Summary

Fremover genetisk skjerm ved hjelp av transgen kalsium reporter aequorin å identifisere nye mål i kalsium signalering

Published: August 01, 2020
doi:

Summary

En fremover genetisk skjerm basert på Ca2 + høyde som en opplesning fører til identifisering av genetiske komponenter involvert i kalsiumavhengige signalveier i planter.

Abstract

Fremover genetiske skjermer har vært viktige verktøy i objektiv identifisering av genetiske komponenter involvert i flere biologiske veier. Grunnlaget for skjermen er å generere en mutant populasjon som kan screenes med en fenotype av interesse. EMS (etylmetansulfonat) er et vanlig alkylerende middel for å indusere tilfeldig mutasjon i en klassisk fremover genetisk skjerm for å identifisere flere gener involvert i en gitt prosess. Cytosolic kalsium (Ca2 +) høyde er en viktig tidlig signalvei som aktiveres ved stresspersepsjon. Men identiteten til reseptorer, kanaler, pumper og transportører av Ca2 + er fortsatt unnvikende i mange studiesystemer. Aequorin er et cellulært kalsiumreporterprotein isolert fra Aequorea victoria og stabilt uttrykt i Arabidopsis. Ved å utnytte dette, designet vi en fremover genetisk skjerm der vi EMS-mutagenized aequorin transgenic. Frøene fra de muterte plantene ble samlet (M1) og screening for fenotypen av interesse ble utført i den segregerende (M2) befolkningen. Ved hjelp av en 96-brønns høygjennomstrømning Ca2 + måleprotokoll, kan flere nye mutanter identifiseres som har en varierende kalsiumrespons og måles i sanntid. Mutantene med fenotypen av interesse blir reddet og spredt til en homozygotert plantepopulasjon oppnås. Denne protokollen gir en metode for fremover genetiske skjermer i Ca2 + reporter bakgrunn og identifisere romanen Ca2 + regulerte mål.

Introduction

En endring i cytosolisk kalsium (Ca2+) konsentrasjon ved oppfatning av biotisk eller abiotisk stimulans er en godt studert tidlig signalhendelse som aktiverer mange signalveier1,,2,,3,4. En celle i sin basal hvile tilstand opprettholder en lavere Ca2 + konsentrasjon i cytosol og sequesters overflødig Ca2 + i ulike intracellulære organeller og ekstracellulær apoplast fører til en bratt Ca2 + gradient5,6. Ved signaloppfatning stiger Ca2+ nivåer i cytosolen på grunn av en tilstrømning av Ca2+ fra ekstracellulære og/eller intracellulære kilder og genererer en stimulispesifikk kalsiumsignatur7,,8,,9. Ca2 + høyder i cytosol aktiveres av mange stimuli, men spesifisitet opprettholdes av forskjellige butikker som frigjør Ca2 +, en unik Ca2 + signatur og passende sensorproteiner10,11.

Bruken av alkylerende middel, etyl-metansulfonat (EMS) for mutagenese er et kraftig verktøy i klassiske fremover genetiske skjermer for å identifisere flere uavhengige gener involvert i en prosess. EMS er en kjemisk mutagen som hovedsakelig induserer C til T og G til en overgang tilfeldig gjennom genomet og produserer en 1 bp endring i hver 125 kb av genomet. EMS mutagenesis vil indusere ‰1000 enkelt base par endringer, enten innsetting / slettinger (InDel) eller enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) per genom12. EMS-induserte mutasjoner er flere punktmutasjoner med en mutasjonsfrekvens fra 1/300 til 1/30000 per locus. Dette reduserer antall M1 planter som trengs for å finne en mutasjon i et gitt gen. En M1 frø populasjonsområde av 2000-3000 brukes vanligvis til å oppnå mutasjoner av interesse i Arabidopsis thaliana13,14.

Aequorin transgenics er Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ecotype planter som uttrykker p35S-apoaequorin (pMAQ2) i cytosol15. Aequorin er et Ca2+ bindende protein bestående av apoprotein og en protesegruppe bestående av luciferinmolekyl, coelenterazine. Bindingen av Ca2 + til aequorin, som har tre Ca2 + bindende EF-hender nettsteder, resulterer i coelenterazine blir oksidert og syklisert for å gi dioksetanon mellom, etterfulgt av en konformasjonsendring av proteinet ledsaget av frigjøring av karbondioksid og singlet-spent coelenteramid16. Coelenteramide så produsert avgir et blått lys (λmax, 470 nm) som kan oppdages av luminometer17. De ekstremt raske Ca2 + høyder kan dermed måles i sanntid, og utnyttes for raske fremover genetiske skjermer. Denne protokollen tar sikte på å bruke spesifisiteten av kalsiumrespons for å identifisere nye nøkkelspillere som er involvert i Ca2 + signaturen. For å oppnå denne oppgaven bruker vi EMS mutagenesis i transgen aequorin og identifiserer SNPs forbundet med endret Ca2 + signalering. Protokollen identifiserer mutanter som viser ingen eller redusert Ca2 + høyder ved stimuli tillegg. Disse mutantene kan deretter kartlegges for å identifisere genene som er ansvarlige for Ca2+ responsen. Metoden gjelder for alle typer flytende stimuli i planter som resulterer i en Ca2 + høyde. Siden Ca2 + høyde er en av de første svarene i anlegget forsvar signalveien, identifisering av oppstrøms responskomponenter kan gi kandidater for genteknologi for å utvikle elastiske planter.

Protocol

1. EMS mutagenese og enkelt stamtavle-basert frø samling (1-3 måneder) Vei 150 mg frø (~ 7500) av aequorin for EMS mutagenese (M0 frø). Vei ytterligere 150 mg frø som skal brukes som en kontroll. Overfør frøene til et 50 ml rør og tilsett 25 ml 0,2 % EMS (v/v) (FORSIKTIG) (for behandling) eller 25 ml autoklavert vann (for kontroll).MERK: Etyl-metansulfonat er et kjemisk middel for mutagenizing plantemateriale. Forsegle røret med parafilm og pakk det i aluminiumsfolie….

Representative Results

EMS-populasjonen ble screenet for H2O2 indusert Ca2+ høyde. Som omtalt tidligere, ble 12 individuelle M2 frøplanter screenet fra hver M1 linje. I figur 3plottes en slik M1-linje med hvert panel som viser 12 individuelle M 2-frøplanter.2 En vill type aequorin brukes som kontroll for å sammenligne og evaluere mutantresponsen. En resessiv mutant segregerer i forholdet 1:7 (mutant: non mutant). Når vi screener 12 i…

Discussion

EMS mutagenesis er et kraftig verktøy for å generere mutasjoner i befolkningen. De klassiske fremover genetiske skjermer ved hjelp av EMS har vært et effektivt verktøy for å identifisere nye gener av to hovedgrunner: for det første krever de ingen tidligere antagelser om genidentitet og for det andre introduserer de ingen bias. Det finnes flere metoder for å generere en screening populasjoner som EMS, T-DNA innsettinger, stråling etc. Ut av alle metodene har EMS-basert mutagenese få fordeler over de andre metode…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker National Institute of Plant Genome Research – Phytotron Facility for plantevekst, Bombay Locale for videoopptaket, og Institutt for bioteknologi- eLibrary Consortium for å gi tilgang til e-ressurser. Dette arbeidet ble støttet av Institutt for bioteknologi, India gjennom National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; og CSIR-Junior Research Fellowship (til D.M og S.M) og Institutt for bioteknologi-juniorstipendiatstipendiat (til R.P).

Materials

24 well tissue culture plate Jetbiofil 11024 for growing seedlings
96 well white cliniplate Thermo Scientific 9502887 for luminometer measurements
Aequorin
Agropet Lab Chem India for plant growth
Calcium chloride Fisher Scientific 12135 for discharge solution
Coelenterazine PJK 55779-48-1 prosthetic group for aequorin
Ehtylmethane sulfonate Sigma Aldrich M0880-5G for seed mutagenesis
Ethanol Analytical reagent 1170 for discharge solution
Hydrochloric acid Merck Life Sciences 1.93001.0521 sterlization solution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific 15465 as stimulus for Calcium elevation
Luminoskan ascent Thermo Scientific 5300172 aequorin luminescence measurement
MES buffer Himedia RM1128-100G plant growth
Murashige and skoog media Himedia PT021-25L plant growth
Sodium hydroxide Fisher Scientific 27805 for neutralizing EMS
Sodium hypochlorite Merck Life Sciences 1.93607.5021 sterlization solution
Sodium thiosulfate Fisher Scientific 28005 for seed washing in step 1.6
soilrite Lab Chem India for plant growth
Square pots Lab Chem India for plant growth
Sucrose Sigma Aldrich S0389 plant growth
Taxim Alkem 7180720 for seedling rescue

References

  1. Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
  2. Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
  3. Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
  4. Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  5. White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
  6. Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
  7. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
  8. Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
  9. Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
  10. Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
  11. McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
  12. Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
  13. Koornneef, M., Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. , 1-10 (2002).
  14. Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
  15. Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
  16. Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G., Running, M. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 45-54 (2013).
  17. Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
  18. Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
  19. Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
  20. Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
  21. Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
  22. Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
  23. Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
  24. Maple, J., Moeller, S. G., Rosato, E. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. , 362 (2007).
  25. Qu, L. J., Qin, G., Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1062, (2014).
  26. Leyser, H. M. O., Furner, I. J., Flanders, D., Dean, C. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). , 9-10 (1993).
  27. Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
  28. Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
  29. Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
  30. Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
  31. Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
  32. Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
  33. Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
  34. Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
  35. Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
  36. Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
  37. Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).

Play Video

Cite This Article
Mittal, D., Mishra, S., Prajapati, R., Vadassery, J. Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling. J. Vis. Exp. (162), e61259, doi:10.3791/61259 (2020).

View Video