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Biochemistry

छोटे न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स के पॉलीन्यूक्लियोटाइड फॉस्फोरिलेशन को मापने के लिए गैर-रेड्रियक परख

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61258
Automatic Translation
1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

यह प्रोटोकॉल छोटे डीएनए और आरएनए सब्सट्रेट्स पर पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेसेस (पीएनके) की किनेज़ गतिविधि को मापने के लिए एक गैर-रेडिक परख का वर्णन करता है।

Abstract

पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेसेस (पीएनके) एंजाइम हैं जो डीएनए और आरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के 5 हाइड्रोक्सिल छोर के फॉस्फोरिलेशन को उत्प्रेरित करते हैं। पीएनके की गतिविधि को प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष दृष्टिकोणों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत पीएनके गतिविधि को मापने के लिए एक प्रत्यक्ष, इन विट्रो दृष्टिकोण है जो फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट और पॉलीएक्रेलिमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस पर निर्भर करता है। यह दृष्टिकोण रेडियोलेबल सब्सट्रेट्स के उपयोग से बचते हुए फॉस्फोरिलेटेड उत्पादों का समाधान प्रदान करता है। प्रोटोकॉल विवरण कैसे फॉस्फोरिलेशन प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, तैयार करने और बड़े पॉलीएक्रीलामाइड जैल चलाने के लिए, और प्रतिक्रिया उत्पादों की मात्रा। इस परख का सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हिस्सा बड़े पॉलीएक्रीलामाइड जैल को डालना और चलाना है; इस प्रकार, सामान्य कठिनाइयों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण विवरण प्रदान किए जाते हैं। इस प्रोटोकॉल को Grc3 के लिए अनुकूलित किया गया था, एक पीएनके जो अपने बाध्यकारी साथी, लास1 नाभिक के साथ एक अनिवार्य पूर्व-रिबोसोमल आरएनए प्रसंस्करण परिसर में इकट्ठा होता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को अन्य PNK एंजाइमों की गतिविधि को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस परख को प्रतिक्रिया के विभिन्न घटकों के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, जैसे न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट, धातु आयन, और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड।

Introduction

पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेसेस (पीएनके) डीएनए की मरम्मत और राइबोसोम असेंबली1,2,,3,,4,5जैसे कई डीएनए और आरएनए प्रसंस्करण मार्गों में महत्वपूर्ण भूमिकानिभातेहैं।, ये मौलिक एंजाइम एक न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट (एनटीपी, अक्सर एटीपी) से टर्मिनल (गामा) मोनोफॉस्फेट के हस्तांतरण को न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट के 5 ' हाइड्रोक्सिल छोर में उत्प्रेरित करते हैं। सबसे अच्छी तरह से विशेषता वाले पीएनके में से एक बैक्टीरियोफेज टी 4 पीएनके है, जिसमें व्यापक सब्सट्रेट विशिष्टता है और आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं द्वारा डीएनए या आरएनए सब्सट्रेट6,7,8,,,,,9,,11,12के 5 टर्मिनस पर रेडियोधर्मी आइसोटोप लेबल को शामिल करने के लिए भारी उपयोग कियाजाताहै।, पीएनके एंजाइम का एक अन्य उदाहरण सीएलपी 1 है, जो यूकेरिया, यूबैक्टीरिया और आर्चिया में पाया जाता है, और कई आरएनए प्रसंस्करणमार्गों 4,13,,,14, 15,में फंसायाजाताहै।

ऐतिहासिक रूप से, अधिकांश परखते हैं कि पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ गतिविधि को मापने रेडियोधर्मी आइसोटोप लेबलिंग और बाद में ऑटोरेडियोग्राफी5,,16पर निर्भर हैं। हाल के वर्षों में पीएनके गतिविधि को मापने के लिए कई अतिरिक्त परख विकसित की गई हैं, जिनमें एकल अणु दृष्टिकोण, माइक्रोचिप इलेक्ट्रोफोरेसिस, आणविक बीकन, साथ ही कोलोरिमेट्रिक और ल्यूमिनेसेंस आधारित परख17,18,,,19,,20, 21,,,2222शामिल हैं। जबकि इनमें से कई नए दृष्टिकोण बढ़ी हुई पहचान सीमा प्रदान करते हैं और रेडियोधर्मिता के उपयोग से बचते हैं, प्रत्येक में लागत, स्थिर राल पर निर्भरता और सब्सट्रेट विकल्प में सीमाएं जैसी कमियां हैं।

जीआरसी 3 एक पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ है जो प्री-रिबोसोमल आरएनए,2 ,3,23,के प्रसंस्करण में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाताहै। Grc3 एंडोरिबो न्यूक्लियज़ लास1 के साथ एक अनिवार्य परिसर बनाता है, जो प्री-रिबोसोमल आरएनए3के आंतरिक लिखित स्पेसर 2 (ITS2) को क्लीव्स करता है। Las1 द्वारा ITS2 का क्लीवेज एक उत्पाद उत्पन्न करता है जो 5 ' हाइड्रोक्सिल को शरण देता है जिसे बाद में जीआरसी 3 किनेज़ 3 द्वारा फॉस्फोरिलेटेड कियाजाताहै। जीआरसी 3 की न्यूक्लियोटाइड और सब्सट्रेट विशिष्टता की जांच करने के लिए, एक सस्ती परख जो विभिन्न ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स के परीक्षण की अनुमति देती थी। इसलिए, फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले सब्सट्रेट्स का उपयोग करके एक पीएनके फॉस्फोरिलेशन परख विकसित की गई थी। इस परख का सफलतापूर्वक उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि जीआरसी 3 फॉस्फोरिल स्थानांतरण गतिविधि के लिए किसी भी एनटीपी का उपयोग कर सकता है, लेकिन एटीपी24के पक्ष में है। यह प्रोटोकॉल अपने प्री-रिबोसोमल आरएनए सब्सट्रेट (एससी-ITS2, टेबल 1)की आरएनए नकल पर Grc3 की PNK गतिविधि को मापने के लिए मूल परख को अनुकूलित करता है। इस फ्लोरेसेंस-आधारित दृष्टिकोण का एक चुनौतीपूर्ण पहलू फॉस्फोरिलेटेड और नॉनफोस्फोरिलेटेड सब्सट्रेट्स को प्रभावी ढंग से हल करने के लिए बड़े पॉलीएक्रीलामाइड जैल पर निर्भरता है। प्रोटोकॉल कैसे इन बड़े जैल डालना है और आम नुकसान से बचने के लिए जब ऐसा करने पर विशिष्ट विवरण प्रदान करता है ।

आरएनए के साथ काम करने के लिए विशेष देखभाल की आवश्यकता होती है क्योंकि यह गिरावट के लिए दृढ़ता से अतिसंवेदनशील होता है। राइबोन्यूलेज संदूषण को सीमित करने के लिए सरल निवारक कदम उठाए जा सकते हैं। एक अलग आरएनए वर्कस्टेशन जिसे आसानी से आरएनएएस अवरोधक युक्त सफाई एजेंट के साथ इलाज किया जा सकता है, अक्सर सहायक होता है। नमूनों को संभालते समय हमेशा दस्ताने पहनना और RNase-मुक्त प्रमाणित उपभोग्य सामग्रियों का उपयोग आवश्यक है। क्योंकि पानी संदूषण का एक और आम स्रोत है, यह हौसले से शुद्ध पानी का उपयोग करें और एक ०.२२ μm फिल्टर का उपयोग कर सभी समाधान निष्फल करने के लिए सबसे अच्छा है ।

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Protocol

1. तैयारी

  1. बफर और रिएजेंट तैयार करें।
    1. 1 एम ट्रिज़ (पीएच = 8.0), 5 एम सोडियम क्लोराइड के 40 माइक्रोन, 2 एम मैग्नीशियम क्लोराइड के 2.5 माइक्रोन, 50% (v/v) ग्लिसरोल के 100 माइक्रोन और आरएनएसई-मुक्त पानी के 20 माइक्रोन के संयोजन से 1x रिएक्शन बफर करें।
    2. यूरिया लोडिंग डाई को 4.8 ग्राम यूरिया, 1 एम ट्रिज़ (पीएच = 8.0), 0.5 एम ईडीए (पीएच = 8.0), 0.5 एमएल 1% (w/v) ब्रोमोफेनॉल ब्लू, और RNase-मुक्त पानी के 200 माइक्रोन को मिलाकर 10 मिलियन की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए बनाएं।
    3. 108 ग्राम ट्रिज़ बेस, 55 ग्राम बोरिक एसिड, 0.5 एम ईडीटीए (पीएच = 8.0) के 40 एमएल और आरएनएसई-मुक्त पानी को 1 एल की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए मिलाकर 10x TBE बफर बनाएं।
    4. 10% (w/v) अमोनियम persulfate (एपीएस) बनाओ । एपीएस के 0.5 ग्राम वजन और ठोस भंग करने के लिए RNase मुक्त पानी के 3 mL जोड़ें। 5 एमएल की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए RNase-मुक्त पानी जोड़ें। ट्यूब को पन्नी में लपेटें और समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: समय के साथ भंग एपीएस क्षय । हर 2 सप्ताह में 10% एपीएस स्टॉक को बदलें।
  2. पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज एंजाइम प्राप्त करें।
    1. 20 माइक्रोन की स्टॉक एकाग्रता में प्रतिक्रिया बफर (चरण 1.1.1 देखें) में संग्रहीत शुद्ध Las1-Grc3 PNK एंजाइम 2 प्राप्त करें। भंडारण बफर विशिष्ट पीएनके के आधार पर भिन्न होगा।
  3. न्यूक्लिक एसिड सब्सट्रेट तैयार करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल 27 एनटी आरएनए सब्सट्रेट के 5'-फॉस्फोरिलेशन पर नज़र रखता है जो सैकरोमीसेस सेर्विसिया प्री-रिबोसोमल इंटरनल टरनार्ड स्पेसर 2 (एससी-ITS2; तालिका 1 देखें)2,25, 26,के भीतर निहित Las1-Grc3 प्रसंस्करण साइट (C2 साइट) को बंदरगाहों ।,26
    1. रासायनिक रूप से एक आरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट का संश्लेषण करें जिसमें 3'-फ्लोरोसेंट लेबल के साथ 5'-हाइड्रोक्सिल अंत होता है। फ्लोरोफोर का उपयोग आरएनए के दृश्य के लिए किया जाएगा। सुनिश्चित करें कि फ्लोरोफोर आरएनए छोर पर तैनात है जो फॉस्फोरिलेशन के लिए लक्षित नहीं है। वाणिज्यिक स्रोतों के विकल्प के रूप में, आरएनए सब्सट्रेट्स की आंतरिक और टर्मिनल फ्लोरोसेंट लेबलिंग लागत प्रभावी प्रोटोकॉल27का उपयोग करके घर में की जा सकती है।
    2. एचपीएलसी-शुद्धिकरण28द्वारा आरएनए लेबलिंग प्रतिक्रिया से अतिरिक्त फ्लोरोफोर निकालें ।
    3. 500 एनएम तक आरएनएसई-मुक्त पानी का उपयोग करके लियोफिलाइज्ड आरएनए को फिर से खर्च करें।
    4. लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस या अल्पकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए एलिकोट्स स्टोर करें।
  4. एटीपी कंसंट्रेशन सीरीज तैयार करें।
    1. रिएक्शन बफर का उपयोग करके एटीपी का 20 एमएमएम वर्किंग स्टॉक बनाएं (चरण 1.1.1 देखें)। 20 mm-0.02 mm से लेकर चार सीरियल कमजोर करने के लिए इस वर्किंग स्टॉक का उपयोग करें।
    2. एकाग्रता श्रृंखला के पहले कमजोर पड़ने के लिए, प्रतिक्रिया बफर के 9 माइक्रोन के साथ 20 mM एटीपी वर्किंग स्टॉक के 1 माइक्रोन मिलाएं। इसके परिणामस्वरूप 2 एमएम की अंतिम एकाग्रता के साथ एटीपी का 10 गुना कमजोर पड़ जाएगा।
    3. एकाग्रता श्रृंखला में अगले कमजोर पड़ने के लिए चरण 1.4.2 में उत्पन्न 2 mM एटीपी स्टॉक का उपयोग करें। रिएक्शन बफर के 9 माइक्रोन के साथ 2 एमएम एटीपी स्टॉक के 1 माइक्रोन मिलाएं। इससे 02 एमएम का नया एटीपी स्टॉक कंसंट्रेशन होगा।
    4. एकाग्रता श्रृंखला में बाद में एटीपी स्टॉक बनाने के लिए प्रतिक्रिया बफर के 9 माइक्रोन के साथ पिछले एटीपी स्टॉक के 1 माइक्रोन को कमजोर करना जारी रखें।

2. इन विट्रो आरएनए किनेस रिएक्शन

नोट: इस परख का उपयोग समय, न्यूक्लियोटाइड स्तर, या एंजाइम एकाग्रता जैसे कई चरों को मापने के लिए किया जा सकता है। इस प्रयोग का लक्ष्य लगातार Las1-Grc3 जटिल और अलग एटीपी स्तर की उपस्थिति में फॉस्फोरिलेटेड आरएनए की मात्रा का आकलन करना है।

  1. प्रत्येक आरएनए-एंजाइम किनेज़ प्रतिक्रिया के लिए, 500 एनएम आरएनए सब्सट्रेट के 1 माइक्रोन, 130 एनएम लास1-जीआरसी 3 के 8.3 माइक्रोन और 5 एमएम ईडीटीए के 0.2 माइक्रोन को मिलाएं।
    नोट: यदि कई प्रतिक्रियाओं को अंजाम देते हैं, तो आरएनए-एंजाइम मिश्रण का मास्टर स्टॉक तैयार करें और प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब पर इस मास्टर मिश्रण के 9.5 माइक्रोन का एक मास्टर स्टॉक तैयार करें।
  2. परख शुरू करें।
    1. हीट ब्लॉक को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
    2. 10 एस अंतराल पर, एक आरएनए-एंजाइम मिश्रण के साथ चरण 1.4 में तैयार एटीपी एकाग्रता श्रृंखला से एक एटीपी सबस्टॉक के 0.5 माइक्रोन मिलाएं और प्रतिक्रिया को 37 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में रखें।
      नोट: पीएनके नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक आरएनए-एंजाइम मिश्रण में एटीपी के बजाय प्रतिक्रिया बफर का 0.5 माइक्रोन जोड़ें। एक और आवश्यक नियंत्रण का उपयोग करें (यानी, पीएनके एंजाइम की अनुपस्थिति में आरएनए सब्सट्रेट)।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: फ्लोरोसेंटली-लेबल आरएनए प्रकाश संवेदनशील है; इसलिए, प्रतिक्रियाओं को पन्नी से ढकें।
    4. चरण 2.2.2 के समान क्रम का उपयोग करके, प्रत्येक प्रतिक्रिया को हर 10 एस को यूरिया लोडिंग डाई के 10 माइक्रोन के साथ प्रतिक्रिया को स्पाइकिंग करके बुझाें (चरण 1.1.2 देखें)।
      नोट: एंजाइम को नीचा दिखाने के लिए इस कदम पर 4 एम यूरिया के अलावा, प्रोटीन के जोड़ा जा सकता है। आपूर्तिकर्ता द्वारा आवश्यक प्रोटीज राशि और प्रतिक्रिया स्थितियों का निर्धारण करने के लिए प्रदान किए गए निर्देशों का पालन करें।
    5. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (सेक्शन 3 देखें) या बाद की तारीख में विश्लेषण करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के लिए तुरंत क्वेंच इन विट्रो आरएनए किनेस प्रतिक्रियाओं का उपयोग करें।

3. जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस

  1. 15% एक्रिलैमाइड/8 एम यूरिया जेल सॉल्यूशन तैयार करें।
    सावधानी: एक्रिलैमाइड को देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए, क्योंकि यह एक न्यूरोटॉक्सिन है। इसे संभालते समय हमेशा दस्ताने, लैब कोट और चश्मे पहनें।
    1. एक 150 मिलीएल ग्लास बीकर में, 22.5 एमएल प्रीमिक्स्ड 40% एक्रिलमाइड/बीआईएस-एक्रिलमाइड 29:1 समाधान, 10x TBE के 6 एमएल (चरण 1.1.3 देखें), यूरिया के 28.8 ग्राम, और RNase-मुक्त पानी की कुल मात्रा में 59 mL की कुल मात्रा के लिए गठबंधन। धीरे-धीरे समाधान हिलाएं।
      नोट: आरएनए सब्सट्रेट लंबाई के आधार पर, पॉलीएक्रीलामाइड के प्रतिशत में फेरबदल करने से अनफ़ोफोरिलेटेड और फॉस्फोरिलेटेड आरएनए के बीच संकल्प में सुधार हो सकता है।
    2. यूरिया को भंग करने के लिए, समाधान को माइक्रोवेव में 20 एस के लिए गर्म करें, तरल को हिलाएं, और तुरंत समाधान को एक और 20 एस के लिए माइक्रोवेव में वापस रखें। धीरे-धीरे समाधान को हिलाएं जब तक यूरिया पूरी तरह से घुल न जाए।
    3. धीरे-धीरे कांच बीकर को उथले पानी के स्नान में रखकर घोल को ठंडा करें जिसमें ठंडा पानी हो। सुनिश्चित करें कि ग्लास बीकर के आसपास के ठंडे पानी का स्तर ग्लास बीकर के अंदर समाधान के स्तर से ऊपर है। इससे कुशल हीट ट्रांसफर को बढ़ावा मिलेगा। 5 मिनट रुको।
      नोट: यदि ग्लास बीकर गर्म लगता है तो इस प्रोटोकॉल को जारी न रखें; पानी 25 डिग्री सेल्सियस से नीचे होना चाहिए। यदि यह अभी भी 5 मिनट के बाद गर्म लगता है, तो पानी स्नान में पानी को ताजा ठंडे पानी से बदलें और एक और 5 मिनट इंतजार करें।
    4. कणों और सूक्ष्म हवा बुलबुले को दूर करने के लिए 0.22 माइक्रोन डिस्पोजेबल निस्पंदन इकाई का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर और डीगैस करें।
  2. डेन्चरिंग जेल डालो।
    1. 31.0 सेमी x 38.5 सेमी के समग्र आयामों के साथ जैल के लिए डिज़ाइन की गई एक छोटी और लंबी ग्लास प्लेट को साफ करने के लिए साबुन और गर्म पानी का उपयोग करें। प्रत्येक ग्लास प्लेट को 95% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और किसी भी नमी को हटाने के लिए ग्लास को पोंछ दें।
      नोट: ग्लास प्लेट सैंडविच को अलग करते समय जेल को नुकसान को रोकने के लिए दो प्लेटों में से एक को सिलिकॉन किया जा सकता है। हालांकि, यह कदम आवश्यक नहीं है क्योंकि यह प्रोटोकॉल ग्लास प्लेटों को अलग किए बिना आरएनए की कल्पना करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
    2. एक बॉक्स के शीर्ष पर क्षैतिज रूप से लंबी कांच की प्लेट रखें ताकि यह बेंचटॉप से ऊंचा हो।
      सावधानी: एक्रिलैमाइड विषाक्त है, इसलिए जेल डालने का कार्य स्टेशन बेंच पेपर में कवर किया जाना चाहिए जो किसी भी गिराए गए तरल को अवशोषित कर सकता है और प्रक्रिया पूरी होने के बाद तुरंत एक बेकार बैग में रखा जाना चाहिए।
    3. लंबी कांच की प्लेट के लंबे किनारों के साथ एक साफ 0.4 मिमी स्पेसर रखें।
    4. लंबी प्लेट के ऊपर छोटी कांच की प्लेट बिछाएं और छोटी प्लेट, लंबी प्लेट और स्पेसर्स के किनारों को सुनिश्चित करें। तीन समान रूप से दूरी धातु क्लैंप का उपयोग कर प्रत्येक पक्ष क्लैंप।
    5. स्टेप 3.1 में तैयार 15% एक्रिलमाइड/8 एम यूरिया सॉल्यूशन में TEMED के 24 माइक्रोन जोड़ें और समाधान मिलाएं।
    6. चरण 3.2.5 में समाधान के लिए 10% (w/v) एपीएस (चरण 1.1.4 देखें) के 600 माइक्रोन जोड़ें और धीरे से समाधान मिलाएं।
    7. तुरंत कांच की प्लेटों के बीच समाधान डालना।
      नोट: बुलबुले से बचने के लिए, समाधान डाला जाता है के रूप में गिलास नल ।
    8. ध्यान से ग्लास प्लेट सैंडविच के शीर्ष पर एक साफ, 0.4 मिमी, 32 अच्छी तरह से कंघी जोड़ें।
    9. एक्रिलामाइड को पॉलीमराइज करने के लिए कम से कम 30 मिनट की अनुमति दें।
  3. डेन्चरिंग जेल चलाएं।
    1. हीट ब्लॉक को 75 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
    2. ग्लास प्लेट सैंडविच को एक साथ रखने वाले मेटल क्लैंप को हटा दें और ग्लास प्लेट सैंडविच को अच्छी तरह धोकर सुखा लें।
    3. कांच की प्लेट सैंडविच को जेल उपकरण में रखें जिसमें छोटी प्लेट अंदर की ओर आ रही है।
    4. 1.9 एल आरएनएएस-मुक्त पानी के साथ 10x TBE के 100 एमएल के संयोजन से 0.5x TBE रनिंग बफर तैयार करें। जेल उपकरण के ऊपरी और निचले कक्षों में चल रहे बफर के 600 एमएल जोड़ें।
    5. धीरे-धीरे कंघी निकालें और एक सिरिंज का उपयोग करके कुओं को अच्छी तरह से कुल्ला करें।
      नोट: यह कदम कुओं से यूरिया निकालने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    6. प्री-रन 50 डब्ल्यू वोल्टेज पर 30 मिनट के लिए जेल लगभग 2,000 वी है।
      सावधानी: यह जेल तंत्र एक उच्च वाट पर संचालित होता है और उपयोगकर्ताओं को एहतियात प्रदर्शित करना चाहिए।
    7. एक सिरिंज का उपयोग कर अच्छी तरह से कुओं कुल्ला।
      नोट: यह कदम कुओं में नमूना लोड करने के लिए भी महत्वपूर्ण है ।
    8. पल्स चरण 2.2.5 से शमन प्रतिक्रियाओं स्पिन। फिर 3 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। पल्स स्पिन दोहराएं।
    9. तुरंत प्रति अच्छी तरह से नमूना के 10 μL लोड और 50 डब्ल्यू पर 3 घंटे के लिए जेल चलाते हैं।
      नोट: फ्लोरोसेंटली-लेबल आरएनए प्रकाश संवेदनशील है; इसलिए, जेल तंत्र को पन्नी से ढक दें।
  4. छवि डेन्चरिंग जेल।
    1. बिजली की आपूर्ति बंद कर दें और जेल तंत्र के ऊपरी कक्ष को छान लें।
    2. साबुन और पानी का उपयोग करके ग्लास प्लेट सैंडविच के बाहरी हिस्से को धोएं और सुखा लें। जेल का परिवहन करते समय ग्लास प्लेट सैंडविच को पन्नी से ढक दें।
    3. मात्रात्मक और संवेदनशील फ्लोरेसेंस का पता लगाने में सक्षम लेजर स्कैनर के मंच पर ग्लास प्लेट सैंडविच माउंट करें।
      नोट: यह जेल अधिकतम संकल्प के लिए बेहद पतली है। इस कारण से, यह प्रोटोकॉल ग्लास प्लेट सैंडविच से जेल को हटाने की कठिनाइयों से बचने के लिए डिज़ाइन किया गया है, सीधे ग्लास प्लेट के माध्यम से फ्लोरोसेंटली-लेबल आरएनए की कल्पना करके। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कम फ्लोरेसेंस ग्लास प्लेटों के उपयोग से सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करके कैप्चर किए गए सिग्नल में वृद्धि होगी।
    4. वांछित फ्लोरोफोर के लिए लेजर स्कैनर की उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य निर्धारित करें।
      नोट: इष्टतम उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य विशिष्ट फ्लोरोफोर के लिए अलग हो सकते हैं। एफएएम फ्लोरोफोर के लिए, उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य क्रमशः 495 एनएम और 535 एनएम हैं।
    5. लेजर स्कैनर चरण पर कल्पना करने के लिए क्षेत्र को परिभाषित करें और निर्माता के निर्देशों(चित्र 1)के अनुसार जेल की छवि बनाएं।

4. छवि विश्लेषण और संकेत मात्राकरण

  1. चरण 3.4.5 में अधिग्रहीत डिजिटल जेल छवि को इमेज प्रॉसेसिंग सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) में लोड करें।
  2. माउस के बाएं बटन का उपयोग करके, डिजिटल जेल छवि पर सीमाओं को चिह्नित करने के लिए एक टेम्पलेट बॉक्स को परिभाषित करने के लिए एक आयत पर क्लिक करें और खींचें जिसका उपयोग प्रत्येक आरएनए बैंड को निर्धारित करने के लिए किया जाएगा। पीएनके एंजाइम की अनुपस्थिति में सेट रिएक्शन मिश्रण में देखा गया आरएनए बैंड आमतौर पर इस टेम्पलेट को उत्पन्न करने के लिए एक अच्छा बैंड होता है।
    नोट: पृष्ठभूमि संकेत की वजह से पूर्वाग्रह से बचने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक आरएनए बैंड के आसपास के क्षेत्र मापा जा रहा है समान है । इस कारण से, प्रत्येक आरएनए बैंड का सीमांकन करने के लिए एक ही टेम्पलेट बॉक्स का उपयोग करना सबसे अच्छा है।
  3. 'टूल्स'के तहत आरओआई मैनेजर खोलें और"ऐड"पर क्लिक करके टेम्पलेट बॉक्स की स्थिति को चिह्नित करें।
    नोट: क्वांटिटेशन प्रोग्राम सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता मैनुअल का पालन करते हुए स्वचालित रूप से बक्से भी खींच सकते हैं।
  4. माउस के बाएं बटन का उपयोग करके, टेम्पलेट बॉक्स को अगले आरएनए बैंड पर क्लिक करें और खींचें और चरण 4.3 दोहराएं। इस प्रक्रिया को तब तक जारी रखें जब तक कि प्रत्येक प्रतिक्रिया में सभी अनफोस्फोरिलेटेड और फॉस्फोरलेटेड आरएनए बैंड की स्थिति को चिह्नित नहीं किया गया है।
  5. आरओआई प्रबंधक में"उपाय"पर क्लिक करके प्रत्येक बॉक्स के भीतर एकीकृत घनत्व को मापें।
  6. एक प्रतिक्रिया में फॉस्फोरिलेटेड आरएनए की सापेक्ष मात्रा की गणना करने के लिए, एक ही प्रतिक्रिया से अफ़ोष्णीकृत और फॉस्फोरिलेटेड आरएनए बैंड के एकीकृत घनत्व के योग से फॉस्फोरीलेटेड आरएनए बैंड के एकीकृत घनत्व को विभाजित करें। यह दृष्टिकोण भी अनफोस्फोरलेटेड आरएनए की सापेक्ष राशि की गणना करने के लिए लागू किया जा सकता है।
  7. फॉस्फोरिलेटेड आरएनए उत्पाद के संचय और एटीपी एकाग्रता श्रृंखला में अनफॉफोरलेटेड आरएनए सब्सट्रेट की इसी कमी की कल्पना करने के लिए, एटीपी की एकाग्रता के खिलाफ चरण 4.6 में गणना की गई आरएनए की सापेक्ष राशि की साजिश करें।

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Representative Results

Las1-Grc3 परिसर की एक निश्चित राशि के साथ एटीपी के एक टिटरेशन का एक सफल प्रतिनिधि डेनैचिंग जेल चित्र 1में दिखाया गया है। एंजाइम के अलावा SC-ITS2 आरएनए सब्सट्रेट के Las1-मध्यस्थता आरएनए दरार के परिणामस्वरूप, एक परिभाषित आरएनए टुकड़ा (5-ओह C2 आरएनए) के लिए अग्रणी । एटीपी के अलावा, C2 आरएनए टुकड़ा Grc3 PNK (5-P C2 आरएनए) द्वारा फॉस्फोरिलेटेड किया गया था । डेन्चरिंग जैल में फॉस्फोरीलेटेड आरएनए अपने अफ़ोष्ण समकक्ष की तुलना में तेजी से प्रवास करता है। जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है, C2 आरएनए टुकड़े के फॉस्फोरिलेशन को एटीपी एकाग्रता के खिलाफ अनफॉल्फोरिलेटेड और फॉस्फोरिलेटेड C2 आरएनए की सापेक्ष राशि की साजिश रचकर कल्पना की जा सकती है। Grc3 PNK भी बिना कटे अनुसूचित जाति के 5 अंत-ITS2 सब्सट्रेट, हालांकि एक कम दर पर फॉस्फोरिल । यह पिछले काम की पुष्टि करता है जो Grc3 PNK का सुझाव देता है जो अपने C2 आरएनए सब्सट्रेट24के प्रति सब्सट्रेट वरीयता दिखाता है । चित्र 3 में एक असफल डेनैचिंग जेल दिखाया गयाहै । यह जेल असफल रहा क्योंकि 21 एनटी आरएनए सब्सट्रेट में गिरावट वाले उत्पाद(चित्रा 3,पहली लेन) शामिल थे। ये गिरावट उत्पाद फॉस्फोरिलेटेड उत्पाद के साथ छा गए और फॉस्फोरिलेशन को सटीक रूप से निर्धारित करना असंभव बना दिया। इसके विपरीत, सबसे कम आरएनए क्षरण उत्पाद(चित्रा 3,ग्रे तीर) का सफलतापूर्वक विश्लेषण किया जा सकता है क्योंकि जेल के इस क्षेत्र में कोई अतिरिक्त आरएनए प्रजाति नहीं थी जो इसके फॉस्फोरिलेटेड समकक्ष के सटीक मात्राकरण में रुकावट थी। आरएनए क्षरण बैंड से बचने के लिए, कार्यक्षेत्र और समाधान RNase मुक्त रखने के लिए, और आरएनए फ्रीज-गल चक्र की संख्या को सीमित ।

Figure 1
चित्रा 1: फॉस्फोरलेटेड आरएनए के डेन्चरिंग जेल विश्लेषण का उदाहरण। लास1-जीआरसी 3 (110 एनएम) के विट्रो आरएनए किनेस परख में 500 एनएम एससी-ITS2 आरएनए के साथ इनक्यूबेटेड। एक्स Las1-Grc3 के बिना नियंत्रण प्रतिक्रिया को चिह्नित करता है और काला त्रिकोण 0-10 mM से एटीपी के टिटरेशन का प्रतिनिधित्व करता है। C2 आरएनए Las1 नाभिक द्वारा अनुसूचित जाति-ITS2 आरएनए दरार का परिणाम है और Grc3 PNK गतिविधि के लिए अंतर्जात सब्सट्रेट है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आरएनए फॉस्फोरिलेशन का मात्राकरण। एक एटीपी एकाग्रता श्रृंखला में Las1-Grc3 आरएनए किनेज़ गतिविधि के Densiometric भूखंड को अनफोफेरेटेड C2 आरएनए (ग्रे लाइन; 5-OH C2 आरएनए) और फॉस्फोरीलेटेड C2 आरएनए (ब्राउन लाइन; 5-पी C2 आरएनए) के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया । त्रुटि सलाखों के तीन स्वतंत्र तकनीकी प्रतिकृति से मानक विचलन को चिह्नित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फॉस्फोरलेटेड आरएनए के असफल डेन्चरिंग जेल विश्लेषण का उदाहरण। T4 PNK (0-0.625 यू) के विट्रो आरएनए kinase परख में 5 μm 21 nt आरएनए के साथ इनक्यूबेटेड । एक्स T4 PNK के बिना नियंत्रण प्रतिक्रिया के निशान। इस आरएनए में केवल नियंत्रण में अवक्रमित आरएनए उत्पाद होते हैं जो 21 एनटी फॉस्फोरिलेटेड उत्पाद को गिरावट उत्पाद (काले तीर) से अलग करना असंभव बनाते हैं। सबसे कम आरएनए डिजिडेशन उत्पाद (ग्रे तीर) के फॉस्फोरिलेशन का विश्लेषण किया जा सकता है, क्योंकि कोई डीरेडेशन उत्पाद नहीं हैं जो इसके फॉस्फोरिलेटेड समकक्ष के साथ ओवरलैप होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुक्रम (5'→3') ओलिगो कोड मूल
SC-ITS2 GUCGUUUUAGGUUUUAC
CAACUGCGGC/36-FAM/		 मप्र 911 (पिलन एट अल. एनएसएमबी 2019) 26
C2 आरएनए GGUUUUACCAACUG
सीजीजीसी/36-एफएएम/		 N/A SC-ITS2 के Las1 दरार उत्पाद
21-एनटी ACGUACGCGGAA
UACUUCGAA/36-TAMSp/		 मप्र 596 (पिलन एट अल आरएनए, 2018) 24

तालिका 1: फ्लोरोसेंटली-लेबल आरएनए सब्सट्रेट्स।

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Discussion

वर्णित फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स पर Grc3 PNK की काइनेज गतिविधि को मापने के लिए एक परख है। इस प्रोटोकॉल को रिएक्शन बफर और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट को अनुकूल बनाकर अन्य पीएनके एंजाइमों की विशेषता के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल ईडीटीए की ट्रेस राशि का आह्वान करता है। EDTA के अलावा दो कारणों के लिए फायदेमंद है: सबसे पहले, यह दृष्टिकोण मिश्रण में दूषित धातुओं की मात्रा का पता लगाने के लिए बाध्यकारी से एंजाइम को रोकने के द्वारा मैग्नीशियम से बंधे Grc3 एहसान । दूसरा, EDTA की एक छोटी राशि संबद्ध Las1 धातु स्वतंत्र राइबोन्यूलेज की गतिविधि को बाधित किए बिना धातु पर निर्भर रिबोन्यूक्लियस को दूषित करने की गतिविधि को रोकती है। विशिष्ट पीएनके के स्रोत के आधार पर ईडीटीए की एकाग्रता को बदला जा सकता है। यह परख पारंपरिक पीएनके फॉस्फोरिलेशन पर एक लाभ भी प्रदान करता है जो छोटे आधे जीवन रेडियोआइसोटोप (यानी, फास्फोरस-32 के लिए 2 सप्ताह आधा जीवन) के साथ लेबल किए गए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स पर भरोसा करते हैं। इस प्रोटोकॉल को विशिष्ट एंजाइम गतिविधि और माइकलिस-मेंटेन काइनेटिक्स को मापने के साथ-साथ विभिन्न मापदंडों पर फॉस्फोरिलेशन की निर्भरता निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे न्यूक्लियोटाइड्स, सब्सट्रेट्स और धातु आयनों की प्रकृति।

यह प्रोटोकॉल अपने फॉस्फोरिलेटेड उत्पाद से एक अनफॉफोरलेटेड सब्सट्रेट को अलग करने के लिए पर्याप्त संकल्प प्राप्त करने के लिए बड़े डेन्चरिंग पॉलीएक्रीलामाइड जैल चलाने पर निर्भर करता है। इन जैल को डालने और संभालने के प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं। उदाहरण के लिए, यूरिया को भंग करने के लिए एक्रिलैमाइड समाधान को गर्म किया जाना चाहिए और फिर जेल डालने से पहले धीरे-धीरे ठंडा होना चाहिए। इस समाधान को बहुत जल्दी ठंडा करने से क्रिस्टल का निर्माण हो सकता है। जेल डालने और स्थापित करते समय हवा के बुलबुले और धूल को पेश करने से बचने के लिए भी देखभाल की जानी चाहिए। ग्लास प्लेटों को हटाने के बिना जेल इमेजिंग जेल तेजस्वी से बचने के लिए सिफारिश की जाती है, जो पतली है और एक बार कांच की प्लेटों से हटा दिया जाता है।

इस प्रोटोकॉल को विभिन्न आकार के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स के फॉस्फोरिलेशन को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस विशेष परख ने 27 एनटी (एससी-ITS2 आरएनए) और 18 एनटी (C2 आरएनए) सब्सट्रेट्स के फॉस्फोरिलेशन के समाधान को प्राप्त करने के लिए 15% एक्रिलामाइड जेल का उपयोग किया। अनुसूचित जाति के 5-अंत में एक फॉस्फेट समूह के अलावा-ITS2 आरएनए छोटे C2 आरएनए(चित्रा 1)के 5-फॉस्फोरिलेशन पर प्रेरित गतिशीलता परिवर्तन की तुलना में एक मामूली बदलाव पैदा करता है । यह इस तकनीक का उपयोग करते समय आरएनए लंबाई में एक सीमा पर प्रकाश डाला गया है। लंबे आरएनए सब्सट्रेट्स के साथ, आरएनए प्रजातियों के समग्र आणविक वजन में फॉस्फेट समूह का योगदान कम हो जाता है। इस कारण से, एक्रिलैमाइड के प्रतिशत के साथ-साथ जेल रनिंग टाइम को विभिन्न आकार के सब्सट्रेट्स29के संकल्प को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, एक्रिलैमाइड के उच्च प्रतिशत का उपयोग छोटे ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स के लिए किया जाता है जबकि एक्रिलैमाइड का प्रतिशत कम होता है (8%) बड़े ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स का बेहतर समाधान प्रदान करें।

इस परख की बड़ी सीमा यह है कि यह कम थ्रूपुट है। एक दिन में विश्लेषण किए जा सकने वाले जैल और नमूनों की संख्या को सीमित करते हुए, डालने का कार्य और चल रहे जैल में काफी समय लगता है। इस सीमा को दूर करने के लिए एक भविष्य का आवेदन माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स का विकास हो सकता है जो फॉस्फोरिलेटेड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड उत्पादों को हल करने में सक्षम है। माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस में पारंपरिक जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस पर कई फायदे हैं, जैसे कि छोटे नमूना आकार, स्वचालन और गति। हालांकि, वर्तमान माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में एकल न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन नहीं होता है। अंत में, गैर-वैज्ञानिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के परिवर्तित प्रवास का पता लगाने के लिए डीनाटरिंग जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग उत्प्रेरक आवश्यकताओं की निगरानी करने और पॉलीक्लिकोटिसाइड किनेज़ एंजाइमों की सब्सट्रेट वरीयता के लिए एक उपयोगी तकनीक प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ एंड्रयू सिकेमा और एंड्रिया काइनस्की को इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था; अमेरिका के राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS; जिया ES103247 से आरईएस) और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (सीआईएचआर; 146626 से एम.C.पी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mm 34-well comb BioRad 1653848
0.4 mm spacer BioRad 1653812
0.5 M EDTA ph 8.0 KD Medical RGF-3130
1M Magnesium Chloride KD Medical CAC-5290
1M Tris pH 8.0 KD Medical RGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 BioRad 1610146
5M Sodium Chloride KD Medical RGF-3720
ammonium persulfate (APS) BioRad 161-0700
ATP Sigma A2383-1G
boric acid Sigma B0394
bromophenol blue sodium salt Sigma B5525-5G
Glass Plates Thomas Scientific 1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer Hoefer N/A
Image J Software N/A N/A https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides IDT Custom Order
Pharmacia EPS 3500 Power Supply Pharmacia N/A
Steriflip 0. 22 um Filter Millipore 5FCP00525
TEMED BioRad 161-0800
tris base Sigma TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager GE Healthcare N/A
Ultra Pure DEPC Water Invitrogen 750023
Ultra Pure Glycerol Invitrogen 19E1056865
urea Fisher Chemical U15-500

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References

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छोटे न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स के पॉलीन्यूक्लियोटाइड फॉस्फोरिलेशन को मापने के लिए गैर-रेड्रियक परख
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Pillon, M. C., Stanley, R. E.… More

Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (159), e61258, doi:10.3791/61258 (2020).

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