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Biology

Antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61259

Summary

Una pantalla genética hacia adelante basada en la elevación de Ca2+ como lectura conduce a la identificación de los componentes genéticos involucrados en las vías de señalización dependientes del calcio en las plantas.

Abstract

Las pruebas genéticas directas han sido herramientas importantes en la identificación imparcial de los componentes genéticos implicados en varias vías biológicas. La base de la pantalla es generar una población mutante que se puede examinar con un fenotipo de interés. El SME (sulfonato de metano etílico) es un agente alquilante comúnmente utilizado para inducir mutaciones aleatorias en una pantalla genética avanzada clásica para identificar múltiples genes implicados en cualquier proceso dado. La elevación del calcio citosólico (Ca2+)es una vía clave de señalización temprana que se activa tras la percepción del estrés. Sin embargo, la identidad de los receptores, canales, bombas y transportadores de Ca2+ sigue siendo esquiva en muchos sistemas de estudio. Aequorin es una proteína de reportero de calcio celular aislada de Aequorea victoria y expresada stably en Arabidopsis. Aprovechando esto, diseñamos una pantalla genética hacia adelante en la que el SME mutaba la aequorin transgénica. Las semillas de las plantas mutantes fueron recolectadas (M1) y la detección del fenotipo de interés se llevó a cabo en la población segregadora (M2). Usando un protocolo de medición Ca2+ de alto rendimiento de 96 pozos, se pueden identificar varios mutantes novedosos que tienen una respuesta de calcio variable y se miden en tiempo real. Los mutantes con el fenotipo de interés son rescatados y propagados hasta obtener una población de plantas mutantes homocigotas. Este protocolo proporciona un método para las pantallas genéticas directas en los antecedentes de los reporteros de Ca2+ e identificar nuevos objetivos regulados de Ca2+.

Introduction

Un cambio en la concentración de calcio citosólico (Ca2+)tras la percepción del estímulo biótico o abiótico es un evento de señalización temprana bien estudiado que activa muchas vías de señalización1,2,3,4. Una célula en su estado de reposo basal mantiene una menor concentración de Ca2+ en el citosol y secuestra el exceso de Ca2+ en varios orgánulos intracelulares y apoplasto extracelular que conduce a un pendiente de Ca2+ 5,,6. Tras la percepción de la señal, los niveles de Ca2+ aumentan en el citosol debido a una afluencia de Ca2+ de fuentes extracelulares y/o intracelulares y generan una firma de calcio específicade estímulos 7,8,9. Las elevaciones de Ca2+ en el citosol se activan por muchos estímulos, pero la especificidad se mantiene por diferentes almacenes liberando Ca2 +,una firma única de Ca2+ y proteínas de sensor apropiadas10,,11.

El uso de agente alquilante, sulfonato de etílico-metano (EMS) para la mutagénesis es una poderosa herramienta en las pantallas genéticas directas clásicas para identificar múltiples genes independientes implicados en un proceso. EMS es un mutágeno químico que induce predominantemente transiciones de C a T y G a A aleatoriamente en todo el genoma y produce un cambio de 1 bp en cada 125 kb del genoma. La mutagénesis de EMS inducirá cambios de par base única de 1000 euros, ya sea de inserción/eliminación (InDel) o polimorfismo de nucleótido único (SNP) por genoma12. Las mutaciones inducidas por EMS son múltiples mutaciones puntuales con una frecuencia de mutación que oscila entre 1/300 y 1/30000 por locus. Esto reduce el número de plantas M1 necesarias para encontrar una mutación en un gen dado. Un rango de población de semillas M1 de 2000-3000 se utiliza típicamente para obtener mutaciones de interés en Arabidopsis thaliana13,14.

Las transgénicas de aequorin son las plantas ecotipos de Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) que expresan p35S-apoaequorin (pMAQ2) en el citosol15. La aequrina es una proteína de unión a Ca2+ compuesta de apoproteína y un grupo protésico formado por molécula de luciferina, coelenterazina. La unión de Ca2+ a aequorin, que tiene tres sitios DE-manos de unión Ca2+, da como resultado oxidado y ciclado de coelenterazina para dar el dioxetanono intermedio, seguido de un cambio conformacional de la proteína acompañado de la liberación de dióxido de carbono y coelenteramida singlete-excited16. La coelenteramida así producida emite unamaxluz azul (máx., 470 nm) que puede ser detectada por el luminómetro17. Por lo tanto, las elevaciones extremadamente rápidas de Ca2+ se pueden medir en tiempo real y explotarse para detectar pantallas genéticas de avance rápido. Este protocolo tiene como objetivo utilizar la especificidad de la respuesta al calcio para identificar a los nuevos actores clave que participan en la firma Ca2+. Para lograr esta tarea, utilizamos la mutagénesis ems en la aequorin transgénica e identificamos los SNP asociados con la señalización alterada de Ca2+. El protocolo identifica mutantes que no muestran elevaciones de Ca2+ o reducidas tras la adición de estímulos. Estos mutantes pueden ser mapeados para identificar los genes responsables de la respuesta de Ca2+. El método es aplicable a cualquier tipo de estímulo líquido en las plantas que resulta en una elevación de Ca2+. Dado que la elevación de Ca2+ es una de las primeras respuestas en la vía de señalización de defensa vegetal, la identificación de los componentes de respuesta aguas arriba puede proporcionar candidatos para la ingeniería genética para desarrollar plantas resistentes.

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Protocol

1. Mutagénesis de EMS y colección de semillas única basadas en pedigrí (1-3 meses)

  1. Pesar 150 mg de semillas (7500) de aequorin para EMS mutagénesis (semillas M0). Pesar otros 150 mg de semillas para ser utilizadas como control.
  2. Transfiera las semillas a un tubo de 50 ml y añada 25 ml de 0,2% emS (v/v) (CAUTION) (para tratamiento) o 25 ml de agua autoclavada (para control).
    NOTA: El sulfonato de etil-metano es un agente químico para mutagenizar el material vegetal.
  3. Selle el tubo con parafilm y envuélvalo en papel de aluminio. Gire el extremo final del tubo durante 18 h a temperatura ambiente.
  4. Deje que las semillas se asienten. Retire la solución EMS cuidadosamente y deseche en un contenedor de residuos que contenga 1 M de NaOH en volúmenes iguales (NaOH ayuda a neutralizar/inactivar emS, lo que hace que sea seguro desechar). Deseche el material plástico usado en una solución NaOH de 1 M.
    NOTA: Después de 24 h, deseche los descartes de acuerdo con las prácticas de laboratorio de materiales peligrosos.
  5. Lavar bien las semillas mutagenizadas con 40 ml de agua autoclaveda al menos 8 veces. Deseche el SME que contenga agua en un contenedor de residuos NaOH como se mencionó anteriormente.
  6. Para el lavado final, añadir 40 ml de tiosulfato sódico de 100 mM y enjuagar 3 veces para eliminar los restos de EMS.
  7. Remoje las semillas en 40 ml de agua autoclavada durante 1 h para difundir EMS de las semillas y luego colóquelas en papel de filtro hasta que estén completamente secas.
  8. Transfiera las semillas a un tubo de microcentrífuga y estratifique las semillas a 4 oC en 40 ml de agua autoclavada durante 2-4 días. Esto ayuda a romper la latencia de las semillas y asegura un crecimiento homogéneo.
  9. Transfiera tanto las semillas mutagenizadas (M0) como las semillas de control al suelo (composición del suelo: agropetta: soilrite, 1:1) y transfieralas a salas de crecimiento con un fotoperiodo oscuro de 16 horas de luz/8 h, una intensidad de luz de 150émol-m-m-2y 70% de humedad relativa.
  10. Para determinar si la mutagénesis tuvo éxito, busque una velocidad de germinación reducida y crecimiento de plántulas, y la sectorización de la clorofila18 (Figura 1A). Compare las plantas mutagenizadas con las plantas de control para identificar estas diferencias fisiológicas y de desarrollo.
    NOTA: Se pueden utilizar diferentes métodos para la cosecha de semillas de plantas M1. En este protocolo, hemos utilizado el método de colección de semillas basado en pedigrí único. Cada planta M1 recibe un número único, comenzando desde A1 hasta A3500.
  11. Actualice plantas numeradas individualmente como líneas de planta discretas (Figura 1B).
  12. Tras la maduración, cosecha las semillas de estas plantas mutantes individuales y guárdalas como líneas M1 individuales(Figura 2). De la colección de semillas basada en pedigrí único, obtuvimos alrededor de 5000 M1 líneas de las cuales se proyectaron 3500 M1 líneas.

2. Examen de alto rendimiento para seleccionar mutantes (8 meses)

  1. Identifica mutantes novedosos basados en la respuesta de Ca2+ a un estímulo seleccionado. Aquí, usamos H2O2 como ejemplo.
  2. Para identificar mutantes, examina la generación M2. Dado que los mutantes recesivos se segregan a una frecuencia de 1/8 en la generación M2 tras la mutagénesis de EMS14, el cribado de 8-12 M2-plantas segregantes cubre una línea M1 e identifica un mutante recesivo homocigoto (usando 12 plántulas aumenta la probabilidad de encontrar un mutante). Desde cada línea M1 independiente, pruebe 12 M2 plántulas para la respuesta Ca2+ a H2O2 (12 M2 plántulas por línea M1).
  3. Utilice un protocolo de crecimiento de semillas hidropónicas de alto rendimiento y de crecimiento de plantas hidropónicas19. Colocar casi 12-15 M2 semillas por línea M1 en pozos individuales de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos y esterilizar utilizando gas cloro (40 ml de 12% hipoclorito de sodio y ácido clorhídrico, 3:1, v/v) en un desecador durante 4 h en una campana de humo. Después del procedimiento, abra el desecador y deje durante la noche para que el gas cloro se evapore.
  4. Después de la esterilización, lleve las placas al exterior y agregue medios líquidos de 1/2 MS (MS de media resistencia sin agar) a pozos individuales. Sellar las placas con parafilm y estratificar las semillas durante 2-4 días a 4oC y luego mover las semillas a una cámara de crecimiento con 10 h de luz / 14 h de fotoperiodo oscuro a 20-22 oC con 70% de humedad relativa.
  5. Una vez que las plántulas tienen 8-12 días de edad, coloque 12 M2 plántulas de cada línea individualmente en una placa luminómetro de 96 pozos. Para medir la respuesta Ca2+ a H2O2,utilice un lector de placas luminómetros.
  6. Después de la transferencia de plántulas, añadir 150 l de solución de coelentrazina de 5-10 m (diluida en agua autoclavizada a partir de un stock de 5 mM en metanol) (PRECAUC) en pozos individuales en un área oscura/baja luz y almacenar en la oscuridad a 21 oC durante 8 h.
    NOTA: Coelentrazina es un grupo protésico que se une a la apo-aequina y la reconstituye a la aequrina funcional. Coelentrazina es sensible a la luz y por lo tanto se almacena en botellas de color oscuro, protegido de la luz.
  7. Al día siguiente, realice la pantalla mutante usando 10 mM H2O2 como estímulo y mida la respuesta posterior de Ca2+.
  8. Para la medición simultánea de 24 pozos, cree un programa cinético automatizado que mida el fondo durante 1 min, seguido de la adición de estímulos (40 l) y la medición durante 10 min, seguido de la descarga total de aequorin (2 M CaCl2 en 150 l 20% etanol) durante 1-2 min.
    NOTA: Se necesita una descarga final para la aequorin total para cuantificar la Ca2+ medida y como control adicional para la aequrón funcional. La descarga final es una carrera corta de 1-2 min y no causa la muerte significativa de la planta. Alternativamente, si las plantas mueren después del paso de descarga, vuelva a examinar la línea M1 específica y rescate sin descarga. Estos mutantes se pueden confirmar en las generaciones M3 y M4 utilizando el paso de descarga.
  9. Utilice un método de escaneo de formato de 24 pozos que mida cada fila en un intervalo de 7 s con un tiempo de integración de 300 ms por pozo por punto de medición. Utilice una plántula de tipo salvaje como control en cada fila para la comparación y evaluación del mutante.
    NOTA: Una sola placa de 96 pozos que contiene plántulas M2 cubrirá 8 líneas M1 individuales (8 M1*12o 96 M2)y se puede proyectar en 2,5 h y cada día se proyectarán 32 líneas M1, 640 M1 plantas al mes. Todo el procedimiento de cribado después de que las plantas estén listas tomaría alrededor de 8 meses.
  10. Identificar mutantes en función de la pérdida o reducción de la respuesta de Ca2+ con H2O2. Rescata a los mutantes seleccionados a través de un proceso de lavado basado en antibióticos. Lavar la plántula con 25 mg/L de solución de cefotaxime dos veces y luego transferir a un medio de rescate que contenga 25 mg/L de cefotaxime en 1/2 MS de agar.
  11. Cultivar las placas a una luz de 10 h / 14 h fotoperiodo oscuro para obtener una planta mutante. El lavado de cefotaximo ayuda a eliminar cualquier microorganismo dañino en la plántula. Dado que las plántulas después de la reconstitución se mantienen sin sellar, minimice la contaminación al transferir de nuevo a una condición estéril.
  12. Transfiera la planta mutante al suelo para obtener la población homocigota M3.

3. Análisis de datos e identificación mutante (1-3 meses)

NOTA: Las lecturas proporcionadas del método anterior se encuentran en unidades de luz relativa (RLU).

  1. Para calcular la concentración de [Ca2+]cyt, utilice la siguiente ecuación de concentración20.
    pCa a 0.332588(-log (L/Lmax)) + 5.5593
    Recuentos de luminiscencia () y recuentos restantes totales (máx.).
  2. Convierta los valores de pCa obtenidos en valoresde citt [Ca2+]en M multiplicando por 106. A continuación, trazar gráficamente contra un control de aequorin (Col-0 transgénico) para identificar mutantes putativos H2O2 a la respuesta ca2+.
  3. Las plántulas de rescate muestran una pérdida o una respuesta reducida a la aplicación H2O2 rescatada.
  4. Tras la maduración, cosecha semillas del mutante rescatado y vuelve a examinar para responder a H2O2 en plántulas M3. Si todas las plántulas de 12 M3 muestran una respuesta de Ca2+ similar a la planta madre, considere que la población es una población mutante homocigota M3. Si las 12 plántulas no muestran tal respuesta, entonces llévenlas a la generación M4 y vuelvan a examinar para obtener población homocigota.
  5. Una vez que se ha obtenido una línea vegetal homocigota, identifique el gen que conduce al fenotipo alterado utilizando la secuenciación de próxima generación.

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Representative Results

La población de EMS se hizo un anzado paralaelevación de Ca 2+ inducida por H 2 O2. 2+ Como se discutió anteriormente, 12 plántulas M2 individuales fueron examinadas desde cada línea M1. En la Figura 3,una de esas líneas M1 se traza con cada panel mostrando 12 plántulas M2 individuales. Una aequorin de tipo salvaje se utiliza como control para comparar y evaluar la respuesta mutante. Un mutante recesivo se separa en la proporción de 1:7 (mutante: no mutante). Al examinar 12 plántulas individuales por línea M1, podemos identificar 1 o 2 mutantes por línea. Hemos identificado 2 mutantes putativos de 12 M2 plántulas (Figura 3). Estos mutantes se llevan a M3 y M4 y se genera una población homocigota. El mutante homocigoto se mapea para identificar el gen causal.

Figure 1
Figura 1: Arabidopsis mutagenizada por el SME. (A) Para determinar una mutagénesis exitosa del SME, buscamos la sectoración de la clorofila en la población de plantas mutagenizadas (indicada por flecha). Estadísticamente, entre el 0,1 y el 1% de las plantas M1 deben mostrar sectores cloroticos. (B) Se realizó una maceta individual de plantas M1 para realizar una única colección de semillas a base de pedigrí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representación esquemática de la metodología de la pantalla genética directa. 7500 plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan citosolina citosólica (Aeq) en Col-0 se mutan con metanesulfonato etílico (EMS) en la generación M0. Alrededor de 5000 plántulas de generación M1 se propagan individualmente por un solo método pedigrí y se propagan a la generación M2. 12 plantas de cada línea M2 se examinan para el fenotipo de interés (alrededor de 3000-3500 M1 líneas). Mutante para el fenotipo de interés es rescatado y propagado a la generación M3 y examinado para la homocigosidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Identificación de mutantes con respuesta alterada altratamiento con H2O2. Se muestra una figura representativa para representar la selección mutante de una sola línea M1 segregadora. Los paneles muestran el resultado del cribado (12 plántulas M2 segregantes por línea M1 individual) tras la estimulación con 10 mM H2O2. El control WT (Aequorin) (línea verde), el promedio de todas las plántulasde 12 M 2 es la respuesta media (línea roja) y A1-X (línea negra) son plántulas individuales numeradas de 1 a 12. Para cada gráfico, el eje Y es el [Ca2+]cyt (-M) y el eje X es el tiempo (min). [Ca2+] los niveles de cit se calcularon a partir de unidades de luz relativa (RPU). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La mutagénesis del SME es una poderosa herramienta para generar mutaciones en la población. Las pantallas genéticas delanteras clásicas que utilizan EMS han sido una herramienta eficaz para identificar genes nuevos por dos razones principales: en primer lugar, no requieren ninguna suposición previa sobre la identidad génica y, en segundo lugar, no introducen ningún sesgo. Existen varios métodos para generar poblaciones de cribado como EMS, inserciones de ADN-T, radiaciones, etc. De todos los métodos, la mutagénesis basada en EMS tiene pocas ventajas sobre los otros métodos. En primer lugar, es más fácil generar una población mutante por exposición a EMS como se describe en el protocolo actual21,22. En segundo lugar, se puede generar un número suficientemente grande de población de semillas mutantes, que se puede utilizar para varias pantallas para uno o más estímulos. En tercer lugar, se puede identificar un alelo débil de un gen esencial generado debido a una mutación de mala conducta. En cuarto lugar, se puede identificar una serie de efectos de la función génica utilizando la pantalla del SME, incluida la pérdida completa de la función, la pérdida parcial de la función, la función alterada y una función génica constitutiva. Puede ayudar en la identificación de mutantes dobles que no es factible por otros métodos de mutagénesis23,24,25. La colección de semillas M1 basada en pedigrí único utilizada en este protocolo también es ventajosa, ya que permite volver a la población madre para identificar al mismo mutante de nuevo, si la progenie se pierde en las generaciones futuras siguientes. Ofrece la posibilidad de recuperar mutaciones que son infértiles cuando son homocigotas y se pueden recuperar a través de los hermanos heterocigotos de las plantas mutantes. En segundo lugar, esta estrategia garantiza la independencia de todos los mutantes aislados en comparación con el volumen de semillas en la generación M1. Asegura que las mutaciones aisladas de la colección M2 sean diferentes alelos en el mismo locus en lugar del mismo evento mutacional26.

Los genes identificados a través de las pantallas de mutagénesis del SME dependen del fenotipo utilizado para la detección de la población. Cuanto más rápido se pueda examinar el fenotipo de interés, más fácil será identificar nuevas vías. Ca2+ es un mensajero secundario ubicuo que se encuentra entre las primeras cascadas de señalización que se activan. Actúa como mediador para la respuesta de la planta contra una amplia gama de estímulos bióticos y abióticos. Además, la aequorin reportera de calcio se puede localizar en varios compartimentos subcelulares y orgánulos27,28,29. Esto abre vías para identificar funciones de proteína localizadas en estos compartimentos en la dinámica de respuesta de calcio30,31,32.

Las pantallas genéticas directas basadas en EMS-mutagénesis en la aequorin y el uso de Ca2+ como lecturas han permanecido contemporáneos desde su descubrimiento. Las ventajas de este método han superado los escollos. Sin embargo, pocas limitaciones de la técnica todavía necesitan ser cuidadosamente evaluadas. La pantalla es de trabajo e intensiva en tiempo y requiere la identificación de plantas mutantes de una vasta población mutagenizada. Por lo tanto, la planificación detallada basada en la disponibilidad de recursos, los requisitos de personal de trabajo y las restricciones de espacio deben realizarse antes de embarcarse en el plan experimental. El segundo gran desafío con las pantallas Ca2+ basadas en aequorin es la posibilidad de falsos positivos sin un paso de descarga. Por lo tanto, se incluye un paso de descarga muy corto en el protocolo. Las mutaciones aleatorias también pueden conducir a la generación de plantas estériles que no pueden ser rescatadas debido a múltiples mutaciones. En tercer lugar, la firma ca2+ es altamente específica de los tejidos y la consistencia en el cribado debe garantizarse4.

No muchas pantallas genéticas directas han identificado receptores, canales, bombas y transportadores de Ca2+ como el uso de Ca2+ como un fenotipo de cribado en la genética hacia adelante era raro. Los estímulos (por ejemplo, H2O2) inducidos por la elevación ca2+ se utilizan como marcador para una pantalla genética hacia adelante en nuestra metodología, para identificar nuevos componentes genéticos involucrados en el proceso. Una estrategia similar utilizando la población de aequorin mutada EMS ha llevado al descubrimiento de muchos receptores como DORN1 que es el receptor eATP33,canal de calcio OSCA34, receptor LORE implicado en la detección de lipopolisacáridos35 y la ribonucleasa PARN136. Un estudio reciente publicado por Wu et al. ha utilizado una metodología muy similar de cribado de plantas de aequorin mutadas por EMS en H2O2 para identificar el novedoso sensor de peróxido de hidrógeno HPCA137. Por lo tanto, el protocolo que utiliza la mutagénesis de EMS en los antecedentes de los reporteros de Ca2+ es un método prometedor para el descubrimiento de nuevos genes implicado en la detección de estímulos.

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Disclosures

Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Agradecemos al Instituto Nacional de Investigación del Genoma Vegetal - Phytotron Facility por el crecimiento de las plantas, Bombay Locale por la sesión de vídeo y el Departamento de Biotecnología- Consorcio eLibrary por proporcionar acceso a los recursos electrónicos. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Biotecnología de la India a través del National Institute of Plant Genome Research Core Grant, programa Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; y la Beca de Investigación CSIR-Junior (a D.M y S.M) y al Departamento de Biotecnología-Beca de Investigación Junior (a R.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well tissue culture plate Jetbiofil 11024 for growing seedlings
96 well white cliniplate Thermo Scientific 9502887 for luminometer measurements
Aequorin
Agropet Lab Chem India for plant growth
Calcium chloride Fisher Scientific 12135 for discharge solution
Coelenterazine PJK 55779-48-1 prosthetic group for aequorin
Ehtylmethane sulfonate Sigma Aldrich M0880-5G for seed mutagenesis
Ethanol Analytical reagent 1170 for discharge solution
Hydrochloric acid Merck Life Sciences 1.93001.0521 sterlization solution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific 15465 as stimulus for Calcium elevation
Luminoskan ascent Thermo Scientific 5300172 aequorin luminescence measurement
MES buffer Himedia RM1128-100G plant growth
Murashige and skoog media Himedia PT021-25L plant growth
Sodium hydroxide Fisher Scientific 27805 for neutralizing EMS
Sodium hypochlorite Merck Life Sciences 1.93607.5021 sterlization solution
Sodium thiosulfate Fisher Scientific 28005 for seed washing in step 1.6
soilrite Lab Chem India for plant growth
Square pots Lab Chem India for plant growth
Sucrose Sigma Aldrich S0389 plant growth
Taxim Alkem 7180720 for seedling rescue

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References

  1. Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
  2. Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
  3. Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
  4. Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  5. White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
  6. Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
  7. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
  8. Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
  9. Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
  10. Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
  11. McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
  12. Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
  13. Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
  14. Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
  15. Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
  16. Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
  17. Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
  18. Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
  19. Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
  20. Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
  21. Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
  22. Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
  23. Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
  24. Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362 (2007).
  25. Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
  26. Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
  27. Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
  28. Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
  29. Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
  30. Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
  31. Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
  32. Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
  33. Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
  34. Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
  35. Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
  36. Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
  37. Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).

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Biología Número 162 Aequorin Arabidopsis Señalización de calcio EMS Pantalla genética directa
Antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio
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Mittal, D., Mishra, S., Prajapati,More

Mittal, D., Mishra, S., Prajapati, R., Vadassery, J. Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling. J. Vis. Exp. (162), e61259, doi:10.3791/61259 (2020).

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