Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için

doi: 10.3791/61259 Published: August 1, 2020

Summary

Ca2+ yüksekliğine dayalı ileri genetik ekran, bitkilerde kalsiyuma bağımlı sinyal yollarında yer alan genetik bileşenlerin tanımlanmasına yol açar.

Abstract

İleri genetik ekranlar çeşitli biyolojik yollarda yer genetik bileşenlerin tarafsız belirlenmesinde önemli araçlar olmuştur. Ekranın temeli ilgi bir fenotip ile taranabilir bir mutant popülasyon oluşturmaktır. EMS (etil metan sülfonat) herhangi bir süreçte yer alan birden fazla gentanımlamak için klasik ileri genetik ekranda rastgele mutasyon indükleyen yaygın olarak kullanılan bir alkilleyici ajandır. Sitosolik kalsiyum (Ca2+) yükseklik stres algısı üzerine aktive olan önemli bir erken sinyal yoludur. Ancak Ca2+ reseptörlerinin, kanallarının, pompalarının ve ışınlayıcılarının kimliği birçok çalışma sisteminde hala zordur. Aequorin, Aequorea victoria'dan izole edilmiş ve Arabidopsis ile ifade edilen hücresel kalsiyum muhabiri proteindir. Bunu sömürerek, aequorin transgenik eMS-mutajenize bir ileri genetik ekran tasarladık. Mutant bitkilerden elde edilen tohumlar toplandı (M1) ve ilgi fenotip için tarama ayrıştırma (M2)popülasyonunda yapıldı. 96-iyi yüksek-throughput Ca2 + ölçüm protokolü kullanılarak, çeşitli yeni mutantlar farklı bir kalsiyum yanıtı var ve gerçek zamanlı olarak ölçülür tespit edilebilir. İlgi fenotipleri olan mutantlar kurtarılır ve homozigot mutant bitki popülasyonu elde edilene kadar yayılır. Bu protokol, Ca2+ muhabir arka planında ileri genetik ekranlar için bir yöntem sağlar ve yeni Ca2+ düzenlenmiş hedefleri tanımlar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biyotik veya abiyotik uyarıcı algısı üzerine sitosolik kalsiyum (Ca2 +) konsantrasyonunda bir değişiklik birçok sinyal yolları 1 aktive bir iyi çalışılmış erken sinyalolaydır 1,2,3,4. Bazal istirahat durumunda bir hücre sitosol daha düşük Bir Ca2 + konsantrasyonu korur ve çeşitli hücre içi organeller de Ca2 + fazla sekanslar ve sarp Ca 2+ gradyan5,yol açan hücre dışı apoplast ,6. Sinyal algısı üzerine, Ca2 + düzeyleri ekstrasellüler ve / veya hücre içi kaynaklardan Ca2 + bir akını nedeniyle sitosol artış ve bir uyarıcı özel kalsiyum imza oluşturmak7,8,9. Sitosol Ca2 + yükseklikleri birçok uyarantarafından aktive edilir, ancak özgüllük ca2 serbestfarklı mağazalar tarafından korunur + , benzersiz bir Ca 2+ imza ve uygun sensör proteinleri10,11.

Mutagenez için alkilleyici ajan, etil metan sülfonat (EMS) kullanımı, bir süreçte yer alan birden fazla bağımsız geni tanımlamak için klasik ileri genetik ekranlarda güçlü bir araçtır. EMS, c'den T'ye ve G'yi genomun her 125 kb'sinde rastgele a geçişlerine neden olan ve 1 bp'lik bir değişim üreten kimyasal bir mutajentir. EMS mutagenezi12genom başına ekleme/silme (InDel) veya tek nükleotit polimorfizm (SNP) olmak üzere 1000 tek baz çifti değişikliğine neden olur. EMS'ye bağlı mutasyonlar, lokus başına 1/300 ile 1/30000 arasında değişen mutasyon frekansı ile birden fazla nokta mutasyonudır. Bu, belirli bir gende mutasyon bulmak için gereken M1 bitkilerinin sayısını azaltır. 2000-3000 Bir M1 tohum popülasyon aralığı genellikle Arabidopsis thaliana13ilgi mutasyonları elde etmek için kullanılır,14.

Aequorin transgenics Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ekotip bitkiler p35S-apoaequorin (pMAQ2) sitosol15ifade vardır. Aequorin apoprotein ve luciferin molekülü, coelenterazin oluşan bir protez grubu oluşan bir Ca2 + bağlayıcı proteindir. Ca2+ aequorin bağlanması, hangi üç Ca2 + bağlayıcı EF-hands siteleri vardır, coelenterazine okside ve dioksettanon ara vermek için siklize sonuçları, karbondioksit ve tek-heyecanlı coelenteramideserbest eşlik eden protein konformasyonel bir değişiklik izledi16. Coelenteramid böylece üretilen bir mavi ışık yakar (λmax, 470 nm) luminometer tarafından tespit edilebilir17. Son derece hızlı Ca2 + yükseklikleri böylece gerçek zamanlı olarak ölçülebilir, ve hızlı ileri genetik ekranlar için istismar. Bu protokol, Ca2+ imzasıyla ilgili yeni kilit oyuncuları tanımlamak için kalsiyum tepkisinin özgüllüğünü kullanmayı amaçlamaktadır. Bu görevi başarmak için transgenik aequorin'de EMS mutagenezkullanır ız ve değiştirilmiş Ca2+ sinyalizasyonuile ilişkili SNP'leri tanımlarız. Protokol, uyaran ların eklenmesi üzerine Ca2+ yükseklikleri göstermeyen veya küçülten mutantları tanımlar. Bu mutantlar daha sonra Ca2 + yanıtı sorumlu genleri tanımlamak için eşlenebilir. Bu yöntem, bitkilerde Ca2+ yüksekliğiile sonuçlanan her türlü sıvı uyaran için geçerlidir. Ca2+ yüksekliği bitki savunma sinyal yolundaki ilk tepkilerden biri olduğundan, yukarı akım tepki bileşenlerinin belirlenmesi dirençli bitkiler geliştirmek için genetik mühendislik adayları sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. EMS mutagenez ve tek soy bazlı tohum toplama (1-3 ay)

  1. EMS mutagenez (M0 tohum) için aequorin 150 mg tohum (~7500) tartın. Bir kontrol olarak kullanılmak üzere tohum başka bir 150 mg tartın.
  2. Tohumları 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 25 mL %0,2 EMS (v/v) (DİkKAT) veya 25 mL otoklavlı su (kontrol için) ekleyin.
    NOT: Etil-metan sülfonat, bitki materyalini mutasyona uğratan kimyasal bir maddedir.
  3. Tüpü parafilm ile kapatın ve alüminyum folyoya sarın. Tüpü oda sıcaklığında 18 saat boyunca uçuçta döndürün.
  4. Tohumların yerleşmesine izin ver. EMS çözeltisini dikkatlice çıkarın ve eşit hacimlerde 1 M NaOH içeren bir atık kabına atın (NaOH, EMS'nin atılması güvenli hale getirilmesini sağlayan EMS'yi nötralize etmeye/inaktive etmeye yardımcı olur). Kullanılan plastik leri 1 M NaOH çözeltisinde atın.
    NOT: 24 saat sonra, tehlikeli madde laboratuvar uygulamalarına göre atar atın.
  5. Mutajenize edilmiş tohumları en az 8 kez 40 mL otoklavlı su ile iyice yıkayın. Yukarıda belirtildiği gibi bir NaOH atık kabına su içeren EMS atın.
  6. Son yıkama için 40 mL 100 mM sodyum tiyosülfat ekleyin ve EMS izlerini gidermek için 3 kez durulayın.
  7. Tohumları 40 mL otoklavlı suda ıslatın ~ 1 saat tohumlardan EMS dağıtmak için ve sonra tamamen kuruyana kadar filtre kağıdına yerleştirin.
  8. Tohumları mikrosentrifüj tüpüne aktarın ve tohumları 4 °C'de 40 mL otoklavlı suda 2-4 gün boyunca katmanlayın. Bu tohum atıllığı kırma yardımcı olur ve homojen büyüme sağlar.
  9. Hem mutajenize tohumları (M0)hem de kontrol tohumlarını toprağa (toprak bileşimi: agropet: soilrite, 1:1) aktarın ve 16 saat ışık/8 h karanlık fotoperi, 150 μmol−m−2−s−s −1 ve ~%70 bağıl nem ile büyüme odalarına aktarın.
  10. Mutagenezin başarılı olup olmadığını belirlemek için çimlenme hızının ve fide büyümesinin azalmasını ve klorofil leziz18'i arayın (Şekil 1A).18 Bu fizyolojik ve gelişimsel farklılıkları belirlemek için kontrol tesisleri ile mutajenize edilmiş bitkileri karşılaştırın.
    NOT: M1 bitkilerinden tohum hasat için farklı yöntemler kullanılabilir. Bu protokolde tek soy bazlı tohum toplama yöntemini kullandık. Her M1 tesisine A1'den A3500'e kadar benzersiz bir numara verilir.
  11. Ayrı ayrı numaralanmış bitkileri ayrı ayrı bitki hatları olarak koruyun(Şekil 1B).
  12. Olgunlaşma üzerine, bu bireysel mutant bitkilerden tohum hasat ve bireysel M1 hatları olarak saklamak(Şekil 2). Tek soy bazlı tohum koleksiyonundan, 3500 M 1 hattının 3500 M1 hattının tarandığı yaklaşık 5000 M1 hattı elde ettik.

2. Mutantları seçmek için yüksek iş tarama (8 ay)

  1. Seçilen bir uyarıcıya Ca2+ yanıtına dayanan yeni mutantları tanımlayın. Burada, bir örnek olarak H2O2 kullanılır.
  2. Mutantları tanımlamak için M2 neslini tarar. Resesif mutantlar EMS mutagenezi14üzerine M2 kuşağında 1/8 frekansta ayrıştırık olduğundan, 8-12 M2-ayırıcı bitkilerin taranması bir M1 hattını kaplar ve homozigot bir resesif mutantı tanımlar (12 fide kullanarak mutant bulma olasılığını artırır). Her bağımsız M1 serisinden, Ca2+ yanıtı için 12 M2 fidesini H2O2 (M1 satırıbaşına 12 M2 fide) test edin.
  3. Yüksek iş biçen tohum sterilizasyonu ve hidroponik bitki büyüme protokolükullanın 19. 24 kuyulu doku kültür plakasının tek tek kuyularında M1 serisi başına yaklaşık 12-15 M2 tohum yerleştirin ve klor gazı (40 mL %12 sodyum hipoklorit ve hidroklorik asit, 3:1, v/v) bir dezikkatöre bir duman kaputunda 4 saat sterilize edin. İşlemden sonra, kurutucuyu açın ve klor gazının buharlaşması için bir gecede bırakın.
  4. Sterilizasyondan sonra, plakaları dışarı getirin ve tek tek kuyulara sıvı 1/2 MS ortam (agarsız yarı mukavemetli MS) ekleyin. Plakaları parafilm ile kapatın ve tohumları 4 °C'de 2-4 gün boyunca yapıştırın ve tohumları %70 bağıl nem oranıyla 20-22 °C'de 10 saat Açık/ 14 saat karanlık fotoperiyotla bir büyüme odasına taşıyın.
  5. Fideler 8-12 günlük olduktan sonra, her çizgiden ayrı ayrı 12 M2 fideyi 96 kuyulu bir luminometre plakası koyun. Ca2+ yanıtını H2O2'yeölçmek için bir luminometre plaka okuyucu kullanın.
  6. Fide transferinden sonra, 150 μL 5-10 μM coelentrazine çözeltisi (metanoldeki 5 mM'lik bir stoktan otoklavlı suda seyreltilmiş) (DİkKAT) koyu/düşük ışıklı bir alanda ayrı kuyularda ve 21 °C'de karanlıkta 8 saat saklayın.
    NOT: Coelentrazine apo-aequorin bağlanır ve fonksiyonel aequorin için yeniden bir protez grubudur. Coelentrazine ışığa duyarlıdır ve bu nedenle ışıktan korunan koyu renkli şişelerde saklanır.
  7. Ertesi gün, bir uyarıcı olarak 10 mM H2O2 kullanarak mutant ekran gerçekleştirmek ve sonraki Ca2 + tepki ölçmek.
  8. 24 kuyunun eşzamanlı ölçümü için, arka planı 1 dakika ölçen, ardından uyaran ilavesi (40 μL) ve 10 dk ölçümü, ardından toplam aequorin deşarjı (150°L 20 etanolde2 MCaCl) ile 1-2 dakika boyunca ölçülür otomatik bir kinetik program oluşturun.
    NOT: Ölçülen Ca2+ miktarını ölçmek için toplam aequorin için bir son deşarj ve fonksiyonel aequorin için ek kontrol gereklidir. Son deşarj 1-2 dk kısa bir çalışma ve önemli bitki ölümüne neden olmaz. Alternatif olarak, bitkiler deşarj adımından sonra ölürse, belirli M1 hattını yeniden taranır ve deşarj olmadan kurtarın. Bu tür mutantlar deşarj adımı kullanılarak M3 ve M4 nesillerinde teyit edilebilir.
  9. Her satırı 7 s aralığında ölçen ve ölçüm noktası başına 300 ms entegrasyon süresi ölçen 24 iyi formatlı bir tarama yöntemi kullanın. Karşılaştırma ve mutant değerlendirilmesi için her satırda kontrol olarak bir vahşi tip fide kullanın.
    NOT: M2 fidesi içeren tek bir 96 kuyu plakası 8 ayrı M1 çizgisini (8 M1 *12=96 M2)kapsayacak ve 2,5 saat taranabilir ve her gün 32 M1 hat, ayda 640 M1 bitki taranacaktır. Bitkiler hazır olduktan sonra tüm tarama işlemi yaklaşık 8 ay sürer.
  10. H2O2ile ca2+ yanıtı kaybına veya azaltılmış yanıta göre mutantları tanımlayın. Seçilen mutantları antibiyotik bazlı bir yıkama işlemi yle kurtarın. Fideyi 25 mg/L sefotaksim çözeltisi ile iki kez yıkayın ve 1/2 MS agar'da 25 mg/L sefotaksim içeren kurtarma ortamına aktarın.
  11. Bir mutant bitki elde etmek için 10 saat ışık / 14 saat karanlık fotoperiod plakaları büyütün. Sefotaksim yıkama fide üzerinde herhangi bir zararlı mikroorganizmaların kaldırmak için yardımcı olur. Yeniden yapılanma sonrası fideler mühürsüz tutulduğundan, steril duruma geri aktarılırken kontaminasyonu en aza indirin.
  12. Homozigot M3 popülasyonunu elde etmek için mutant bitkiyi toprağa aktarın.

3. Veri analizi ve mutant tanımlama (1-3 ay)

NOT: Yukarıdaki yöntemden elde edilen ölçümler göreli ışık birimlerinde (RLU) bulunmaktadır.

  1. [Ca2+]cyt konsantrasyonu hesaplamak için aşağıdaki konsantrasyondenklemini kullanın 20.
    pCa = 0.332588(−log (L/Lmax)) + 5.5593
    Luminesans sayıları () ve toplam kalan sayımlar(max).
  2. Elde edilen pCa değerlerini 106ile çarparak [Ca2+]cyt değerlerine dönüştürün. Daha sonra grafiksel ca2 + yanıt putatif H2O2 mutantlar tanımlamak için bir aequorin (transgenik Col-0 aequorin) kontrol karşı arsa.
  3. Kurtarma fidelerinde kayıp veya azalan yanıt gösteren H2O2 uygulaması kurtarıldı.
  4. Olgunlaşma üzerine, kurtarılan mutant tohumları hasat ve M3 fideh2O2 yanıt için yeniden ekran. Tüm 12 M3 fideler anne bitki benzer bir Ca2 + yanıt gösteriyorsa, homozigot M3 mutant popülasyon olarak nüfus düşünün. Tüm 12 fide böyle bir yanıt görünmüyorsa, o zaman M4 nesil götürün ve homozigot nüfus elde etmek için yeniden ekran.
  5. Homozigot bir bitki hattı elde edildikten sonra, yeni nesil sıralama kullanarak değiştirilmiş fenotip giden geni tanımlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

EMS popülasyonu H2O2 indüklenen Ca2+ yüksekliği için tarandı. Daha önce de belirtildiği gibi, her M1 serisinden 12 ayrı M2 fidesi tarandı. Şekil 3'te,12 ayrı M2 fidesini gösteren her panelile böyle bir M1 çizgisi çizilir. Bir vahşi tip aequorin karşılaştırma ve mutant yanıtı değerlendirmek için kontrol olarak kullanılır. 1:7 (mutant: mutant olmayan) oranında bir resesif mutant ayrılır. M1 hattı başına 12 ayrı fide tararken, hat başına 1 veya 2 mutant tespit edebiliriz. 12 M2 fidesinden 2 putatif mutant tespit ettik(Şekil 3). Bu mutantlar daha fazla M3 ve M4 alınır ve homozigot popülasyon oluşturulur. Homozigot mutant nedensel geni tanımlamak için daha fazla eşlenir.

Figure 1
Şekil 1: EMS mutajenize arabidopsis. (A) Başarılı bir EMS mutagenezini belirlemek için, mutajenleşmiş bitki popülasyonunda (ok ile gösterilir) klorofil leziz hale gelmiştir. İstatistiksel olarak, M1 tesislerinin %0,1 ila %1'i klorotik sektörleri göstermelidir. (B) Tek bir soy bazlı tohum toplama yapmak için M1 bitkilerinin ayrı ayrı çömlekçilik yapılması yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: İleri genetik tarama metodolojisinin şematik gösterimi. Col-0'da sitosolik Aequorin (Aeq) içeren 7500 transgenik Arabidopsis bitkisi M0 kuşağında etil metansülfonat (EMS) ile mutajenize edilir. M1 neslinden yaklaşık 5000 fide tek soy ağacı yöntemi yle tek tek yayılır ve M2 nesle yayılır. Her M2 serisinden 12 tesis ilgi fenotipine göre taranır (yaklaşık 3000-3500 M1 çizgiler). İlgi nin fenotipiçin Mutant kurtarılır ve M3 nesil yayılır ve homozigozluk için taranmış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: H2O2 tedavisine değişmiş yanıt lı mutantların belirlenmesi. Tek bir ayrımitM1 satırından mutant seçimini betimleyen temsili bir figür gösterilmiştir. Paneller, 10 mM H2O2ile uyarılması üzerine tarama sonucunu (tek tekM 1 hattı başına 12 ayrıM 2 fidesi) gösterir. WT (Aequorin) kontrolü (yeşil çizgi), tüm 12 M2 fide ortalaması ortalama tepki (kırmızı çizgi) ve A1-X (siyah çizgi) 1-12 numaralı bireysel fidelerdir. Her grafik için y ekseni [Ca2+]cyt (μM) ve x ekseni zaman (min) dir. [Ca2+] cyt düzeyleri göreli ışık birimlerinden (RTU) hesaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

EMS mutagenez popülasyonda mutasyonlar oluşturmak için güçlü bir araçtır. EMS kullanan klasik ileri genetik ekranlar iki önemli nedenden dolayı yeni genleri tanımlamak için etkili bir araç olmuştur: birincisi, gen kimliği üzerinde önceden varsayımlar gerektirmez ve ikinci olarak, herhangi bir önyargı tanıtmak yok. EMS, T-DNA eklemeleri, radyasyon vb. gibi tarama popülasyonları oluşturmak için çeşitli yöntemler vardır. Tüm yöntemler arasında EMS tabanlı mutagenezinin diğer yöntemlere göre çok az avantajı vardır. İlk olarak, mevcut protokol21,,22açıklandığı gibi EMS maruz kalma ile bir mutant nüfus oluşturmak daha kolaydır. İkinci olarak, bir veya daha fazla uyarıcı için birden fazla ekran için kullanılabilir mutant tohum popülasyonu, yeterince büyük sayıda oluşturulabilir. Üçüncü olarak, yanlış bir mutasyon nedeniyle oluşan temel bir genin zayıf alelleri tespit edilebilir. Dördüncü olarak, tam fonksiyon kaybı, kısmi fonksiyon kaybı, değiştirilmiş fonksiyon ve kurucu gen fonksiyonu da dahil olmak üzere EMS ekranı kullanılarak bir dizi gen fonksiyonu etkileri tanımlanabilir. Diğer mutagenez yöntemleri23,24,,25tarafından mümkün değildir çift mutantların belirlenmesinde yardımcıolabilir. Bu protokolde kullanılan tek soy bazlı M1 tohum toplama da avantajlıdır, çünkü gelecek nesillerde soyundan gelen ata nın kaybolması halinde, aynı mutantı tekrar tanımlamak için ana popülasyona geri dönmeolanağı sağlar. Homozigot olduğunda kısır olan ve mutant bitkilerin heterozigot kardeşleri aracılığıyla kurtarılabilen mutasyonları kurtarma imkanı sunar. İkinci olarak, bu strateji M1 nesil tohumların şişirme ile karşılaştırıldığında izole tüm mutantların bağımsızlığını garanti eder. M2 koleksiyonundan izole edilen mutasyonların aynı mutasyonolayı26yerine aynı çekirgede farklı aleller olmasını sağlar.

EMS mutagenez ekranları ile tanımlanan genler popülasyonun taranmasında kullanılan fenotiplere bağlıdır. İlginin fenotipi ne kadar hızlı taranabilirse, yeni yolları o kadar kolay tanımlamak daha kolaydır. Ca2+, etkinleştirilecek ilk sinyal basamakları arasında yer alan her yerde bulunan ikincil bir habercidir. Bu biyotik ve abiyotik uyaranların geniş bir dizi karşı bitki tepkisi için bir arabulucu olarak hareket eder. Ayrıca, kalsiyum muhabiri aequorin çeşitli alt hücresel bölmeleri ve organeller27,,28,,29lokalize edilebilir. Bu kalsiyum tepki dinamiği30,31,,32bu bölmelerde lokalize protein rollerini belirlemek için yollar açar.

Aequorin'deki EMS-mutageneze dayalı ileri genetik ekranlar ve ca2+ kullanımı, keşiflerinden bu yana çağdaş lığını korumuştur. Bu yöntemin avantajları tuzaklar ağır bastı. Ancak, tekniğin birkaç sınırlaması hala dikkatle değerlendirilmesi gerekir. Ekran emek ve zaman yoğun ve geniş bir mutajennüfusmutant bitkilerin belirlenmesi ni gerektirir. Bu nedenle, deneysel plana başlamadan önce kaynak kullanılabilirliğine, iş personeli gereksinimine ve alan kısıtlılıklarına dayalı ayrıntılı planlama yapılmalıdır. Aequorin tabanlı Ca2+ ekranların ikinci büyük zorluğu, bir deşarj adımı olmadan yanlış pozitif olma olasılığıdır. Bu nedenle protokole çok kısa bir deşarj adımı dahildir. Rastgele mutasyonlar da birden fazla mutasyon nedeniyle kurtarılamaz steril bitkilerin nesil yol açabilir. Üçüncü olarak, Ca2+ imzası yüksek oranda dokuya özgüdür ve taramada tutarlılıksağlanmalıdır 4.

Birçok ileri genetik ekranlar reseptörleri tespit var, kanallar, pompalar ve Taşıyıcılar Ca2 + ileri genetik bir tarama fenotip olarak Ca2 + kullanımı nadirdi. Uyaranlar (örneğin, H2O2) indüklenen Ca2+ yüksekliği, süreç içinde yer alan yeni genetik bileşenleri belirlemek için metodolojimizde ileri genetik bir ekran için belirteç olarak kullanılır. EMS mutagenized aequorin popülasyonu kullanarak benzer bir strateji eATP reseptörü33olan DORN1 gibi birçok reseptörün keşfine yol açmıştır , kalsiyum kanalı OSCA34, Lipopolislysaccharide algılama dahil LOREreseptörü 35 ve ribonükleaz PARN136. Wu ve ark. tarafından yayınlanan yeni bir çalışmada h2O2 elicitation üzerine EMS-mutajenize aequorin bitkilertarama çok benzer bir metodoloji kullanmıştır yeni hidrojen peroksit sensörü HPCA137tanımlamak için . Bu nedenle Ca2+ muhabir arka planda EMS mutagenezini kullanan protokol, uyaran algılamada yer alan yeni gen keşfi için umut verici bir yöntemdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların hiçbirinin beyan etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Acknowledgments

Ulusal Bitki Genom Araştırma Enstitüsü - Bitki büyümesi için Fitotron Tesisi, video çekimi için Bombay Locale ve e-kaynaklara erişim sağlayan Biyoteknoloji- eLibrary Konsorsiyumu Bölümü'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma Biyoteknoloji Bölümü, Hindistan Ulusal Bitki Genom Araştırma Çekirdek Hibe Enstitüsü, Max Planck Gesellschaft-Hindistan Ortak Grup programı ile desteklenmiştir; ve CSIR-Junior Araştırma Bursu (D.M ve S.M.'ye) ve Biyoteknoloji-Junior Araştırma Bursu Bölümü (R.P.'ye).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well tissue culture plate Jetbiofil 11024 for growing seedlings
96 well white cliniplate Thermo Scientific 9502887 for luminometer measurements
Aequorin
Agropet Lab Chem India for plant growth
Calcium chloride Fisher Scientific 12135 for discharge solution
Coelenterazine PJK 55779-48-1 prosthetic group for aequorin
Ehtylmethane sulfonate Sigma Aldrich M0880-5G for seed mutagenesis
Ethanol Analytical reagent 1170 for discharge solution
Hydrochloric acid Merck Life Sciences 1.93001.0521 sterlization solution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific 15465 as stimulus for Calcium elevation
Luminoskan ascent Thermo Scientific 5300172 aequorin luminescence measurement
MES buffer Himedia RM1128-100G plant growth
Murashige and skoog media Himedia PT021-25L plant growth
Sodium hydroxide Fisher Scientific 27805 for neutralizing EMS
Sodium hypochlorite Merck Life Sciences 1.93607.5021 sterlization solution
Sodium thiosulfate Fisher Scientific 28005 for seed washing in step 1.6
soilrite Lab Chem India for plant growth
Square pots Lab Chem India for plant growth
Sucrose Sigma Aldrich S0389 plant growth
Taxim Alkem 7180720 for seedling rescue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22, (3), 541-563 (2010).
  2. Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111, (6), 1021-1058 (2013).
  3. Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207, (4), 996-1004 (2015).
  4. Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6, (2), 444-455 (2013).
  5. White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
  6. Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14, (1), 162 (2014).
  7. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
  8. Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68, (1), 100-113 (2011).
  9. Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204, (4), 733-735 (2014).
  10. Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
  11. McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
  12. Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126, (2), 480-484 (2001).
  13. Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Oxford University Press. 1-10 (2002).
  14. Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3, (2), 124-136 (2002).
  15. Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352, (6335), 524-526 (1991).
  16. Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
  17. Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207, (4), 566-574 (1999).
  18. Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
  19. Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5, (1), 115-130 (2012).
  20. Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135, (3), 1471-1479 (2004).
  21. Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1, (4), 617-635 (2016).
  22. Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
  23. Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
  24. Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. 362 (2007).
  25. Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
  26. Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
  27. Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30, (6), 413-421 (2001).
  28. Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4, (1), 105-118 (2002).
  29. Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63, (4), 1751-1761 (2012).
  30. Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
  31. Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177, (1), 38-51 (2018).
  32. Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221, (2), 866-880 (2019).
  33. Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343, (6168), 290-294 (2014).
  34. Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514, (7522), 367-371 (2014).
  35. Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16, (4), 426-433 (2015).
  36. Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176, (3), 2496-2514 (2018).
  37. Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mittal, D., Mishra, S., Prajapati, R., Vadassery, J. Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling. J. Vis. Exp. (162), e61259, doi:10.3791/61259 (2020).More

Mittal, D., Mishra, S., Prajapati, R., Vadassery, J. Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling. J. Vis. Exp. (162), e61259, doi:10.3791/61259 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter