המסך הגנטי הקדמי באמצעות כתבת סידן טרנסגניים Aequorin כדי לזהות יעדים הרומן איתות סידן
Summary
המסך הגנטי הקדמי מבוסס על Ca2 + העלאת כקריאה החוצה מוביל זיהוי של רכיבים גנטיים מעורבים התלויים סידן מסלולים איתות בצמחים.
Abstract
מסכים גנטיים הקדמי היו כלים חשובים בזיהוי משוחדת של רכיבים גנטיים המעורבים מסלולים ביולוגיים מספר. הבסיס של המסך הוא ליצור אוכלוסיית מוטציה שניתן להקרין באמצעות פנוטיפ של עניין. EMS (אתיל מתאן סולולאט) הוא סוכן al, המשמש בדרך כלל לגרימת מוטציה אקראית במסך הקלאסי קדימה גנטי כדי לזהות גנים מרובים המעורבים בכל תהליך נתון. סידן ציטוסולג (Ca2 +) העלאת הוא מפתח מוקדם איתות במסלול המופעל על תפיסת המתח. עם זאת, הזהות של קולטני, ערוצים, משאבות ומובילים של Ca2 + הוא עדיין חמקמק במערכות לימוד רבות. Aequorin הוא חלבון כתבת הסידן התאי מבודד מ aequorin ויקטוריה ובאופן מאוד מבוטא באריידאופזיס. אנו מנצלים את המצב הגנטי הקדמי. בו אנו מוטגנים את הטרנסאוגניים הזרעים של צמחי מוטציה נאספו (M1) והקרנה עבור הפנוטיפ של עניין נעשה בפנקסי (m2) אוכלוסיה. באמצעות פרוטוקול Ca2 + מדידה של 96-היטב, מוטציות הרומן מספר ניתן לזהות כי יש תגובת סידן משתנה והם נמדדים בזמן אמת. המוטציות עם הפנוטיפ של עניין חולצו והופץ עד homozygous מוטציה האוכלוסייה הצמח מתקבל. פרוטוקול זה מספק שיטה עבור מסכים גנטיים מתקדמים ברקע של Ca2 + עיתונאי ולזהות הרומן ca2 + מוסדר מטרות.
Introduction
שינוי בסידן ציטוסולג (Ca2 +) הריכוז על תפיסת של גירוי ביוטי או אביוטיים הוא אירוע מוקדם ללמוד איתות המפעיל הרבה1מסלולים איתות 1,2,3,4. תא במצב מנוחה בסיס שלו שומר על הנמוך ca2 + ריכוז ב ציטוזול ו-העודפים ca2 + ב אורגאואותאים שונים מוליך המוביל האחרון של ca תלולה2 + הדרגתי5,6. עם תפיסת האות, Ca2 + רמות עלייה ציטוסול בשל זרם של ca2 + מתוך החילוץ ו/או מקורות תאיים וליצור גירוי מסוים סידן חתימה7,8,9. Ca2 + הגבהים ב ציטוסול מופעלים על ידי גירויים רבים, אבל הייחוד מתוחזק על ידי חנויות נפרדות שחרור Ca2 +, Ca ייחודי2 + חתימה המתאים חלבונים חיישן10,11.
השימוש בסוכן אלקיטינג, אתיל-מתאן סולולאט (EMS) עבור מוטאוסיס הוא כלי רב עוצמה במסכים הגנטיים הקלאסיים הקדמיים כדי לזהות גנים עצמאיים מרובים המעורבים בתהליך. EMS הוא מוטגנים כימיים בעיקר גרימת C ל T ו-G כדי מעברים באופן אקראי ברחבי הגנום ומייצרת 1 שינוי bp ב כל 125 kb של הגנום. EMS מוטארסיס יהיה לגרום ≈ 1000 משני זוגות בסיס יחיד שינויים, ההכנסה/מחיקות (InDel) או בודד פולימורפיזם (SNP) לכל גנום12. מוטציות בהשפעת EMS הן מוטציות בנקודות מרובות עם תדר מוטציה הנע בין 1/300 ל 1/30000 לוקוס. זה מפחית את מספר M1 צמחים הדרושים כדי למצוא מוטציה בגן נתון. טווח של אוכלוסיית M1 הזרע של 2000-3000 משמש בדרך כלל כדי להשיג מוטציות של עניין ב arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin transgenics הם Arabidopsis קולומביה-0 (Col-0) צמחים אקולוגיים המבטא p35S-apoaequorin (pMAQ2) ב ציטוסול15. Aequorin הוא חלבון Ca2 + מאגד המורכב האפופרוטאין וקבוצה תותבת המורכבת של מולקולה לוציב, קומרכאזין. הכריכה של Ca2 + כדי aequorin, אשר יש שלוש Ca2 + מאגד הידיים האתרים, התוצאות בתוך מחזוריות החיידקים והמחזוריות כדי לתת את dioxetanone ביניים, ואחריו שינוי מאוד של החלבון מלווה על ידי שחרורו של פחמן דו חמצני ו זינגתן-נרגש קוקונב16. Coelenteramide כל כך המיוצר פולט אור כחול (λmax, 470 nm) כי ניתן לזהות על ידי לומימטר17. מהיר ביותר Ca2 הגבהים יכולים ובכך להיות נמדד בזמן אמת, ומנוצלת מהירה קדימה מסכי גנטיות. פרוטוקול זה נועד להשתמש בספציפיות של תגובת הסידן כדי לזהות נגני מפתח חדשניים המעורבים בחתימת Ca2 + . כדי להשיג משימה זו, אנו משתמשים במוטזיס EMS בתוך הטרנסגניים aequorin ומזהים את ה-SNPs המשויך ל-Ca2 + איתות שהשתנה. הפרוטוקול מזהה מוטציות שאינן מראות או מופחת Ca2 + הגבהים על תוספת הגירוי. לאחר מכן ניתן למפות מוטציות אלה כדי לזהות את הגנים האחראים על Ca2 + תגובה. השיטה ישימה לכל סוג של גירוי נוזלי בצמחים שתוצאתו Ca2 + העלאה. מאז Ca2 + העלאה היא אחת התגובות הראשונות במסלול ההגנה הצמח איתות, זיהוי של רכיבי תגובה במעלה הזרם יכול לספק מועמדים הנדסה גנטית לפתח צמחים גמישים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מוטגנזה EMS היא כלי רב עוצמה להפקת מוטציות באוכלוסיה. המסכים הקלאסי קדימה הגנטי באמצעות EMS כבר כלי יעיל כדי לזהות גנים הרומן שתי סיבות עיקריות: ראשית, הם לא דורשים כל הנחות מראש על זהות גנטית ושנית, הם לא מציגים כל הטיה. ישנן מספר שיטות ליצירת אוכלוסיות הקרנה כמו EMS, T-DNA הוספות, רדיוציות וכו ‘. מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאומי המכון לחקר הגנום צמח-פיטוטרון מתקן לצמיחת הצמח, בומביי באזור עבור לירות וידאו, ואת המחלקה לביוטכנולוגיה-eLibrary Consortium עבור מתן גישה משאבי e. עבודה זו היתה נתמכת על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, הודו באמצעות המכון הלאומי למחקר הגנום צמח מענק הליבה, מקס פלאנק Ge, הודו הקבוצה השותפים התוכנית; ו-CSIR-זוטר מלגת מחקר (ל-D. M ו-S. M) והמחלקה למלגות ביוטכנולוגיה-זוטר (ל-R. P).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M., Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. , 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G., Running, M. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G., Rosato, E. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G., Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J., Flanders, D., Dean, C. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). , 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
