L’obiettivo di questo articolo è quello di fornire un approccio standardizzato per indurre la differenziazione del progenitore epatico umano dalle cellule staminali pluripotenti. Lo sviluppo di questa procedura con formulazioni di media pronti all’uso offre all’utente un sistema facile per generare cellule epatiche umane per la ricerca e la traduzione biomedica.
La malattia del fegato è un problema di salute globale in aumento. Mentre il trapianto di fegato è una modalità efficace di terapia, la mortalità dei pazienti è aumentata a causa della carenza di disponibilità di organi donatori. La scarsità di organi influisce anche sulla fornitura di routine di epatociti umani per la ricerca di base e la clinica. Pertanto, lo sviluppo di fonti rinnovabili di cellule progenitrici del fegato umano è auspicabile ed è l’obiettivo di questo studio. Per essere in grado di generare e distribuire efficacemente progenitori epatici umani su larga scala, è stato sviluppato un sistema di differenziazione dei progenitori epatici riproducibili. Questo protocollo aiuta la riproducibilità sperimentale tra gli utenti in una gamma di formati di coltura cellulare e consente differenziazioni utilizzando linee di cellule staminali embrionali umane e pluripotenti indotte. Si tratta di importanti vantaggi rispetto agli attuali sistemi di differenziazione che miglioreranno la ricerca di base e potrebbero aprire la strada allo sviluppo clinico del prodotto.
Le malattie del fegato rappresentano una sfida per la salute globale, causando circa 2 milioni di morti all’anno in tutto il mondo1. Sebbene esistano numerosi sistemi modello per studiare le malattie epatiche e intervenire clinicamente, l’uso di routine dei sistemi basati su cellule è limitato da inconvenienti significativi (per una revisione vedi Szkolnicka et al.2). La coltura avanzata di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) e i metodi di differenziazione delle cellule somatiche rappresentano tecnologie promettenti per sviluppare strumenti per la ricerca biomedica di base e fonti rinnovabili di cellule differenziate per la clinica3,4.
Ad oggi, sono stati sviluppati protocolli multipli per la differenziazione delle cellule epatocitarie (HLC)5,6,7,8. Questi protocolli tentano di ricreare aspetti dello sviluppo del fegato umano utilizzando una combinazione di piccole molecole e fattori dicrescita 9,10. La maggior parte dei protocolli consiste in un processo di differenziazione graduale, in cui le hPSC sono innescate all’endoderma definitivo, seguito dalla specifica progenitriceepatica 11,12,13e termina con la specifica HLC. Gli HLC prodotti da questi protocolli mostrano una miscela di fenotipi fetali e adulti. Ciò include l’espressione di alfa fetoproteina (AFP), come i marcatori epatocitici come HNF4α e albumina (ALB), nonché la capacità di metabolizzare i farmaci14,15,16. Tra i laboratori, la differenziazione HLC può variare; pertanto, è necessario lo sviluppo di protocolli standardizzati. Ciò consentirà ai ricercatori di generare e applicare efficacemente HLC derivati da cellule staminali su larga scala per la ricerca di base e clinica.
È stato sviluppato un sistema di differenziazione progenitrice epatica che può essere applicato sia a linee di cellule staminali embrionali umane che a linee di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando linee guida facili da seguire. Questa procedura produce popolazioni omogenee di progenitori epatici in vari formati di coltura, che vanno dai palloni di coltura cellulare a 96 piastre di pozzo. Di seguito è riportato il protocollo per produrre progenitori epatici derivati da cellule staminali in formati di pozzo 24 e 96.
La densità cellulare utilizzata nel protocollo presentato di seguito è specificata per un pozzetti di una piastra da 24 e 96 pozzetti rispettivamente (vedere Tabella 1). L’ottimizzazione del numero di cellule di partenza è necessaria per i diversi formati di piastre di coltura cellulare e linee cellulari. La densità della cella iniziale suggerita per l’ottimizzazione del protocollo è 2 x10 5 celle/ cm2. Per l’ottimizzazione della densità, è possibile testare diverse densità di cella aggiungendo ± 50.000 celle/cm2 alla volta.
La generazione di cellule progenitrici epatiche umane da cellule staminali pluripotenti su larga scala potrebbe rappresentare un’alternativa promettente al materiale derivato dal cadavere. La standardizzazione e la riproducibilità del protocollo sono fondamentali per garantire la traduzione e l’impatto della tecnologia per la ricerca biomedica. Per affrontare questo problema, il lavoro precedente si è concentrato sullo sviluppo di un protocollo di differenziazione graduale da hESC e iPSC utilizzando additivi e matrici definiti15,23,24,25,26,27,28. In questo modo, il fenotipo e la riproducibilità degli epatociti sono stati migliorati, consentendo la semi-automazione del processo di differenziazione19. Il sistema presentato è rafforzato dalla sua combinazione con mezzi di coltura cellulare pronti all’uso e un facile sistema di differenziazione degli epatociti.
In precedenza, la densità cellulare pluripotente prima dell’inizio del protocollo di differenziazione era evidenziata come una variabile chiave per ottenere una popolazione omogenea di cellule progenitrici epatiche26. Utilizzando questa procedura più raffinata, è possibile generare un gran numero di progenitori epatici derivati da cellule staminali in modo graduale utilizzando una gamma di densità di cellule di partenza (Tabella 1). Al giorno 5, l’induzione definitiva dell’endoderma è stata convalidata dalla colorazione Sox17 (Figura 3). Una differenziazione efficiente e robusta in endoderma definitivo è stata ottenuta con entrambe le linee ESC e iPSC testate, con oltre l’80% che esprime Sox17 (Figura 3). Al giorno 10, i progenitori epatici mostravano una morfologia uniforme simile a un ciottolo e i marcatori delle cellule staminali epatiche erano altamente arricchiti sia per AFP che per HNF4α (>86%, Figura 4). Utilizzando una combinazione di tecnologie manuali e semi-automatizzate è stato possibile eseguire la differenziazione in più formati di piastra19.
Nella sua forma attuale, la differenziazione cellulare è adatta per la sperimentazione in vitro. Tuttavia, l’arricchimento cellulare sarebbe probabilmente necessario prima dell’applicazione clinica per garantire che una popolazione omogenea di progenitori epatici sia preparata per la consegna.
In conclusione, il protocollo qui descritto fornisce al campo un approccio standardizzato per produrre progenitori epatici su larga scala. Il lavoro futuro si concentrerà sulla produzione di un nuovo mezzo per la successiva differenziazione, maturazione e manutenzione HLC.
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato supportato da premi dalla MRC Doctoral Training Partnership (MR / K501293 / 1), dalla piattaforma di medicina rigenerativa del Regno Unito (MRC MR / L022974 / 1 e MR / K026666 / 1), dall’ufficio chief scientist (TCS / 16/37).
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |