O objetivo deste artigo é fornecer uma abordagem padronizada para induzir a diferenciação de progenitor hepático humano das células-tronco pluripotentes. O desenvolvimento deste procedimento com formulações de mídia prontas para uso oferece ao usuário um sistema fácil de gerar células hepáticas humanas para pesquisa biomédica e tradução.
A doença hepática é um problema de saúde global crescente. Embora o transplante hepático seja um modo eficaz de terapia, a mortalidade do paciente aumentou devido à escassez de disponibilidade de órgãos doadores. A escassez de órgãos também afeta a rotina de fornecimento de hepatócitos humanos para pesquisa básica e clínica. Portanto, o desenvolvimento de fontes renováveis de células progenitoras hepáticas humanas é desejável e é o objetivo deste estudo. Para ser capaz de gerar e implantar progenitores de fígado humano em larga escala, foi desenvolvido um sistema de diferenciação de progenitor hepático reprodutível. Este protocolo auxilia a reprodutibilidade experimental entre os usuários em uma variedade de formatos de material cultural celular e permite diferenciações usando linhas de células-tronco pluripotentes embrionárias humanas e induzidas. Essas são vantagens importantes em relação aos sistemas de diferenciação atuais que irão aprimorar a pesquisa básica e podem abrir caminho para o desenvolvimento de produtos clínicos.
A doença hepática representa um desafio global à saúde, causando aproximadamente 2 milhões de mortes por ano em todo o mundo1. Embora existam vários sistemas modelo para estudar doenças hepáticas e intervir clinicamente, o uso rotineiro de sistemas baseados em células é limitado por desvantagens significativas (para uma revisão ver Szkolnicka et al.2). A cultura avançada de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) e os métodos de diferenciação de células somáticas representam tecnologias promissoras para desenvolver ferramentas para pesquisa biomédica básica e fontes renováveis de células diferenciadas para a clínica3,4.
Até o momento, foram desenvolvidos vários protocolos para diferenciação de células semelhantes a hepatócitos (HLC)5,6,7,8. Esses protocolos tentam recriar aspectos do desenvolvimento do fígado humano usando uma combinação de pequenas moléculas e fatores de crescimento9,10. A maioria dos protocolos consiste em um processo de diferenciação stepwise, onde os hPSCs são preparados para o endoderm definitivo, seguido pela especificação progenitora hepática11,12,13, e terminando com especificação HLC. Os HLCs produzidos por esses protocolos exibem uma mistura de fenótipos fetais e adultos. Isso inclui a expressão da fetoproteína alfa (AFP), como marcadores de hepatocitte como HNF4α e albumina (ALB), bem como capacidade metabolizadora de drogas14,15,16. Entre os laboratórios, a diferenciação do HLC pode variar; portanto, o desenvolvimento de protocolos padronizados é necessário. Isso permitirá que os pesquisadores gerem e apliquem HLCs derivados de células-tronco em larga escala para pesquisas básicas e clínicas.
Foi desenvolvido um sistema de diferenciação de progenitor hepático que pode ser aplicado tanto a linhas de células-tronco pluripotentes embrionárias humanas quanto induzidas usando diretrizes fáceis de seguir. Este procedimento produz populações homogêneas de progenitores hepáticos em diferentes formatos de cultura, que vão desde frascos de cultura celular até 96 placas de poços. Fornecido abaixo está o protocolo para produzir progenitores hepáticos derivados de células-tronco em formatos de poços 24 e 96.
A densidade celular utilizada no protocolo apresentado abaixo é especificada para um poço de uma placa de poço 24 e 96, respectivamente (ver Tabela 1). A otimização do número de célula inicial é necessária para os diferentes formatos de placas de cultura celular e linhas de células. A densidade celular inicial sugerida para otimização do protocolo é de 2 x 105 células/cm2. Para otimização da densidade, várias densidades celulares podem ser testadas adicionando ± 50.000 células/cm2 de cada vez.
A geração de células progenitoras hepáticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes em grande escala poderia representar uma alternativa promissora ao material derivado de cadáveres. A padronização e a reprodutibilidade do protocolo são fundamentais para garantir a tradução e o impacto da tecnologia para pesquisas biomédicas. Para lidar com isso, o trabalho anterior concentrou-se no desenvolvimento de um protocolo de diferenciação stepwise do hESC e iPSCs utilizando aditivos e matrizes definidos15,23,24,25,26,27,28. Ao fazer isso, o fenótipo hepatocito e a reprodutibilidade foram melhorados, permitindo a semiautorização do processo de diferenciação19. O sistema apresentado é reforçado por sua combinação com mídia de cultura celular fora da prateleira e um sistema de diferenciação de hepatócitos fáceis.
Anteriormente, a densidade celular pluripotente antes do início do protocolo de diferenciação foi destacada como variável-chave para alcançar uma população homogênea de células progenitoras hepáticas26. Usando este procedimento mais refinado, é possível gerar um grande número de progenitores hepáticos derivados de células-tronco de forma stepwise usando uma gama de densidades celulares iniciais(Tabela 1). No dia 5, a indução definitiva do endoderm foi validada pela coloração sox17(Figura 3). A diferenciação eficiente e robusta em endoderm definitivo foi alcançada com as linhas ESC e iPSC testadas, com mais de 80% expressando Sox17 (Figura 3). No dia 10, progenitores hepáticos exibiam uma morfologia uniforme em forma de paralelepípedo, e os marcadores de células-tronco hepáticas foram altamente enriquecidos tanto para a AFP quanto para HNF4α (>86%, Figura 4). Usando uma combinação de tecnologias manuais e semi-automatizadas foi possível realizar diferenciação em múltiplos formatos deplacas 19.
Em sua forma atual, a diferenciação celular é adequada para experimentação in vitro. No entanto, o enriquecimento celular provavelmente seria necessário antes da aplicação clínica para garantir que uma população homogênea de progenitores hepáticos esteja preparada para o parto.
Em conclusão, o protocolo aqui descrito fornece ao campo uma abordagem padronizada para produzir progenitores hepáticos em larga escala. O trabalho futuro se concentrará na produção de um novo meio para posterior diferenciação, maturação e manutenção do HLC.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado com prêmios da MrC Doctoral Training Partnership (MR/K501293/1), da Uk Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 e MR/K02666/1), do Escritório De Cientista Chefe (TCS/16/37).
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |