Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Нерадиоактивный анализ для измерения полинуклеотида фосфорилирования малых нуклеотидных субстратов

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61258
Automatic Translation
1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

Этот протокол описывает нерадиоактивный анализ для измерения киназы активности полинуклеотидных кинасов (PNKs) на малых ДНК и РНК субстратов.

Abstract

Полинуклеотидные киназы (PNKs) являются ферментами, которые катализинцирует фосфорилирование 5' гидроксилового конца ДНК и РНК-олигонуклеотидов. Активность НРК можно количественно оценить с помощью прямых или косвенных подходов. Представлено здесь прямой, in vitro подход к измерению активности PNK, который опирается на флуоресцентно помечены олигонуклеотид субстрат и полиакриламид гель электрофорез. Такой подход обеспечивает разрешение фосфорилированных продуктов, избегая при этом использования радиозабрюхированных субстратов. В протоколе подробно говорится о том, как настроить реакцию фосфорилирования, подготовить и запустить большие полиакриламидные гели, а также количественно определить реакционной продукции. Наиболее технически сложной частью этого анализа является заливка и запуск больших полиакриламидных гелей; таким образом, предоставляются важные детали для преодоления общих трудностей. Этот протокол был оптимизирован для Grc3, PNK, который собирается в обязательный предварительно рибосомный комплекс обработки РНК со своим связующим партнером, ядром Las1. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован для измерения активности других ферментов PNK. Кроме того, этот анализ также может быть изменен для определения воздействия различных компонентов реакции, таких как нуклеозид трифосфат, ионы металла, и олигонуклеотиды.

Introduction

Полинуклеотидные киназы (PNK) играют важную роль во многих путях обработки ДНК и РНК, таких как ремонт ДНК и рибосомнаясборка 1,,2,,3,,4,,5. Эти фундаментальные ферменты катализирует перенос терминального (гамма) монофосфата из нуклеозидного трифосфата (NTP, чаще всего АТФ) в 5' гидроксиловый конец нуклеотидного субстрата. Один из наиболее хорошо характеризуется PNKs является бактериофаг T4 PNK, который имеет широкую специфику субстрата и в значительной степени используется молекулярной биологии лабораторий для включения радиоактивных изотопов этикетки на 5 конечной части ДНК или РНКсубстрата 6,7,8,9,10,11,12. Другим примером фермента PNK является CLP1, который находится в Eukarya, Eubacteria, и Archaea, и замешан в нескольких путейобработки РНК 4,13,14,15.

Исторически сложилось так, что большинство анализов, которые измеряют активность полинуклеотида киназы зависят от радиоактивной маркировки изотопов и последующейауторадиографии 5,16. В последние годы был разработан ряд дополнительных анализов для измерения активности PNK, включая подходы к одной молекуле, электрофорез микрочипа, молекулярные маяки, а также колоритетрические и люминесцентныеанализы 17,,18,,19,,20,,21,,22. Хотя многие из этих новых подходов обеспечивают более расширенные пределы обнаружения и избегают использования радиоактивности, каждый из них имеет недостатки, такие, как стоимость, опора на иммобилизованную смолу и ограничения в выборе субстрата.

Grc3 является полинуклеотидной киназы, которая играет ключевую роль в обработке до рибосомнойРНК 2,3,23. Grc3 образует обязательный комплекс с эндорибонуклеазой Las1, которая расщепляет внутренний транскрибированный Spacer 2 (ITS2) до рибосомнойРНК 3. Расщепление ITS2 по Las1 генерирует продукт укрывательство 5' гидроксил, который впоследствии фосфорилируется Grc3 киназы3. Для исследования нуклеотидной и субстратной специфичности Grc3 требовался недорогой анализ, который позволил провести тестирование различных олигонуклеотидных субстратов. Поэтому был разработан фосфорилирующий анализ PNK с использованием флуоресцентно помеченных субстратов. Этот анализ был успешно использован для определения того, что Grc3 может использовать любой NTP для передачи фосфорила деятельности, но выступает заАТФ 24. Этот протокол адаптирует исходный анализ для измерения активности PNK Grc3 на РНК, имитируя его до рибосомный субстрат РНК (SC-ITS2, таблица 1). Одним из сложных аспектов этого подхода, основанного на флуоресценции, является использование крупных полиакриламидных гелей для эффективного решения фосфорилированных и нефосфорилированных субстратов. Протокол содержит конкретные сведения о том, как залить эти большие гели и избежать распространенных ловушек при этом.

Работа с РНК требует особого ухода, поскольку она сильно подвержена деградации. Есть простые профилактические шаги можно предпринять, чтобы ограничить загрязнение рибонуклеазы. Отдельная рабочая станция РНК, которую можно легко лечить с помощью ингибитора RNase, содержащего моющие средства часто полезно. Всегда носить перчатки при обработке образцов и использование RNase без сертифицированных расходных материалов необходимо. Поскольку вода является еще одним распространенным источником загрязнения, лучше всего использовать свежеочищенную воду и стерилизовать все растворы с помощью фильтра 0,22 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка

  1. Подготовка буфера и реагентов.
    1. Сделайте 1x Реакцию Буфер, объединив 20 йл 1 M Tris (рН 8,0), 40 МКЛ из 5 M хлорида натрия, 2,5 йл 2 M хлорида магния, 100 йл 50% (v/v) глицерол, и RNase-свободной воды для достижения общего объема 1 мл.
    2. Сделайте краситель для загрузки мочевины, объединив 4,8 г мочевины, 200 мкл из 1 М Трис (рН 8,0), 20 МКЛ 0,5 М ЭДТА (рН 8,0), 0,5 мл 1% (w/v) бромофефол синий, и RNase-бесплатной воды, чтобы достичь общего объема 10 мл.
    3. Сделайте 10x буфер TBE, объединив 108 г базы Tris, 55 г борной кислоты, 40 мл 0,5 М EDTA (рН 8,0) и без rNase воды для достижения общего объема 1 л.
    4. Сделать 10% (ж / в) аммония persulfate (APS). Взвесите 0,5 г APS и добавьте 3 мл воды без RNase, чтобы растворить твердое тело. Добавьте воду без RNase, чтобы достичь общего объема 5 мл. Заверните трубку в фольгу и храните раствор при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворенный APS распадается с течением времени. Замените 10% акций APS каждые 2 недели.
  2. Получить фермент полинуклеотидной киназы.
    1. Приобрети чистый фермент Las1-Grc3 PNK2, хранящийся в буфере реакции (см. шаг 1.1.1) в концентрации запасов 20 МКМ. Буфер хранения будет варьироваться в зависимости от конкретного PNK.
  3. Приготовьте субстрат нуклеиновой кислоты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол отслеживает 5'-фосфорилирование 27 nt РНК субстрат, который гавани Las1-Grc3 обработки сайта (C2 сайт), содержащийся в Saccharomyces cerevisiae до рибосомных внутренних транскрибированных спейсер 2 (SC-ITS2; см. Таблицу 1)2,25,26.
    1. Химически синтезировать РНК-олигонуклеотид субстрат, содержащий 5'-гидроксиловый конец вместе с 3'-флуоресцентной этикеткой. Флюорофор будет использоваться для визуализации РНК. Убедитесь, что фторфор расположен на конце РНК, которая не предназначена для фосфорилирования. В качестве альтернативы коммерческим источникам, внутренняя и терминальная флуоресцентная маркировка РНК-субстратов может быть выполнена в доме с использованием экономически эффективныхпротоколов 27.
    2. Удалите избыток фторфора из реакции маркировки РНК HPLC-очисткой28.
    3. Повторное использование лиофилизированной РНК с использованием воды без RNase до 500 нм.
    4. Храните РНК-алициты при -80 градусов по Цельсию для длительного хранения или -20 градусов по Цельсию для кратковременного хранения.
  4. Подготовь серию концентраций АТФ.
    1. Сделайте рабочий запас АТФ на 20 мм с помощью буфера реакции (см. шаг 1.1.1). Используйте этот рабочий запас для создания четырех серийных разбавлений от 20 мМ-0,02 мМ.
    2. Чтобы сделать первое разбавление концентрационной серии, смешайте 1 МКЛ из 20 мМ АТФ рабочего запаса с 9 МКЛ реакционного буфера. Это приведет к 10-кратной разбавлению АТФ с окончательной концентрацией 2 мМ.
    3. Используйте 2 мМТ АТФ, генерируемые в шаге 1.4.2, чтобы сделать следующее разбавление в серии концентрации. Смешайте 1 МКЛ из 2 мМ АТФ с 9 МКЛ буфера реакции. Это позволит сделать новую концентрацию запасов АТФ на 0,2 мМ.
    4. Продолжить разбавление 1 йл предыдущего запаса АТФ с 9 йл реакционного буфера, чтобы сделать последующие запасы АТФ в серии концентрации.

2. Реакция РНК-киназы in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ может быть использован для измерения нескольких переменных, таких как время, уровни нуклеотида, или концентрации ферментов. Целью этого эксперимента является оценка количества фосфорилированной РНК в присутствии постоянного комплекса Las1-Grc3 и различных уровней АТФ.

  1. Для каждой реакции РНК-фермента киназы, объединить 1 л 500 нМ РНК субстрата, 8,3 л 130 нм Las1-Grc3, и 0,2 л 5 мМ EDTA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении нескольких реакций, подготовить мастер запас РНК-фермента смеси и aliquot 9,5 йл этой мастер смеси для каждой реакции трубки.
  2. Начните анализ.
    1. Установите тепловой блок до 37 градусов по Цельсию.
    2. С интервалом в 10 см смешайте 0,5 МКЛ одного подстока АТФ из серии концентраций АТФ, подготовленного в шаге 1.4 с одной смесью РНК-фермента, и поместите реакцию в тепловой блок 37 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 0,5 МКЛ буфера реакции вместо АТФ в одну смесь РНК-фермента для отрицательного контроля PNK. Используйте еще один необходимый контроль (т.е. РНК-субстрат при отсутствии фермента PNK).
    3. Инкубировать реакции в течение 60 мин при 37 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентно помеченная РНК светочувствительность; поэтому накройте реакции фольгой.
    4. Используя тот же порядок, что и в шаге 2.2.2, утолить каждую реакцию каждые 10 с, пики реакции с 10 йл мочевины загрузки красителя (см. шаг 1.1.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к 4 M мочевины, протеиназа K может быть добавлен на этом этапе, чтобы ухудшить фермент. Следуйте инструкциям, предоставленным поставщиком, чтобы определить требуемую сумму protease и условия реакции.
    5. Используйте затухаемые реакции РНК-киназы in vitro немедленно для анализа вниз по течению (см. раздел 3) или храните при -20 градусах по Цельсию для анализа на более поздний срок.

3. Гель электрофорез

  1. Приготовьте 15% акриламида/8 М раствора геля мочевины.
    ВНИМАНИЕ: Акриламид должен быть обработан с осторожностью, потому что это нейротоксин. Всегда носите перчатки, лабораторное пальто и очки при обращении с ним.
    1. В стакане объемом 150 мл смешайте 22,5 мл предварительно смешанного 40% акриламида/бис-акриламида 29:1 раствора, 6 мл 10x TBE (см. шаг 1.1.3), 28,8 г мочевины и воду без RNase общим объемом 59 мл. Аккуратно перемешайте раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от длины РНК субстрата, изменение процента полиакриламинида может улучшить разрешение между нефосфорилированной и фосфорилированной РНК.
    2. Чтобы растворить мочевину, нагрейте раствор в микроволновой печи на 20 с, перемешайте жидкость и немедленно поместите раствор обратно в микроволновую печь еще на 20 с. Аккуратно перемешать раствор, пока мочевина полностью не растворится.
    3. Медленно охладить раствор, поместив стеклянный стакан в ванну на мелководье, содержащую холодную воду. Убедитесь, что уровень холодной воды, окружающей стеклянный стакан выше уровня раствора внутри стакана. Это будет способствовать эффективной передаче тепла. Подождите 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не продолжайте с этим протоколом, если стакан стакан чувствует тепло; вода должна быть ниже 25 градусов по Цельсию. Если он все еще чувствует тепло после 5 минут, а затем заменить воду в водяной бане с пресной холодной водой и ждать еще 5 минут.
    4. Фильтр и дегазации раствора с помощью 0,22 мкм одноразовый блок фильтрации для удаления твердых частиц и микроскопических пузырьков воздуха.
  2. Налейте денатурированный гель.
    1. Используйте мыло и теплую воду для очистки короткой и длинной стеклянной пластины, предназначенной для гелей общими размерами 31,0 см х 38,5 см. Спрей каждой стеклянной пластины с 95% этанола и протрите стекло, чтобы удалить любую влагу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна из двух пластин может быть силиконовой, чтобы предотвратить повреждение геля при разделении стеклянной пластины бутерброд. Однако, этот шаг не является необходимым, потому что этот протокол предназначен для визуализации РНК без разделения стеклянных пластин.
    2. Поместите длинную стеклянную пластину горизонтально поверх коробки, чтобы она была поднята со скамейки.
      ВНИМАНИЕ: Акриламид является токсичным, поэтому гель заливки станции должны быть покрыты скамейке бумаги, которые могут поглощать любые пролитой жидкости и быть немедленно помещены в мешок отходов после завершения процедуры.
    3. Поместите чистый 0,4 мм спейсер вдоль длинных краев длинной стеклянной пластины.
    4. Положите короткую стеклянную пластину на длинной пластине и убедитесь, что края короткой пластины, длинной пластины и прокладчиков выровнены. Зажим каждой стороны с помощью трех равномерно разметь металлические зажимы.
    5. Добавьте 24 МКЛ TEMED к 15% акриламиду/8 М раствору мочевины, подготовленному в шаге 3.1, и смешайте раствор.
    6. Добавьте 600 мл 10% (w/v) APS (см. шаг 1.1.4) к раствору в шаге 3.2.5 и аккуратно смешайте раствор.
    7. Немедленно налейте раствор между стеклянными пластинами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать пузырьков, нажмите на стекло, как раствор налил.
    8. Аккуратно добавьте чистый, 0,4 мм, 32 хорошо расческа в верхней части стеклянной пластины бутерброд.
    9. Разрешить минимум 30 минут для акриламида для полимеризации.
  3. Запустите денатурированный гель.
    1. Установите тепловой блок до 75 градусов по Цельсию.
    2. Удалите металлические зажимы, держа сэндвич стеклянной пластины вместе и тщательно вымыть и высушить бутерброд стеклянной пластины.
    3. Поместите сэндвич со стеклянной пластиной в гелевый аппарат с короткой пластиной, обращенной внутрь.
    4. Подготовь 0,5x TBE работает буфер, сочетая 100 мл 10x TBE с 1,9 л RNase свободной воды. Добавьте 600 мл бегущего буфера в верхнюю и нижнюю камеры гелеобразного аппарата.
    5. Аккуратно снимите гребень и тщательно промойте колодцы с помощью шприца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для удаления мочевины из скважин.
    6. Предварительный запуск геля в течение 30 минут при 50 Вт напряжение составляет около 2000 В.
      ВНИМАНИЕ: Этот гель аппарат работает на высокой мощности и пользователи должны проявлять осторожность.
    7. Промыть скважины тщательно с помощью шприца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение даже для загрузки образца в скважины.
    8. Импульс вращает затухаемые реакции от шага 2.2.5. Затем инкубировать трубки при 75 градусов по Цельсию в течение 3 мин. Повторите вращение пульса.
    9. Немедленно загрузите 10 МКЛ образца на колодец и запустите гель на 3 ч при 50 Вт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентно помеченная РНК светочувствительность; поэтому накройте гелеобразный аппарат фольгой.
  4. Изображение денатурации геля.
    1. Выключите электроснабжение и слейте верхнюю камеру гелеобразного аппарата.
    2. Вымойте и высушите внешнюю сторону сэндвича стеклянной тарелки с помощью мыла и воды. Обложка стеклянной пластины бутерброд с фольгой при транспортировке геля.
    3. Намонтировать сэндвич со стеклянной пластиной на сцену лазерного сканера, способного количественное и чувствительное обнаружение флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот гель очень тонкий для максимального разрешения. По этой причине, этот протокол предназначен, чтобы избежать трудностей удаления геля из стеклянной пластины бутерброд путем непосредственной визуализации флуоресцентно помечены РНК через стеклянные пластины. Использование коммерчески доступных стеклянных пластин с низкой флуоресценцией увеличит захваченный сигнал за счет улучшения соотношения сигнала к шуму.
    4. Установите возбуждение и выброс длин волн лазерного сканера для желаемого флюорофора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное возбуждение и выброс длин волн может отличаться для конкретных флюорофоров. Для ФОМ флюорофора, возбуждение и выброс длин волн 495 нм и 535 нм, соответственно.
    5. Определите область, которая будет визуализирована на этапе лазерного сканера и изображение геля в соответствии с инструкциями производителя(рисунок 1).

4. Анализ изображений и количественная оценка сигнала

  1. Загрузите цифровое изображение геля, приобретенное в шаге 3.4.5, в программное обеспечение для процедирования изображений (см. таблицу материалов).
  2. Используя левую кнопку мыши, нажмите и перетащите прямоугольник, чтобы определить поле шаблона, чтобы отметить границы на цифровом изображении геля, которое будет использоваться для количественной оценки каждой полосы РНК. РНК-диапазон, замеченный в реакционной смеси, настроенной в отсутствие фермента PNK, обычно является хорошей полосой для создания этого шаблона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать смещения, вызванного фоновым сигналом, крайне важно, чтобы область, окружающая каждую измеренную РНК-полосу, была идентичной. По этой причине лучше всего использовать один и тот же шаблонный ящик для демаркации каждой РНК-группы.
  3. Откройте ROI Manager под"Tools"и отметайте положение шаблонной коробки, нажав кнопку"Добавить".
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программы количественной оценки также могут рисовать коробки автоматически, следуя руководству пользователя программного обеспечения.
  4. Используя левую кнопку мыши, нажмите и перетащите поле шаблона к следующей полосе РНК и повторите шаг 4.3. Протеть этот процесс до тех пор, пока положение всех нефосфорилированных и фосфорилированных РНК полос в каждой реакции были отмечены.
  5. Измерьте интегрированную плотность в каждой коробке, нажавкнопку «Мера»в менеджере рентабельности инвестиций.
  6. Чтобы рассчитать относительное количество фосфорилированной РНК в реакции, разделите интегрированную плотность фосфорилированной РНК-диапазона на сумму интегрированной плотности нефосфорилированных и фосфорилированных РНК-полос от той же реакции. Этот подход также может быть применен для расчета относительного количества нефосфорилированной РНК.
  7. Чтобы визуализировать накопление фосфорилированного продукта РНК и соответствующее истощение нефосфорилированного субстрата РНК в серии концентраций АТФ, вычислил относительное количество РНК, рассчитанное в шаге 4.6 против концентрации АТФ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Успешный репрезентативный денатурация геля титрования АТФ с фиксированным количеством комплекса Las1-Grc3 показана на рисунке 1. Добавление фермента привело к расщеплению РНК при посредничестве Las1 в субстрате РНК SC-ITS2, что привело к определенному фрагменту РНК (5-OH C2 RNA). При добавлении АТФ фрагмент РНК С2 был фосфорилирован Grc3 PNK (5-P C2 РНК). При денатурации гелей фосфорилированная РНК мигрирует быстрее, чем ее нефосфорилированный аналог. Как показано на рисунке 2, фосфорилирование фрагмента РНК C2 может быть визуализировано путем построения относительного количества нефосфорилированной и фосфорилированной РНК C2 против концентрации АТФ. Grc3 PNK также фосфорилировал 5-конец необрезанного субстрата SC-ITS2, хотя и с более низкой скоростью. Это подтверждает предыдущую работу предлагая Grc3 PNK показывает предпочтение субстрата к его C2 РНК субстрат24. Неудачный денатурированный гель показан на рисунке 3. Этот гель был неудачным, потому что 21 nt РНК субстрат содержал продукты деградации(рисунок 3, первая полоса). Эти продукты деградации пересекались с фосфорилированным продуктом и не позволяют точно количественно оценить фосфорилирование. В отличие от этого, кратчайший продукт деградации РНК(рисунок 3, серые стрелки) может быть успешно проанализирован, потому что эта область геля не содержит каких-либо дополнительных видов РНК, которые препятствуют точной количественной оценки его фосфорилированного аналога. Чтобы избежать полос деградации РНК, сохраняйте рабочее пространство и решения RNase свободными и ограничивайте количество циклов замораживания-оттепели РНК.

Figure 1
Рисунок 1: Пример анализа денатурированного геля фосфорилированной РНК. Анализ РНК-киназы In vitro Las1-Grc3 (110 нМ), инкубированный 500 нМ РНК SC-ITS2. X отмечает реакцию управления без Las1-Grc3, а черный треугольник представляет собой титровацию АТФ от 0-10 мМ. РНК C2 является результатом расщепления РНК SC-ITS2 ядром Las1 и эндогенным субстратом для активности Grc3 PNK. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Количественная оценка фосфорилирования РНК. Дензиометрический участок активности РНК-киназы Las1-Grc3 выражается в процентном соотношении нефосфорилированной РНК C2 (серая линия; 5-OH C2 RNA) и фосфорилированной РНК C2 (коричневая линия; 5-P C2 RNA) через серию концентраций АТФ. Бары ошибок отмечают стандартное отклонение от трех независимых технических репликаций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Пример неудачного анализа денатурации геля фосфорилированной РНК. Анализ РНК-киназы in vitro T4 PNK (0-0.625 U) инкубируется 5 мкм 21 nt РНК. X отмечает реакцию управления без T4 PNK. Этот контроль РНК содержит только деградированные РНК-продукты, которые делают невозможным отличить фосфорилированный продукт 21 nt от продукта деградации (черные стрелки). Можно проанализировать фосфорилирование самого короткого продукта деградации РНК (серые стрелки), так как нет продуктов дирадации, которые пересекаются с фосфорилированным аналогом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Последовательность (5'→3') Код Олиго Источник
SC-ITS2 ГУКУУУУАГГУУАК
CAACUGCGGC/36-FAM/		 mp 911 (Пиллон и др. NSMB 2019) 26 Лет
C2 РНК ГГУУУАККААКУГ
CGGC/36-FAM/		 N/A Продукт расщепления Las1 компании SC-ITS2
21-нт ACGUACGCGGAA
УАКУУКГАА/36-ТАМСП/		 mp 596 (Pillon et al. RNA, 2018) 24 Года

Таблица 1: Флуоресцентно помеченные РНК-субстраты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный анализ для измерения активности киназы Grc3 PNK на флуоресцентно помеченных нуклеотидных субстратах. Этот протокол может быть применен для характеристики других ферментов PNK путем адаптации реакции буфера и олигонуклеотида субстрата. Например, протокол требует отслеживания количества EDTA. Добавление ЭДТА полезно по двум причинам: во-первых, этот подход благоприятствует магния связаны Grc3, предотвращая фермент от связывания для отслеживания количества загрязняющих металлов в смеси. Во-вторых, небольшое количество ЭДТА подавляет активность загрязняющих металлозависимых рибонуклеаз, не нарушая при этом активность связанной с ним металлонезависимых рибонуклеазы Las1. Концентрация ЭДТА может быть изменена в зависимости от источника конкретного PNK. Этот анализ также обеспечивает преимущество по сравнению с традиционными анализами фосфорилирования PNK, которые полагаются на олигонуклеотиды, помеченные короткими радиоизотопами периода полусейта (т.е. 2 недели полужида для фосфора-32). Этот протокол может быть адаптирован для измерения специфической ферментной активности и кинетики Михаэлиса-Ментена, а также для определения зависимости фосфорилирования по различным параметрам, таким как характер нуклеотидов, субстратов и ионов металла.

Этот протокол опирается на запуск больших денатурированных полиакриламинидных гелей для достижения достаточного разрешения, чтобы отличить нефосфорилированный субстрат от его фосфорилированного продукта. Заливка и обработка этих гелей являются критическими шагами в протоколе. Например, раствор акриламида должен нагреваться, чтобы растворить мочевину, а затем медленно охлаждается перед заливкой геля. Охлаждение этого раствора слишком быстро может привести к образованию кристаллов. Необходимо также позаботиться о том, чтобы избежать введения пузырьков воздуха и пыли при заливке и установке геля. Изображение геля без удаления стеклянных пластин рекомендуется, чтобы избежать копирования гель, который тонкий и трудно справиться после удаления из стеклянных пластин.

Этот протокол может быть адаптирован для измерения фосфорилирования различных размеров олигонуклеотидных субстратов. Данный анализ использовал 15% акриламидный гель для достижения разрешения фосфорилирования 27 nt (SC-ITS2 РНК) и 18 nt (C2 РНК) субстратов. Добавление одной фосфатной группы к 5-концу РНК SC-ITS2 производит скромный сдвиг по сравнению с изменением подвижности, вызванным 5-фосфорилированием более короткой РНК C2(рисунок 1). Это подчеркивает ограничение длины РНК при использовании этого метода. При более длинных субстратах РНК вклад фосфатной группы в общий молекулярный вес видов РНК уменьшается. По этой причине, процент акриламида, а также гель время работы могут быть оптимизированы для достижения разрешения различных размеров субстратов29. В целом, более высокие проценты акриламида используются для небольших олигонуклеотидных субстратов, в то время как более низкий процент акриламида (до 8%) обеспечить лучшее разрешение больших олигонуклеотидных субстратов.

Основным ограничением этого анализа является то, что он имеет низкую пропускную способность. Заливка и бег денатурации гелей занимает значительное количество времени, ограничивая количество гелей и образцов, которые могут быть проанализированы в день. Будущим приложением для преодоления этого ограничения может быть разработка микрофлюидных чипов, способных решать фосфорилированные продукты олигонуклеотида. Микрофлюидный гель-электрофорез имеет много преимуществ по сравнению с традиционным электрофорезом геля, таким как меньший размер выборки, автоматизация и скорость. Однако текущие микрофлюидные чипы не имеют единого нуклеотидного разрешения. В заключение, использование денатурации гель электрофорез для обнаружения измененной миграции нерадиоактивных олигонуклеотидов обеспечивает полезную технику для мониторинга каталитических требований и субстрата предпочтение полинуклеотидных ферментов киназы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим д-ра Эндрю Сиккему и Андреа Каминский за их критическое прочтение этой рукописи. Эта работа была поддержана Программой интрамуральных исследований Национального института здравоохранения США; Национальный институт наук об охране окружающей среды США (NIEHS; ЗИЯ ES103247 в Р.Е.С.) и Канадские институты исследований в области здравоохранения (CIHR; 146626 до M.C.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mm 34-well comb BioRad 1653848
0.4 mm spacer BioRad 1653812
0.5 M EDTA ph 8.0 KD Medical RGF-3130
1M Magnesium Chloride KD Medical CAC-5290
1M Tris pH 8.0 KD Medical RGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 BioRad 1610146
5M Sodium Chloride KD Medical RGF-3720
ammonium persulfate (APS) BioRad 161-0700
ATP Sigma A2383-1G
boric acid Sigma B0394
bromophenol blue sodium salt Sigma B5525-5G
Glass Plates Thomas Scientific 1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer Hoefer N/A
Image J Software N/A N/A https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides IDT Custom Order
Pharmacia EPS 3500 Power Supply Pharmacia N/A
Steriflip 0. 22 um Filter Millipore 5FCP00525
TEMED BioRad 161-0800
tris base Sigma TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager GE Healthcare N/A
Ultra Pure DEPC Water Invitrogen 750023
Ultra Pure Glycerol Invitrogen 19E1056865
urea Fisher Chemical U15-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
  2. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
  3. Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
  4. Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
  5. Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
  6. Rio, D. C. 5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
  7. Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
  8. Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
  9. Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
  10. Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
  11. Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
  12. Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
  13. Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
  14. Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
  15. Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
  16. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  17. Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
  18. Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
  19. Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
  20. Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
  21. Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
  22. Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
  23. Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
  24. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
  25. Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
  26. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
  27. Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
  28. Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
  29. Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).

Tags

Биохимия выпуск 159 полинуклеотидная киназа полиакриламидный гель реакция передачи фосфорила фосфорилирование РНК Grc3 нерадиоактивный анализ
Нерадиоактивный анализ для измерения полинуклеотида фосфорилирования малых нуклеотидных субстратов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pillon, M. C., Stanley, R. E.… More

Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (159), e61258, doi:10.3791/61258 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter