इस लेख का लक्ष्य प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से मानव हेपेटिक जनक भेदभाव को प्रेरित करने के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण प्रदान करना है। रेडी-टू-यूज मीडिया फॉर्मूलेशन के साथ इस प्रक्रिया का विकास उपयोगकर्ता को बायोमेडिकल अनुसंधान और अनुवाद के लिए मानव यकृत कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक फेसियल सिस्टम प्रदान करता है।
जिगर की बीमारी एक बढ़ते वैश्विक स्वास्थ्य मुद्दा है । जबकि लिवर प्रत्यारोपण चिकित्सा का एक प्रभावी तरीका है, दाता अंग उपलब्धता में कमी के कारण रोगी मृत्यु दर में वृद्धि हुई है । अंग की कमी बुनियादी अनुसंधान और क्लिनिक के लिए मानव हेपेटोसाइट्स की नियमित आपूर्ति को भी प्रभावित करती है। इसलिए, मानव यकृत जनक कोशिकाओं के नवीकरणीय स्रोतों का विकास वांछनीय है और इस अध्ययन का लक्ष्य है। बड़े पैमाने पर मानव यकृत जनक को प्रभावी ढंग से उत्पन्न और तैनात करने में सक्षम होने के लिए, एक प्रजनन योग्य हेपेटिक जनक भेदभाव प्रणाली विकसित की गई थी। यह प्रोटोकॉल सेल कल्चरवेयर प्रारूपों की एक श्रृंखला में उपयोगकर्ताओं के बीच प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता को एड्स करता है और मानव भ्रूण और प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल लाइनों दोनों का उपयोग करके भेदभाव की अनुमति देता है। ये वर्तमान भेदभाव प्रणालियों पर महत्वपूर्ण लाभ हैं जो बुनियादी अनुसंधान को बढ़ाएंगे और नैदानिक उत्पाद विकास की दिशा में मार्ग प्रशस्त कर सकते हैं।
जिगर की बीमारी एक वैश्विक स्वास्थ्य चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है, जिससे दुनिया भर में प्रति वर्ष लगभग २,०,० मौतें होती हैं1। यद्यपि हेपेटिक रोगों का अध्ययन करने और चिकित्सकीय रूप से हस्तक्षेप करने के लिए कई मॉडल प्रणालियां मौजूद हैं, लेकिन सेल-आधारित प्रणालियों का नियमित उपयोग महत्वपूर्ण कमियों से सीमित है (समीक्षा के लिए Szkolnicka एट अल2देखें)। उन्नत मानव बहुलक स्टेम सेल (एचपीपीएससी) संस्कृति और दैहिक कोशिका भेदभाव विधियां क्लिनिक3,4के लिए बुनियादी जैव चिकित्सा अनुसंधान और विभेदित कोशिकाओं के नवीकरणीय स्रोतों के लिए उपकरण विकसित करने के लिए आशाजनक प्रौद्योगिकियों का प्रतिनिधित्व करती हैं ।
आज तक, हेपेटोसिट-जैसे सेल (एचएलसी) भेदभाव के लिए कईप्रोटोकॉल5,6,7, 8विकसित किए गए हैं। ये प्रोटोकॉल छोटे अणुओं और विकास कारकों के संयोजन का उपयोग करके मानव यकृत के विकास के पहलुओं को फिर से बनाने का प्रयास करते हैं9,10. अधिकांश प्रोटोकॉल में एक स्टेपवाइज भेदभाव प्रक्रिया होती है, जहां एचपीएससी को निश्चित एंडोडर्म के लिए प्रिमेड किया जाता है, जिसके बाद हेपेटिक प्रोजेनिटर विनिर्देश11,12,13और एचएलसी विनिर्देश के साथ समाप्त होता है। इन प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित एचएलसी भ्रूण और वयस्क फेनोटाइप का मिश्रण प्रदर्शित करते हैं। इसमें अल्फा फेटोप्रोटीन (एएफपी) की अभिव्यक्ति शामिल है, जैसे एचएनएफ4α और एल्बुमिन (एएलबी) जैसे हेपेटोसिटे मार्कर, साथ ही दवा मेटाबोलाइजिंग क्षमता14,15,16। प्रयोगशालाओं के बीच, एचएलसी भेदभाव भिन्न हो सकता है; इसलिए, मानकीकृत प्रोटोकॉल का विकास आवश्यक है। इससे शोधकर्ता बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान के लिए बड़े पैमाने पर स्टेम सेल-व्युत्पन्न एचएलसी को प्रभावी ढंग से उत्पन्न और लागू करने में सक्षम होंगे ।
एक हेपेटिक जनक भेदभाव प्रणाली विकसित की गई थी जिसे आसान-से-पालन दिशानिर्देशों का उपयोग करके मानव भ्रूण और प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल लाइनों दोनों पर लागू किया जा सकता है। यह प्रक्रिया अलग-अलग कल्चरवेयर प्रारूपों में हेपेटिक जनकों की समरूप आबादी पैदा करती है, जिसमें सेल कल्चर फ्लास्क से लेकर 96 अच्छी प्लेटें होती हैं। नीचे प्रदान की 24 और ९६ अच्छी तरह से प्रारूपों में स्टेम सेल व्युत्पन्न हेपेटिक जनक का उत्पादन करने के लिए प्रोटोकॉल है ।
नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सेल घनत्व को क्रमशः 24 और 96 अच्छी प्लेट के एक कुएं के लिए निर्दिष्ट किया गया है (तालिका 1देखें)। विभिन्न सेल कल्चर प्लेट प्रारूपों और सेल लाइनों के लिए शुरुआती सेल नंबर का अनुकूलन आवश्यक है। प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिए सेल घनत्व शुरू करने का सुझाव दिया 2 x 105 कोशिकाओं/सेमी2है । घनत्व अनुकूलन के लिए, एक समय में 50,000 कोशिकाओं/सेमी2 ± जोड़कर कई कोशिका घनत्व का परीक्षण किया जा सकता है।
बड़े पैमाने पर बहुलिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से मानव हेपेटिक जनक कोशिकाओं की पीढ़ी शव-व्युत्पन्न सामग्री के लिए एक आशाजनक विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकती है। जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए प्रौद्योगिकी अनुवाद और प्रभाव सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल मानकीकरण और प्रजनन क्षमता महत्वपूर्ण है। इसके समाधान के लिए, पिछले कार्य में परिभाषित एडिटिव्स और मैट्रिस15, 23, 24, 25,26,27,28का उपयोग करके एचईसी और आईपीएससी से स्टेपवाइज भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया गया है। ऐसा करके, हेपेटोसिटे फेनोटाइप और प्रजनन क्षमता में सुधार किया गया है, जिससे भेदभाव प्रक्रिया19के अर्ध-स्वचालन की अनुमति दी गई है। प्रस्तुत प्रणाली ऑफ-द-शेल्फ सेल कल्चर मीडिया और एक फेसियल हेपेटोसाइट भेदभाव प्रणाली के साथ इसके संयोजन से मजबूत होती है।
इससे पहले, विभेदन प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले प्लुरिपोटेंट सेल घनत्व को हेपेटिक प्रोजेनिटर कोशिकाओं की समरूप आबादी को प्राप्त करने के लिए एक प्रमुख चर के रूप में रेखांकित किया गया था26। इस अधिक परिष्कृत प्रक्रिया का उपयोग करके, सेल घनत्व(तालिका 1)शुरू करने की एक श्रृंखला का उपयोग करके स्टेल सेल-व्युत्पन्न हेपेटिक जनकों की बड़ी संख्या को स्टेपवाइज तरीके से उत्पन्न करना संभव है। 5 दिन में, निश्चित एंडोडर्म प्रेरण Sox17 धुंधला(चित्रा 3)द्वारा मान्य किया गया था । निश्चित एंडोडर्म में कुशल और मजबूत भेदभाव परीक्षण ईएससी और आईपीएससी दोनों लाइनों के साथ हासिल किया गया था, जिसमें 80% से अधिक Sox17(चित्रा 3)व्यक्त किया गया था। 10 दिन में, हेपेटिक जनकों ने एक समान कोबलस्टोन जैसी आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया, और यकृत स्टेम सेल मार्कर एएफपी और एचएनएफ4α (>86%, चित्रा 4)दोनों के लिए अत्यधिक समृद्ध थे। मैनुअल और अर्ध-स्वचालित प्रौद्योगिकियों के संयोजन का उपयोग करके कई प्लेट प्रारूपों19में भेदभाव करना संभव था।
इसके वर्तमान रूप में, सेल भेदभाव इन विट्रो आधारित प्रयोग के लिए उपयुक्त है। हालांकि, यह सुनिश्चित करने के लिए नैदानिक आवेदन से पहले सेल संवर्धन की आवश्यकता होगी कि हेपेटिक जनकों की समरूप आबादी वितरण के लिए तैयार की जाती है।
अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर हेपेटिक जनकों का उत्पादन करने के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण के साथ क्षेत्र प्रदान करता है। भविष्य के काम के बाद एचएलसी भेदभाव, परिपक्वता, और रखरखाव के लिए एक नए माध्यम के उत्पादन पर ध्यान दिया जाएगा ।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को एमआरसी डॉक्टोरल ट्रेनिंग पार्टनरशिप (एमआर/K501293/1), यूके रिजेनरेटिव मेडिसिन प्लेटफॉर्म (एमआरसी एमआर/एल022974/1 और एमआर/के026666/1), मुख्य वैज्ञानिक कार्यालय (टीसीएस/16/37) के पुरस्कारों के साथ समर्थन दिया गया ।
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |