Summary

Antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio

Published: August 01, 2020
doi:

Summary

Una pantalla genética hacia adelante basada en la elevación de Ca2+ como lectura conduce a la identificación de los componentes genéticos involucrados en las vías de señalización dependientes del calcio en las plantas.

Abstract

Las pruebas genéticas directas han sido herramientas importantes en la identificación imparcial de los componentes genéticos implicados en varias vías biológicas. La base de la pantalla es generar una población mutante que se puede examinar con un fenotipo de interés. El SME (sulfonato de metano etílico) es un agente alquilante comúnmente utilizado para inducir mutaciones aleatorias en una pantalla genética avanzada clásica para identificar múltiples genes implicados en cualquier proceso dado. La elevación del calcio citosólico (Ca2+)es una vía clave de señalización temprana que se activa tras la percepción del estrés. Sin embargo, la identidad de los receptores, canales, bombas y transportadores de Ca2+ sigue siendo esquiva en muchos sistemas de estudio. Aequorin es una proteína de reportero de calcio celular aislada de Aequorea victoria y expresada stably en Arabidopsis. Aprovechando esto, diseñamos una pantalla genética hacia adelante en la que el SME mutaba la aequorin transgénica. Las semillas de las plantas mutantes fueron recolectadas (M1) y la detección del fenotipo de interés se llevó a cabo en la población segregadora (M2). Usando un protocolo de medición Ca2+ de alto rendimiento de 96 pozos, se pueden identificar varios mutantes novedosos que tienen una respuesta de calcio variable y se miden en tiempo real. Los mutantes con el fenotipo de interés son rescatados y propagados hasta obtener una población de plantas mutantes homocigotas. Este protocolo proporciona un método para las pantallas genéticas directas en los antecedentes de los reporteros de Ca2+ e identificar nuevos objetivos regulados de Ca2+.

Introduction

Un cambio en la concentración de calcio citosólico (Ca2+)tras la percepción del estímulo biótico o abiótico es un evento de señalización temprana bien estudiado que activa muchas vías de señalización1,2,3,4. Una célula en su estado de reposo basal mantiene una menor concentración de Ca2+ en el citosol y secuestra el exceso de Ca2+ en varios orgánulos intracelulares y apoplasto extracelular que conduce a un pendiente de Ca2+ 5,,6. Tras la percepción de la señal, los niveles de Ca2+ aumentan en el citosol debido a una afluencia de Ca2+ de fuentes extracelulares y/o intracelulares y generan una firma de calcio específicade estímulos 7,8,9. Las elevaciones de Ca2+ en el citosol se activan por muchos estímulos, pero la especificidad se mantiene por diferentes almacenes liberando Ca2 +,una firma única de Ca2+ y proteínas de sensor apropiadas10,,11.

El uso de agente alquilante, sulfonato de etílico-metano (EMS) para la mutagénesis es una poderosa herramienta en las pantallas genéticas directas clásicas para identificar múltiples genes independientes implicados en un proceso. EMS es un mutágeno químico que induce predominantemente transiciones de C a T y G a A aleatoriamente en todo el genoma y produce un cambio de 1 bp en cada 125 kb del genoma. La mutagénesis de EMS inducirá cambios de par base única de 1000 euros, ya sea de inserción/eliminación (InDel) o polimorfismo de nucleótido único (SNP) por genoma12. Las mutaciones inducidas por EMS son múltiples mutaciones puntuales con una frecuencia de mutación que oscila entre 1/300 y 1/30000 por locus. Esto reduce el número de plantas M1 necesarias para encontrar una mutación en un gen dado. Un rango de población de semillas M1 de 2000-3000 se utiliza típicamente para obtener mutaciones de interés en Arabidopsis thaliana13,14.

Las transgénicas de aequorin son las plantas ecotipos de Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) que expresan p35S-apoaequorin (pMAQ2) en el citosol15. La aequrina es una proteína de unión a Ca2+ compuesta de apoproteína y un grupo protésico formado por molécula de luciferina, coelenterazina. La unión de Ca2+ a aequorin, que tiene tres sitios DE-manos de unión Ca2+, da como resultado oxidado y ciclado de coelenterazina para dar el dioxetanono intermedio, seguido de un cambio conformacional de la proteína acompañado de la liberación de dióxido de carbono y coelenteramida singlete-excited16. La coelenteramida así producida emite unamaxluz azul (máx., 470 nm) que puede ser detectada por el luminómetro17. Por lo tanto, las elevaciones extremadamente rápidas de Ca2+ se pueden medir en tiempo real y explotarse para detectar pantallas genéticas de avance rápido. Este protocolo tiene como objetivo utilizar la especificidad de la respuesta al calcio para identificar a los nuevos actores clave que participan en la firma Ca2+. Para lograr esta tarea, utilizamos la mutagénesis ems en la aequorin transgénica e identificamos los SNP asociados con la señalización alterada de Ca2+. El protocolo identifica mutantes que no muestran elevaciones de Ca2+ o reducidas tras la adición de estímulos. Estos mutantes pueden ser mapeados para identificar los genes responsables de la respuesta de Ca2+. El método es aplicable a cualquier tipo de estímulo líquido en las plantas que resulta en una elevación de Ca2+. Dado que la elevación de Ca2+ es una de las primeras respuestas en la vía de señalización de defensa vegetal, la identificación de los componentes de respuesta aguas arriba puede proporcionar candidatos para la ingeniería genética para desarrollar plantas resistentes.

Protocol

1. Mutagénesis de EMS y colección de semillas única basadas en pedigrí (1-3 meses) Pesar 150 mg de semillas (7500) de aequorin para EMS mutagénesis (semillas M0). Pesar otros 150 mg de semillas para ser utilizadas como control. Transfiera las semillas a un tubo de 50 ml y añada 25 ml de 0,2% emS (v/v) (CAUTION) (para tratamiento) o 25 ml de agua autoclavada (para control).NOTA: El sulfonato de etil-metano es un agente químico para mutagenizar el material vegetal. Selle …

Representative Results

La población de EMS se hizo un anzado paralaelevación de Ca 2+ inducida por H 2 O2. 2+ Como se discutió anteriormente, 12 plántulas M2 individuales fueron examinadas desde cada línea M1. En la Figura 3,una de esas líneas M1 se traza con cada panel mostrando 12 plántulas M2 individuales. Una aequorin de tipo salvaje se utiliza como control para comparar y evaluar la respuesta mutante. Un mutante recesivo se se…

Discussion

La mutagénesis del SME es una poderosa herramienta para generar mutaciones en la población. Las pantallas genéticas delanteras clásicas que utilizan EMS han sido una herramienta eficaz para identificar genes nuevos por dos razones principales: en primer lugar, no requieren ninguna suposición previa sobre la identidad génica y, en segundo lugar, no introducen ningún sesgo. Existen varios métodos para generar poblaciones de cribado como EMS, inserciones de ADN-T, radiaciones, etc. De todos los métodos, la mutagén…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Instituto Nacional de Investigación del Genoma Vegetal – Phytotron Facility por el crecimiento de las plantas, Bombay Locale por la sesión de vídeo y el Departamento de Biotecnología- Consorcio eLibrary por proporcionar acceso a los recursos electrónicos. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Biotecnología de la India a través del National Institute of Plant Genome Research Core Grant, programa Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; y la Beca de Investigación CSIR-Junior (a D.M y S.M) y al Departamento de Biotecnología-Beca de Investigación Junior (a R.P).

Materials

24 well tissue culture plate Jetbiofil 11024 for growing seedlings
96 well white cliniplate Thermo Scientific 9502887 for luminometer measurements
Aequorin
Agropet Lab Chem India for plant growth
Calcium chloride Fisher Scientific 12135 for discharge solution
Coelenterazine PJK 55779-48-1 prosthetic group for aequorin
Ehtylmethane sulfonate Sigma Aldrich M0880-5G for seed mutagenesis
Ethanol Analytical reagent 1170 for discharge solution
Hydrochloric acid Merck Life Sciences 1.93001.0521 sterlization solution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific 15465 as stimulus for Calcium elevation
Luminoskan ascent Thermo Scientific 5300172 aequorin luminescence measurement
MES buffer Himedia RM1128-100G plant growth
Murashige and skoog media Himedia PT021-25L plant growth
Sodium hydroxide Fisher Scientific 27805 for neutralizing EMS
Sodium hypochlorite Merck Life Sciences 1.93607.5021 sterlization solution
Sodium thiosulfate Fisher Scientific 28005 for seed washing in step 1.6
soilrite Lab Chem India for plant growth
Square pots Lab Chem India for plant growth
Sucrose Sigma Aldrich S0389 plant growth
Taxim Alkem 7180720 for seedling rescue

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Mittal, D., Mishra, S., Prajapati, R., Vadassery, J. Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling. J. Vis. Exp. (162), e61259, doi:10.3791/61259 (2020).

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