Summary
Detta protokoll beskriver en nonradioactive assay att mäta kinas aktivitet av polynucleotide kinases (PNKs) på små DNA och RNA substrat.
Abstract
Polynukleotidkinaser (PNKs) är enzymer som katalyserar fosforylering av 5' hydroxyländen av DNA och RNA oligonukleotider. PK:rnas verksamhet kan kvantifieras med hjälp av direkta eller indirekta tillvägagångssätt. Presenteras här är en direkt, in vitro-strategi för att mäta PNK verksamhet som bygger på en fluorescerande-märkt oligonukleotid substrat och polyakrylamid gel elektrofores. Detta tillvägagångssätt ger upplösning av de fosforylerade produkterna samtidigt som man undviker användning av radiomärkta substrat. Protokollet beskriver hur man ställer in fosforyleringsreaktionen, förbereder och kör stora polyakrylamidgeler och kvantifierar reaktionsprodukterna. Den mest tekniskt utmanande delen av denna analys är hälla och köra de stora polyakrylamide geler; således lämnas viktiga detaljer för att övervinna gemensamma svårigheter. Detta protokoll optimerades för Grc3, en PNK som monterar in i ett obligate pre-ribosomal RNA-bearbeta komplex med dess bindande partner, Las1-nucleaseen. Detta protokoll kan dock anpassas för att mäta aktiviteten hos andra PNK-enzymer. Dessutom kan denna analys också modifieras för att bestämma effekterna av olika komponenter i reaktionen, såsom nukleosidtrifosfat, metalljoner, och oligonukleotider.
Introduction
Polynukleotid kinaser (PNK) spelar kritiska roller i många DNA och RNA bearbetning vägar, såsom DNA reparation och ribosom montering1,2,3,4,5. Dessa fundamentala enzymer katalyserar överföringen av terminalen (gamma) monofosfat från en nukleosid triphosphate (NTP, oftast ATP) till 5' hydroxyl slutet av en nukleotid substrat. En av de mest väl karakteriserade PNKs är bakteriofage T4 PNK, som har bred substrat specificitet och är kraftigt utnyttjad av molekylärbiologiska laboratorier för att införliva radioaktiva isotopetiketter på 5-ändstationen av ett DNA- eller RNA-substrat6,7,8,9,10,11,12. Ett annat exempel på ett PNK-enzym är CLP1, som finns i Eukarya, Eubacteria, och Archaea, och är inblandad i flera RNA bearbetning vägar4,13,14,15.
Historiskt sett är de flesta analyser som mäter polynukleotid kinas aktivitet beroende av radioaktiv isotop märkning och efterföljande autoradiografi5,16. Under de senaste åren har ett antal ytterligare analyser utvecklats för att mäta PNK aktivitet, inklusive enmolekyl metoder, mikrochipelektrofores, molekylära fyrar, samt koloritiska och luminimetriska analyser17,18,19,20,21,22. Medan många av dessa nya metoder ger förbättrade detektionsgränser och undvika användning av radioaktivitet, har var och en nackdelar, såsom kostnad, beroende av immobiliserad harts, och begränsningar i substrat val.
Grc3 är en polynukleotidkinas som spelar en central roll i bearbetningen av pre-ribosomal RNA2,3,23. Grc3 bildar ett obligate komplex med endoribonucleaseen Las1, som klyver den inre Transkriberade Spacer 2 (ITS2) av pre-ribosomal RNA3. Klyvning av ITS2 genom Las1 genererar en produkt som hyser en 5' hydroxyl som därefter fosforyleras av Grc3-kinasen3. För att undersöka nukleotid och substrat specificitet Av Grc3, en billig analys som tillät testning av olika oligonukleotid substrat krävdes. Därför utvecklades en PNK fosforyleringsanalys med hjälp av fluorescerande-märkta substrat. Denna analys användes framgångsrikt för att fastställa att Grc3 kan utnyttja någon NTP för fosforyl överföring verksamhet, men gynnar ATP24. Detta protokoll anpassar den ursprungliga analysen för att mäta PNK-aktivitet av Grc3 på en RNA-härma av dess pre-ribosomala RNA-substrat (SC-ITS2, tabell 1). En utmanande aspekt av denna fluorescensbaserade strategi är beroendet av stora polyakrylamidgeler för att effektivt lösa fosforylerade och icke-fosforylerade substrat. Protokollet ger specifika detaljer om hur man häller dessa stora geler och undvika vanliga fallgropar när du gör det.
Att arbeta med RNA kräver särskild omsorg eftersom det är starkt mottagligt för nedbrytning. Det finns enkla förebyggande åtgärder man kan vidta för att begränsa föroreningen av ribonukleas. En separat RNA-arbetsstation som enkelt kan behandlas med ett RNase-hämmare-innehållande rengöringsmedel är ofta till hjälp. Alltid bär handskar när du hanterar prover och användning av RNase-fria certifierade förbrukningsvaror är nödvändig. Eftersom vatten är en annan vanlig föroreningskälla är det bäst att använda nyrenat vatten och sterilisera alla lösningar med hjälp av ett 0,22 μm-filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse
- Förbered buffert och reagenser.
- Gör 1x Reaction Buffer genom att kombinera 20 μL av 1 M Tris (pH = 8,0), 40 μL av 5 M natriumklorid, 2,5 μL av 2 M magnesiumklorid, 100 μL av 50% (v/v) glycerol, och RNase-fritt vatten för att nå en total volym på 1 mL.
- Gör urea lastning färgämne genom att kombinera 4,8 g urea, 200 μL av 1 M Tris (pH = 8,0), 20 μL av 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 mL på 1% (w / v) bromofenol blå, och RNase-fritt vatten för att nå en total volym på 10 mL.
- Gör 10x TBE buffert genom att kombinera 108 g Tris bas, 55 g borsyra, 40 mL av 0,5 M EDTA (pH = 8,0), och RNase-fritt vatten för att nå en total volym av 1 L.
- Gör 10% (w/ v) ammoniumpersulfate (APS). Väg 0,5 g APS och tillsätt 3 mL RNasefritt vatten för att lösa upp det fasta. Tillsätt RNasefritt vatten för att nå en total volym på 5 mL. Linda röret i folie och förvara lösningen i 4 °C.
OBS: Upplöst APS sönderfaller med tiden. Byt ut 10% APS lager var 2 veckor.
- Få polynukleotid kinas enzym.
- Förvärva rent Las1-Grc3 PNK-enzym2 lagrat i Reaction Buffer (se steg 1.1.1) i en lagerkoncentration på 20 μM. Lagringsbufferten kommer att variera beroende på den specifika PNK.
- Förbered nukleinsyra substrat.
OBS: Detta protokoll övervakar 5'-fosforylering av ett 27 nt RNA-substrat som hyser Las1-Grc3-bearbetningsstället (C2-stället) som finns inom Saccharomyces cerevisiae före ribosomala interna transkriberade distanser 2 (SC-ITS2; se tabell 1)2,25,26.- Kemiskt syntetisera ett RNA oligonukleotid substrat som innehåller en 5'-hydroxylände tillsammans med en 3'-fluorescerande etikett. Fluorophoreen ska används för visualizationen av RNA. Se till att fluorofore är placerad på RNA-änden som inte är riktad mot fosforylering. Som ett alternativ till kommersiella källor kan intern och terminal fluorescerande märkning av RNA-substrat utföras i egna regi med hjälp avkostnadseffektiva protokoll 27.
- Avlägsna överskott av fluorophore från RNA-märkningsreaktionen genom HPLC-rening28.
- Resuspend den lyophilized RNA som använder RNase-fritt bevattnar till 500 nM.
- Förvara RNA-alikvoter vid -80 °C för långtidsförvaring eller -20 °C för korttidsförvaring.
- Förbered ATP-koncentrationsserien.
- Gör ett arbetslager på 20 mM av ATP med hjälp av Reaction Buffer (se steg 1.1.1). Använd detta arbetslager för att generera fyra serieutspädningar från 20 mM-0,02 mM.
- För att göra den första utspädningen av koncentrationsserien, blanda 1 μL av 20 mM ATP arbetslagret med 9 μL Reaction Buffer. Detta kommer att resultera i en 10-faldig utspädning av ATP med en slutkoncentration på 2 mM.
- Använd 2 mM ATP-lager som genereras i steg 1.4.2 för att göra nästa utspädning i koncentrationsserien. Blanda 1 μL av 2 mM ATP-buljong med 9 μL Reaktionsbuffert. Detta kommer att göra en ny ATP lager koncentration av 0,2 mM.
- Fortsätt späda 1 μL av det tidigare ATP-lagret med 9 μL Reaction Buffer för att göra det efterföljande ATP-lagret i koncentrationsserien.
2. In vitro RNA-kinasreaktion
OBS: Denna analys kan användas för att mäta flera variabler såsom tid, nukleotidnivåer, eller enzymkoncentration. Målet med detta experiment är att bedöma mängden fosforylerat RNA i närvaro av konstant Las1-Grc3 komplexa och varierande ATP-nivåer.
- För varje RNA-enzymkinasreaktion, kombinera 1 μL av 500 nM RNA-substrat, 8,3 μL av 130 nM Las1-Grc3, och 0,2 μL av 5 mM EDTA.
OBS: Om du utför flera reaktioner, preparera ett masterstock av RNA-enzymblandningen och alikvoten 9,5 μL av denna mastermix till varje reaktionsrör. - Starta analysen.
- Ställ in värmeblocket på 37 °C.
- Med 10 s intervaller, blanda 0,5 μL av ett ATP-dellager från ATP-koncentrationsserien som bereds i steg 1.4 med en RNA-enzymblandning och placera reaktionen i 37 °C-värmeblocket.
OBS: Tillsätt 0,5 μL Reaction Buffer istället för ATP till en RNA-enzymblandning för en PNK-negativ kontroll. Använd en annan nödvändig kontroll samt (dvs. RNA substrat i avsaknad av PNK enzym). - Inkubera reaktionerna i 60 min vid 37 °C.
OBS: Fluorescently-märkt RNA är ljuskänslig; därför täcka reaktionerna med folie. - Med samma ordning som i steg 2.2.2, släck varje reaktion var 10:e s genom att tillsatta reaktionen med 10 μL urea lastfärgningsmedel (se steg 1.1.2).
OBS: Förutom 4 M urea kan proteinas K tillsättas vid detta steg för att bryta ned enzymet. Följ de instruktioner som leverantören tillhandahåller för att fastställa erforderlig proteasmängd och reaktionsförhållanden. - Använd de släckta in vitro RNA-kinasreaktionerna omedelbart för nedströmsanalys (se avsnitt 3) eller förvara vid -20 °C som ska analyseras vid ett senare tillfälle.
3. Gelelektrofores
- Förbered 15% akrylamid/8 M urea gellösning.
VAR FÖRSIKTIG: Akrylamid måste hanteras varsamt, eftersom det är ett nervgift. Använd alltid handskar, en labbrock och skyddsglasögon när du hanterar den.- I en glasbägare på 150 mL, kombinera 22,5 mL färdigblandad 40% akrylamid/bis-akrylamid 29:1-lösning, 6 mL 10x TBE (se steg 1.1.3), 28,8 g urea och RNasefritt vatten till en total volym på 59 mL. Rör om försiktigt lösningen.
OBS: Beroende på RNA-substratlängden kan en ändring av andelen polyakrylamid förbättra upplösningen mellan ophosphorylerat och fosforylerat RNA. - För att lösa upp urea, värm lösningen i mikrovågsugnen för 20 s, rör om vätskan, och omedelbart placera lösningen tillbaka i mikrovågsugnen i ytterligare 20 s. Rör försiktigt om lösningen tills ureaen helt löses upp.
- Kyl långsamt lösningen genom att placera glasbägaren i ett grunt vattenbad som innehåller kallt vatten. Se till att nivån av kallt vatten som omger glasbägaren är över lösningsnivån inuti glasbägaren. Detta kommer att främja effektiv värmeöverföring. Vänta 5 min.
OBS: Fortsätt inte med detta protokoll om glasbägaren känns varm; vattnet ska ligga under 25 °C. Om det fortfarande känns varmt efter 5 min, byt sedan ut vattnet i vattenbadet mot färskt kallt vatten och vänta ytterligare 5 min. - Filtrera och avgasa lösningen med hjälp av en 0,22 μm engångsfiltreringsenhet för att avlägsna partiklar och mikroskopiska luftbubblor.
- I en glasbägare på 150 mL, kombinera 22,5 mL färdigblandad 40% akrylamid/bis-akrylamid 29:1-lösning, 6 mL 10x TBE (se steg 1.1.3), 28,8 g urea och RNasefritt vatten till en total volym på 59 mL. Rör om försiktigt lösningen.
- Häll denatureringsgelen.
- Använd tvål och varmt vatten för att rengöra en kort och lång glasplatta avsedd för geler med övergripande mått på 31,0 cm x 38,5 cm. Spraya varje glasplatta med 95% etanol och torka av glaset för att ta bort eventuell fukt.
OBS: En av de två plattorna kan silikoniseras för att förhindra skador på gelen vid separering av glasplattans smörgås. Det här steget är dock inte nödvändigt eftersom detta protokoll är utformat för att visualisera RNA utan att separera glasplattorna. - Placera den långa glasplattan horisontellt ovanpå en låda så att den är förhöjd utanför bänkskivan.
VAR FÖRSIKTIG: Akrylamid är giftigt, därför måste gelinhällstationen täckas i bänkpapper som kan absorbera eventuell spilld vätska och omedelbart placeras i en avfallspåse efter att ingreppet är klart. - Placera en ren 0,4 mm distans längs långa kanter av den långa glasplattan.
- Lägg den korta glasplattan ovanpå den långa plattan och se till att kanterna på den korta plattan, lång plattan och distanserna är inriktade. Kläm fast varje sida med hjälp av tre jämnt fördelade metallklämmor.
- Tillsätt 24 μL TEMED till den 15% akrylamid/8 M urealösning som bereds i steg 3.1 och blanda lösningen.
- Tillsätt 600 μL på 10 % (w/v) APS (se steg 1.1.4) till lösningen i steg 3.2.5 och blanda lösningen försiktigt.
- Häll omedelbart lösningen mellan glasplattorna.
OBS: För att undvika bubblor, knacka glaset som lösningen hälls. - Tillsätt försiktigt en ren, 0,4 mm, 32 väl kam till toppen av glasplattan smörgås.
- Låt minst 30 min för akrylamiden att polymerisera.
- Använd tvål och varmt vatten för att rengöra en kort och lång glasplatta avsedd för geler med övergripande mått på 31,0 cm x 38,5 cm. Spraya varje glasplatta med 95% etanol och torka av glaset för att ta bort eventuell fukt.
- Kör denatureringsgelen.
- Ställ in värmeblocket på 75 °C.
- Ta bort metallklämmorna som håller ihop glasspallsmörgåsen och tvätta noggrant och torka glasplattans smörgås.
- Placera glasplattan smörgås i gelapparaten med den korta plattan vänd inåt.
- Förbered 0,5 x TBE-rinnande buffert genom att kombinera 100 mL 10x TBE med 1,9 L RNase-fritt vatten. Tillsätt 600 mL av löpbufferten till gelapparatens övre och nedre kammare.
- Ta försiktigt bort kammen och skölj brunnarna noggrant med hjälp av en spruta.
OBS: Detta steg är avgörande för att avlägsna urea från brunnarna. - Förkör gelen i 30 min vid 50 W. Spänning är cirka 2 000 V.
VAR FÖRSIKTIG: Denna gelapparat arbetar vid en hög wattal och användare bör uppvisa försiktighetsåtgärd. - Skölj brunnarna noggrant med hjälp av en spruta.
OBS: Detta steg är kritiskt för jämn inläsning av prov i brunnarna. - Puls snurra de släckta reaktionerna från steg 2.2.5. Inkubera sedan rören vid 75 °C i 3 min. Upprepa pulsen spinn.
- Ladda omedelbart 10 μL prov per brunn och kör gelen i 3 h vid 50 W.
OBS: Fluorescently-märkt RNA är ljuskänslig; därför täcka gelapparaten med folie.
- Avbilda denatureringsgelen.
- Stäng av strömförsörjningen och töm den övre kammaren i gelapparaten.
- Tvätta och torka den yttre sidan av glasplattan smörgås med hjälp av tvål och vatten. Täck glasplattan smörgås med folie medan du transporterar gelen.
- Montera glasplattan smörgås på scenen av en laserscanner som kan kvantitativa och känsliga fluorescens upptäckt.
OBS: Denna gel är extremt tunn för maximal upplösning. Av denna anledning är detta protokoll utformat för att undvika svårigheterna att ta bort gelén från glasplattans smörgås genom att direkt visualisera det fluorescerande RNA genom glasplattorna. Användningen av kommersiellt tillgängliga lågfluorescensglasplattor kommer att öka den infångade signalen genom att förbättra signal-brusförhållandet. - Ställ in laserscannerns excitations- och emissionsvåglängder för önskad fluorofor.
OBS: De optimala excitations- och emissionsvåglängderna kan skilja sig åt för specifika fluoroforer. För FAM fluorofore är excitation och utsläpp våglängder 495 nm och 535 nm, respektive. - Definiera vilket område som ska visualiseras på laserscanner-scenen och avbilda gelen enligt tillverkarens anvisningar (Bild 1).
4. Bildanalys och signalkvantifiering
- Ladda den digitala gelbilden som införskaffats i steg 3.4.5 i programvara för bildprosesering (se Table of Materials).
- Med hjälp av musens vänsterknapp klickar du och drar en rektangel för att definiera en mallruta för att markera gränserna på den digitala gelbilden som kommer att användas för att kvantifiera varje RNA-band. RNA-bandet sett i den reaktionsblandning som i avsaknad av PNK enzym är oftast ett bra band för att generera denna mall.
OBS: För att undvika bias orsakad av bakgrundssignal är det kritiskt att området kring varje RNA-band som mäts är identiskt. Av denna anledning är det bäst att använda samma mall rutan för att avgränsa varje RNA-band. - Öppna ROI-hanteraren under "Verktyg" och markera mallrutans position genom att klicka på "Lägg till".
OBS: Quantitation program kan också dra lådor automatiskt efter programvaran bruksanvisningen. - Med hjälp av musens vänsterknapp klickar och drar du över mallrutan till nästa RNA-band och upprepar steg 4.3. Fortsätta denna process tills positionen för alla de ophosphorylerade och fosforylerade RNA-banden i varje reaktion har markerats.
- Mät den integrerade densiteten inom varje ruta genom att klicka på" Mät" i ROI Manager.
- För att beräkna den relativa mängden fosforylerat RNA i en reaktion, dela den integrerade densiteten hos det fosforylerade RNA-bandet med summan av de integrerade tätheterna hos de icke-fosforylerade och fosforylerade RNA-banden från samma reaktion. Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas för att beräkna den relativa mängden unphosphorylerat RNA.
- För att visualisera ackumuleringen av fosforylerad RNA-produkt och motsvarande utarmning av ophosphorylerat RNA-substrat över ATP-koncentrationsserien, ritar den relativa mängden RNA beräknat i steg 4,6 mot koncentrationen av ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En framgångsrik representativ denatureringsgel av en titrering av ATP med en fast mängd Las1-Grc3-komplex visas i figur 1. Tillägg av enzym resulterade i Las1-medierad RNA-klyvning av RNA-substrat sc-ITS2, vilket ledde till ett definierat RNA-fragment (5-OH C2 RNA). Vid tillsats av ATP, var C2 RNA fragmentet fosforyleras av Grc3 PNK (5-P C2 RNA). I denatureringsgeler migrerar det fosforylerade RNA snabbare än dess ophosphoryllated motstycken. Som framgår av figur 2, kunde fosforylering av C2 RNA-fragmentet visualiseras genom att den relativa mängden icke fosforylerat och fosforylerat C2-RNA mot ATP-koncentrationen ritas upp. Grc3 PNK fosforylerade också 5-änden av det oklippta SC-ITS2-substratet, om än i en lägre takt. Detta bekräftar tidigare arbete som tyder Grc3 PNK visar substrat preferens mot dess C2 RNA substrat24. En misslyckad denatureringsgel visas i figur 3. Denna gel misslyckades eftersom 21 nt RNA substrat innehöll nedbrytningsprodukter (Figur 3, första körfält). Dessa nedbrytningsprodukter överlappade med den fosforylerade produkten och gjorde det omöjligt att exakt kvantifiera fosforylering. Däremot kunde den kortaste RNA-nedbrytningsprodukten (Figur 3, grå pilar) framgångsrikt analyseras eftersom detta område av gelen inte innehöll några ytterligare RNA arter som hindrade korrekt kvantifiering av sin fosforylerade motsvarighet. För att undvika RNA-nedbrytningsband, håll arbetsytan och lösningarna RNase-fria, och begränsa antalet RNA-frys-töcykler.
Figur 1: Exempel på denatureringsgelanalys av fosforylerat RNA. In vitro RNA-kinasanalys av Las1-Grc3 (110 nM) inkuberade med 500 nM SC-ITS2 RNA. X markerar kontrollreaktionen utan Las1-Grc3 och den svarta triangeln representerar titreringen av ATP från 0-10 mM. C2 RNA är resultatet av SC-ITS2 RNA klyvning av Las1 nukleas och är det endogena substratet för Grc3 PNK aktivitet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Kvantifiering av RNA fosforylering. Densiometrisk observationstomt av Las1-Grc3 RNA-kinasaktivitet uttryckt som en procentandel av icke-fosforylerat C2-RNA (grå linje; 5-OH C2 RNA) och fosforylerat C2-RNA (brun linje; 5-P C2-RNA) över en ATP-koncentrationsserie. Felstaplar markerar standardavvikelsen från tre oberoende tekniska replikat. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på en misslyckad denatureringsgelanalys av fosforylerat RNA. In vitro RNA-kinasanalys av T4 PNK (0-0,625 U) inkuberas med 5 μm 21 nt RNA. X markerar kontrollreaktionen utan T4 PNK. Denna RNA-kontroll innehåller försämrade RNA-produkter som gör det omöjligt att skilja den 21 nt fosforylerade produkten från nedbrytningsprodukten (svarta pilar). Fosforylering av den kortaste RNA-nedbrytningsprodukten (grå pilar) kan analyseras, eftersom det inte finns några dedradation-produkter som överlappar med sin fosforylerade motsvarighet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Sekvens (5'→3') | Oligo-koden | Källkod | |
| SC-ITS2 | GUCGUUUUAGGUUUUAC CAACUGCGGC/36-FAM/ |
parlamentsledamot 911 | (Pillon et al. NSMB 2019) 26 |
| C2 RNA | GGUUUUAACUG CGGC/36-FAM/ |
Ej ant | Las1 klyvningsprodukt av SC-ITS2 |
| 21-nt | ACGUACGCGGAA UACUUCGAA/36-TAMSp/ |
parlamentsledamot 596 | (Pillon et al. RNA, 2018) 24 |
Tabell 1: Fluorescerande MÄRKTA RNA-substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivs är en analys för att mäta kinas aktivitet av Grc3 PNK på fluorescerande-märkt nukleotid substrat. Detta protokoll kan tillämpas för att karakterisera andra PNK enzymer genom att anpassa Reaction Buffer och oligonukleotid substrat. Till exempel anropar protokollet en spårningsmängd EDTA. Tillsats av EDTA är fördelaktigt av två skäl: För det första gynnar detta tillvägagångssätt magnesium-bundna Grc3 genom att förhindra enzymet från att binda till spårmängder av förorenande metaller i blandningen. För det andra hämmar en liten mängd EDTA aktiviteten att förorena metallberoende ribonukleaser utan att störa aktiviteten hos den tillhörande Las1-metalloberoende ribonukleasen. Koncentrationen av EDTA kan ändras beroende på källan för den specifika PNK. Denna analys ger också en fördel jämfört med traditionella PNK fosforyleringsanalyser som förlitar sig på oligonukleotider märkta med korta halveringstidsradioisotoper (dvs. 2 veckors halveringstid för fosfor-32). Detta protokoll kan anpassas för att mäta specifik enzymaktivitet och Michaelis-Menten kinetik samt bestämma beroendet av fosforylering på olika parametrar, såsom arten av nukleotider, substrat, och metalljoner.
Detta protokoll bygger på att köra stora denaturerande polyakrylamidgeler för att uppnå tillräcklig upplösning för att skilja ett ophosphoryllated substrat från dess fosforylerade produkt. Hälla och hantera dessa geler är kritiska steg i protokollet. Till exempel måste akrylamidlösningen värmas upp för att lösa upp urea och sedan kylas långsamt innan du häller gelen. Kylning denna lösning för snabbt kan leda till bildandet av kristaller. Man måste också se till att undvika att luftbubblor och damm införs medan man häller och ställer in gelen. Imaging gelen utan att ta bort glasplattorna rekommenderas för att undvika att rippa gelen, som är tunn och svår att hantera en gång bort från glasplattorna.
Detta protokoll kan anpassas för att mäta fosforylering av olika storlek oligonukleotid substrat. Denna speciella analys används en 15% akrylamid gel för att uppnå upplösning av fosforylering av 27 nt (SC-ITS2 RNA) och 18 nt (C2 RNA) substrat. Tillägget av en fosfatgrupp till 5-slutet av SC-ITS2 RNA ger en blygsam förskjutning jämfört med den rörlighetsförändring som induceras vid 5-fosforylering av det kortare C2-RNA (Figur 1). Detta belyser en begränsning i RNA-längd när du använder denna teknik. Med längre RNA-substrat minskar bidraget från en fosfatgrupp till den totala molekylvikten för RNA-arten. Av denna anledning kan andelen akrylamid samt gelens körtid optimeras för att uppnå upplösning av olika storlek substrat29. I allmänhet används högre procenttal av akrylamid för mindre oligonukleotidsubstrat medan lägre procenttal av akrylamid (ner till 8 %) ge bättre upplösning av större substrat i oligonukleotid.
Den stora begränsningen av denna analys är att det är lågt genomströmning. Hälla och köra denaturering geler tar en betydande tid, begränsa antalet geler och prover som kan analyseras på en dag. En framtida tillämpning för att övervinna denna begränsning skulle kunna vara utvecklingen av mikrofluidiska chips kunna lösa fosforylerade oligonukleotid produkter. Mikrofluidisk-baserade gelelektrofores har många fördelar jämfört med traditionell gelelektrofores, såsom mindre provstorlek, automatisering, och hastighet. Men nuvarande mikrofluidic chips har inte enda nukleotid upplösning. Sammanfattningsvis ger användningen av denaturering gel elektrofores för att upptäcka förändrad migration av nonradioactive oligonukleotider en användbar teknik för att övervaka de katalytiska kraven och substrat preferens av polynukleotid kinas enzymer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Andrew Sikkema och Andrea Kaminski för deras kritiska läsning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av US National Institute of Health Intramural Research Program; Us-medborgareinstitut av miljö- vård- vetenskaper (NIEHS; ZIA ES103247 till R.E.S) och Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 till M.C.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
References
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
