselijke leverontwikkeling na te bootsen door een combinatie van kleine moleculen en groeifactoren9,10. De meeste protocollen bestaan uit een stapsgewijs differentiatieproces, waarbij hPSC’s worden voorbereid op definitief endoderm, gevolgd door hepatische voorloperspecificatie11,12,13en eindigend met HLC-specificatie. HLCs geproduceerd door deze protocollen vertonen een mengsel van foetale en volwassen fenotypes. Dit omvat de expressie van alfa-fetoproteïne (AFP), zoals hepatocytmarkers zoals HNF4α en albumine (ALB), evenals de metabolisatiecapaciteit van geneesmiddelen14,15,16. Tussen laboratoria kan HLC-differentiatie variëren; daarom is de ontwikkeling van gestandaardiseerde protocollen noodzakelijk. Dit zal onderzoekers in staat stellen om op grote schaal effectief stamcel-afgeleide HLCs te genereren en toe te passen voor fundamenteel en klinisch onderzoek.
Er werd een hepatisch voorloperloperdifferentiatiesysteem ontwikkeld dat kan worden toegepast op zowel menselijke embryonale als geïnduceerde pluripotente stamcellijnen met behulp van gemakkelijk te volgen richtlijnen. Deze procedure levert homogene populaties van levervoorlopers op in verschillende cultureware-formaten, variërend van celkweekkolven tot 96 putplaten. Hieronder vindt u het protocol om stamcel-afgeleide levervoorlopers te produceren in 24 en 96 putformaten.
De celdichtheid die in het onderstaande protocol wordt gebruikt, wordt gespecificeerd voor één put van respectievelijk een put van 24 en 96 put (zie tabel 1). Optimalisatie van het startcelnummer is vereist voor de verschillende celkweekplaatformaten en cellijnen. Voorgestelde startceldichtheid voor protocoloptimalisatie is 2 x 105 cellen / cm2. Voor dichtheidsoptimalisatie kunnen verschillende celdichtheden worden getest door ± 50.000 cellen / cm2 tegelijk toe te voegen.
Het op grote schaal genereren van menselijke levervoorlopercellen uit pluripotente stamcellen zou een veelbelovend alternatief kunnen zijn voor kadaver-afgeleid materiaal. Protocolstandaardisatie en reproduceerbaarheid zijn essentieel om technologische vertaling en impact voor biomedisch onderzoek te garanderen. Om dit aan te pakken, heeft eerder werk zich gericht op het ontwikkelen van een stapsgewijs differentiatieprotocol van hESC en iPSC’s met behulp van gedefinieerde additieven en matrices15,23,24,25,26,27,28. Door dit te doen, zijn het fenotype en de reproduceerbaarheid van hepatocyten verbeterd, waardoor de semi-automatisering van het differentiatieproces19mogelijk is . Het gepresenteerde systeem wordt versterkt door de combinatie met kant-en-klare celkweekmedia en een gemakkelijk hepatocytendifferentiatiesysteem.
Eerder werd pluripotente celdichtheid voorafgaand aan de start van het differentiatieprotocol benadrukt als een belangrijke variabele om een homogene populatie van levervoorlopercellen te bereiken26. Met behulp van deze meer verfijnde procedure is het mogelijk om stapsgewijs grote aantallen van stamcellen afgeleide levervoorlopers te genereren met behulp van een reeks startceldichtheden(tabel 1). Op dag 5 werd de definitieve endoderm-inductie gevalideerd door Sox17-kleuring(figuur 3). Efficiënte en robuuste differentiatie in definitief endoderm werd bereikt met zowel geteste ESC- als iPSC-lijnen, waarbij meer dan 80% Sox17 uitdrukte(figuur 3). Op dag 10 vertoonden levervoorlopers een uniforme geplaveide morfologie en waren leverstamcelmarkers sterk verrijkt voor zowel AFP als HNF4α (>86%, figuur 4). Met behulp van een combinatie van handmatige en semi-geautomatiseerde technologieën was het mogelijk om differentiatie in meerdere plaatformaten uit te voeren19.
In zijn huidige vorm is celdifferentiatie geschikt voor in vitro gebaseerde experimenten. Celverrijking zou echter waarschijnlijk nodig zijn vóór klinische toepassing om ervoor te zorgen dat een homogene populatie van levervoorlopers wordt voorbereid op levering.
Kortom, het hier beschreven protocol biedt het veld een gestandaardiseerde aanpak om levervoorlopers op grote schaal te produceren. Toekomstige werkzaamheden zullen zich richten op de productie van een nieuw medium voor latere HLC-differentiatie, rijping en onderhoud.
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund met prijzen van het MRC Doctoral Training Partnership (MR/K501293/1), het UK Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 en MR/K026666/1), het Chief Scientist Office (TCS/16/37).
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |