Fremover genetisk skjerm ved hjelp av transgen kalsium reporter aequorin å identifisere nye mål i kalsium signalering
Summary
En fremover genetisk skjerm basert på Ca2 + høyde som en opplesning fører til identifisering av genetiske komponenter involvert i kalsiumavhengige signalveier i planter.
Abstract
Fremover genetiske skjermer har vært viktige verktøy i objektiv identifisering av genetiske komponenter involvert i flere biologiske veier. Grunnlaget for skjermen er å generere en mutant populasjon som kan screenes med en fenotype av interesse. EMS (etylmetansulfonat) er et vanlig alkylerende middel for å indusere tilfeldig mutasjon i en klassisk fremover genetisk skjerm for å identifisere flere gener involvert i en gitt prosess. Cytosolic kalsium (Ca2 +) høyde er en viktig tidlig signalvei som aktiveres ved stresspersepsjon. Men identiteten til reseptorer, kanaler, pumper og transportører av Ca2 + er fortsatt unnvikende i mange studiesystemer. Aequorin er et cellulært kalsiumreporterprotein isolert fra Aequorea victoria og stabilt uttrykt i Arabidopsis. Ved å utnytte dette, designet vi en fremover genetisk skjerm der vi EMS-mutagenized aequorin transgenic. Frøene fra de muterte plantene ble samlet (M1) og screening for fenotypen av interesse ble utført i den segregerende (M2) befolkningen. Ved hjelp av en 96-brønns høygjennomstrømning Ca2 + måleprotokoll, kan flere nye mutanter identifiseres som har en varierende kalsiumrespons og måles i sanntid. Mutantene med fenotypen av interesse blir reddet og spredt til en homozygotert plantepopulasjon oppnås. Denne protokollen gir en metode for fremover genetiske skjermer i Ca2 + reporter bakgrunn og identifisere romanen Ca2 + regulerte mål.
Introduction
En endring i cytosolisk kalsium (Ca2+) konsentrasjon ved oppfatning av biotisk eller abiotisk stimulans er en godt studert tidlig signalhendelse som aktiverer mange signalveier1,,2,,3,4. En celle i sin basal hvile tilstand opprettholder en lavere Ca2 + konsentrasjon i cytosol og sequesters overflødig Ca2 + i ulike intracellulære organeller og ekstracellulær apoplast fører til en bratt Ca2 + gradient5,6. Ved signaloppfatning stiger Ca2+ nivåer i cytosolen på grunn av en tilstrømning av Ca2+ fra ekstracellulære og/eller intracellulære kilder og genererer en stimulispesifikk kalsiumsignatur7,,8,,9. Ca2 + høyder i cytosol aktiveres av mange stimuli, men spesifisitet opprettholdes av forskjellige butikker som frigjør Ca2 +, en unik Ca2 + signatur og passende sensorproteiner10,11.
Bruken av alkylerende middel, etyl-metansulfonat (EMS) for mutagenese er et kraftig verktøy i klassiske fremover genetiske skjermer for å identifisere flere uavhengige gener involvert i en prosess. EMS er en kjemisk mutagen som hovedsakelig induserer C til T og G til en overgang tilfeldig gjennom genomet og produserer en 1 bp endring i hver 125 kb av genomet. EMS mutagenesis vil indusere ‰1000 enkelt base par endringer, enten innsetting / slettinger (InDel) eller enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) per genom12. EMS-induserte mutasjoner er flere punktmutasjoner med en mutasjonsfrekvens fra 1/300 til 1/30000 per locus. Dette reduserer antall M1 planter som trengs for å finne en mutasjon i et gitt gen. En M1 frø populasjonsområde av 2000-3000 brukes vanligvis til å oppnå mutasjoner av interesse i Arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin transgenics er Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ecotype planter som uttrykker p35S-apoaequorin (pMAQ2) i cytosol15. Aequorin er et Ca2+ bindende protein bestående av apoprotein og en protesegruppe bestående av luciferinmolekyl, coelenterazine. Bindingen av Ca2 + til aequorin, som har tre Ca2 + bindende EF-hender nettsteder, resulterer i coelenterazine blir oksidert og syklisert for å gi dioksetanon mellom, etterfulgt av en konformasjonsendring av proteinet ledsaget av frigjøring av karbondioksid og singlet-spent coelenteramid16. Coelenteramide så produsert avgir et blått lys (λmax, 470 nm) som kan oppdages av luminometer17. De ekstremt raske Ca2 + høyder kan dermed måles i sanntid, og utnyttes for raske fremover genetiske skjermer. Denne protokollen tar sikte på å bruke spesifisiteten av kalsiumrespons for å identifisere nye nøkkelspillere som er involvert i Ca2 + signaturen. For å oppnå denne oppgaven bruker vi EMS mutagenesis i transgen aequorin og identifiserer SNPs forbundet med endret Ca2 + signalering. Protokollen identifiserer mutanter som viser ingen eller redusert Ca2 + høyder ved stimuli tillegg. Disse mutantene kan deretter kartlegges for å identifisere genene som er ansvarlige for Ca2+ responsen. Metoden gjelder for alle typer flytende stimuli i planter som resulterer i en Ca2 + høyde. Siden Ca2 + høyde er en av de første svarene i anlegget forsvar signalveien, identifisering av oppstrøms responskomponenter kan gi kandidater for genteknologi for å utvikle elastiske planter.
Protocol
Representative Results
Discussion
EMS mutagenesis er et kraftig verktøy for å generere mutasjoner i befolkningen. De klassiske fremover genetiske skjermer ved hjelp av EMS har vært et effektivt verktøy for å identifisere nye gener av to hovedgrunner: for det første krever de ingen tidligere antagelser om genidentitet og for det andre introduserer de ingen bias. Det finnes flere metoder for å generere en screening populasjoner som EMS, T-DNA innsettinger, stråling etc. Ut av alle metodene har EMS-basert mutagenese få fordeler over de andre metode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker National Institute of Plant Genome Research – Phytotron Facility for plantevekst, Bombay Locale for videoopptaket, og Institutt for bioteknologi- eLibrary Consortium for å gi tilgang til e-ressurser. Dette arbeidet ble støttet av Institutt for bioteknologi, India gjennom National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; og CSIR-Junior Research Fellowship (til D.M og S.M) og Institutt for bioteknologi-juniorstipendiatstipendiat (til R.P).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M., Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. , 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G., Running, M. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G., Rosato, E. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G., Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J., Flanders, D., Dean, C. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). , 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
