Das Ziel dieses Artikels ist es, einen standardisierten Ansatz zur Induktion der Differenzierung des menschlichen Lebervorläufers von pluripotenten Stammzellen bereitzustellen. Die Entwicklung dieses Verfahrens mit gebrauchsfertigen Medienformulierungen bietet dem Anwender ein einfaches System zur Erzeugung menschlicher Leberzellen für die biomedizinische Forschung und Translation.
Lebererkrankungen sind ein eskalierendes globales Gesundheitsproblem. Während die Lebertransplantation eine wirksame Therapieform ist, ist die Patientensterblichkeit aufgrund mangelnder Verfügbarkeit von Spenderorganen gestiegen. Organknappheit wirkt sich auch auf die routinemäßige Versorgung mit menschlichen Hepatozyten für die Grundlagenforschung und die Klinik aus. Daher ist die Entwicklung erneuerbarer Quellen menschlicher Lebervorläuferzellen wünschenswert und das Ziel dieser Studie. Um menschliche Lebervorläufer in großem Maßstab effektiv erzeugen und einsetzen zu können, wurde ein reproduzierbares hepatisches Vorläuferdifferenzierungssystem entwickelt. Dieses Protokoll unterstützt die experimentelle Reproduzierbarkeit zwischen Anwendern in einer Reihe von Zellkultur-Softwareformaten und ermöglicht Differenzierungen sowohl mit menschlichen embryonalen als auch mit induzierten pluripotenten Stammzelllinien. Dies sind wichtige Vorteile gegenüber aktuellen Differenzierungssystemen, die die Grundlagenforschung verbessern und den Weg zur klinischen Produktentwicklung ebnen können.
Lebererkrankungen stellen eine globale Gesundheitsherausforderung dar und verursachen weltweit etwa 2 Millionen Todesfälle pro Jahr1. Obwohl es eine Reihe von Modellsystemen gibt, um Lebererkrankungen zu untersuchen und klinisch einzugreifen, ist der routinemäßige Einsatz zellbasierter Systeme durch signifikante Nachteile begrenzt (für eine Überprüfung siehe Szkolnicka et al.2). Fortschrittliche Humanpluripotenten Stammzellkulturen (hPSC) und somatische Zelldifferenzierungsmethoden stellen vielversprechende Technologien dar, um Werkzeuge für die biomedizinische Grundlagenforschung und erneuerbare Quellen differenzierter Zellen für die Klinik zu entwickeln3,4.
Bis heute wurden mehrere Protokolle zur Hepatozyten-ähnlichen Zelldifferenzierung (HLC) entwickelt5,6,7,8. Diese Protokolle versuchen, Aspekte der menschlichen Leberentwicklung unter Verwendung einer Kombination von kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren9,10nachzubilden. Die meisten Protokolle bestehen aus einem schrittweisen Differenzierungsprozess, bei dem hPSCs auf das definitive Endoderm vorbereitet werden, gefolgt von der hepatischen Vorläuferspezifikation11,12,13und endet mit der HLC-Spezifikation. HLCs, die von diesen Protokollen produziert werden, zeigen eine Mischung aus fetalen und erwachsenen Phänotypen. Dazu gehören die Expression von Alpha-Fetoprotein (AFP), wie Hepatozytenmarker wie HNF4α und Albumin (ALB), sowie die Metabolisierungskapazität des Arzneimittels14,15,16. Zwischen den Laboren kann die HLC-Differenzierung variieren; daher ist die Entwicklung standardisierter Protokolle notwendig. Dies wird es den Forschern ermöglichen, stammzellbasierte HLCs in großem Maßstab effektiv für die Grundlagen- und klinische Forschung zu generieren und anzuwenden.
Es wurde ein hepatisches Vorläufer-Differenzierungssystem entwickelt, das sowohl auf humane embryonale als auch auf induzierte pluripotente Stammzelllinien unter Verwendung leicht zu befolgender Richtlinien angewendet werden kann. Dieses Verfahren liefert homogene Populationen von Lebervorläufern in unterschiedlichen Kulturmaterialformaten, die von Zellkulturkolben bis zu 96 Wellplatten reichen. Im Folgenden finden Sie das Protokoll zur Herstellung von stammzellbasierten leberischen Vorläufern in 24- und 96-Well-Formaten.
Die im folgenden Protokoll verwendete Zelldichte ist für eine Vertiefung einer 24- bzw. 96-Well-Platte spezifiziert (siehe Tabelle 1). Für die verschiedenen Zellkulturplattenformate und Zelllinien ist eine Optimierung der Ausgangszellnummer erforderlich. Die empfohlene Ausgangszelldichte für die Protokolloptimierung beträgt 2 x 105 Zellen/cm2. Zur Dichteoptimierung können mehrere Zelldichten getestet werden, indem ± 50.000Zellen/cm2 gleichzeitig hinzugefügt werden.
Die Generierung von humanen leberischen Vorläuferzellen aus pluripotenten Stammzellen in großem Maßstab könnte eine vielversprechende Alternative zu Kadavermaterial darstellen. Protokollstandardisierung und Reproduzierbarkeit sind der Schlüssel, um die Technologieübersetzung und -wirkung für die biomedizinische Forschung sicherzustellen. Um dies zu beheben, konzentrierten sich frühere Arbeiten auf die Entwicklung eines schrittweisen Differenzierungsprotokolls von hESC und iPSCs unter Verwendung definierter Additive und Matrizen15,23,24,25,26,27,28. Auf diese Weise wurden der Hepatozytenphänotyp und die Reproduzierbarkeit verbessert, was eine Halbautomatisierung des Differenzierungsprozesses ermöglicht19. Das vorgestellte System wird durch die Kombination mit handelsüblichen Zellkulturmedien und einem einfachen Hepatozyten-Differenzierungssystem verstärkt.
Zuvor wurde die pluripotente Zelldichte vor Beginn des Differenzierungsprotokolls als Schlüsselvariable hervorgehoben, um eine homogene Population von hepatischen Vorläuferzellen zu erreichen26. Mit diesem verfeinerten Verfahren ist es möglich, eine große Anzahl von stammzellbasierten leberlichen Vorläufern schrittweise unter Verwendung einer Reihe von Ausgangszelldichten zu erzeugen (Tabelle 1). An Tag 5 wurde die definitive Endoderminduktion durch Sox17-Färbung validiert (Abbildung 3). Eine effiziente und robuste Differenzierung in definitives Endoderm wurde sowohl mit getesteten ESC- als auch mit iPSC-Linien erreicht, wobei mehr als 80% Sox17 exprimiert wurden (Abbildung 3). An Tag 10 zeigten hepatische Vorläufer eine einheitliche kopfsteinsteinartige Morphologie, und Leberstammzellmarker waren sowohl für AFP als auch für HNF4α stark angereichert (>86%, Abbildung 4). Mit einer Kombination aus manuellen und halbautomatischen Technologien war es möglich, in mehreren Plattenformaten zu differenzieren19.
In ihrer jetzigen Form eignet sich die Zelldifferenzierung für In-vitro-basierte Experimente. Eine Zellanreicherung wäre jedoch wahrscheinlich vor der klinischen Anwendung erforderlich, um sicherzustellen, dass eine homogene Population von Lebervorläufern für die Entbindung vorbereitet wird.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Protokoll dem Feld einen standardisierten Ansatz bietet, um hepatische Vorläufer in großem Maßstab herzustellen. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Herstellung eines neuen Mediums für die anschließende HLC-Differenzierung, -Reifung und -Wartung konzentrieren.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde mit Preisen der MRC Doctoral Training Partnership (MR/K501293/1), der UK Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 und MR/K026666/1), des Chief Scientist Office (TCS/16/37) unterstützt.
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |