Antaño de la pantalla genética utilizando la aequorin de la reportera transgénica de calcio para identificar nuevas metas en la señalización del calcio
Summary
Una pantalla genética hacia adelante basada en la elevación de Ca2+ como lectura conduce a la identificación de los componentes genéticos involucrados en las vías de señalización dependientes del calcio en las plantas.
Abstract
Las pruebas genéticas directas han sido herramientas importantes en la identificación imparcial de los componentes genéticos implicados en varias vías biológicas. La base de la pantalla es generar una población mutante que se puede examinar con un fenotipo de interés. El SME (sulfonato de metano etílico) es un agente alquilante comúnmente utilizado para inducir mutaciones aleatorias en una pantalla genética avanzada clásica para identificar múltiples genes implicados en cualquier proceso dado. La elevación del calcio citosólico (Ca2+)es una vía clave de señalización temprana que se activa tras la percepción del estrés. Sin embargo, la identidad de los receptores, canales, bombas y transportadores de Ca2+ sigue siendo esquiva en muchos sistemas de estudio. Aequorin es una proteína de reportero de calcio celular aislada de Aequorea victoria y expresada stably en Arabidopsis. Aprovechando esto, diseñamos una pantalla genética hacia adelante en la que el SME mutaba la aequorin transgénica. Las semillas de las plantas mutantes fueron recolectadas (M1) y la detección del fenotipo de interés se llevó a cabo en la población segregadora (M2). Usando un protocolo de medición Ca2+ de alto rendimiento de 96 pozos, se pueden identificar varios mutantes novedosos que tienen una respuesta de calcio variable y se miden en tiempo real. Los mutantes con el fenotipo de interés son rescatados y propagados hasta obtener una población de plantas mutantes homocigotas. Este protocolo proporciona un método para las pantallas genéticas directas en los antecedentes de los reporteros de Ca2+ e identificar nuevos objetivos regulados de Ca2+.
Introduction
Un cambio en la concentración de calcio citosólico (Ca2+)tras la percepción del estímulo biótico o abiótico es un evento de señalización temprana bien estudiado que activa muchas vías de señalización1,2,3,4. Una célula en su estado de reposo basal mantiene una menor concentración de Ca2+ en el citosol y secuestra el exceso de Ca2+ en varios orgánulos intracelulares y apoplasto extracelular que conduce a un pendiente de Ca2+ 5,,6. Tras la percepción de la señal, los niveles de Ca2+ aumentan en el citosol debido a una afluencia de Ca2+ de fuentes extracelulares y/o intracelulares y generan una firma de calcio específicade estímulos 7,8,9. Las elevaciones de Ca2+ en el citosol se activan por muchos estímulos, pero la especificidad se mantiene por diferentes almacenes liberando Ca2 +,una firma única de Ca2+ y proteínas de sensor apropiadas10,,11.
El uso de agente alquilante, sulfonato de etílico-metano (EMS) para la mutagénesis es una poderosa herramienta en las pantallas genéticas directas clásicas para identificar múltiples genes independientes implicados en un proceso. EMS es un mutágeno químico que induce predominantemente transiciones de C a T y G a A aleatoriamente en todo el genoma y produce un cambio de 1 bp en cada 125 kb del genoma. La mutagénesis de EMS inducirá cambios de par base única de 1000 euros, ya sea de inserción/eliminación (InDel) o polimorfismo de nucleótido único (SNP) por genoma12. Las mutaciones inducidas por EMS son múltiples mutaciones puntuales con una frecuencia de mutación que oscila entre 1/300 y 1/30000 por locus. Esto reduce el número de plantas M1 necesarias para encontrar una mutación en un gen dado. Un rango de población de semillas M1 de 2000-3000 se utiliza típicamente para obtener mutaciones de interés en Arabidopsis thaliana13,14.
Las transgénicas de aequorin son las plantas ecotipos de Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) que expresan p35S-apoaequorin (pMAQ2) en el citosol15. La aequrina es una proteína de unión a Ca2+ compuesta de apoproteína y un grupo protésico formado por molécula de luciferina, coelenterazina. La unión de Ca2+ a aequorin, que tiene tres sitios DE-manos de unión Ca2+, da como resultado oxidado y ciclado de coelenterazina para dar el dioxetanono intermedio, seguido de un cambio conformacional de la proteína acompañado de la liberación de dióxido de carbono y coelenteramida singlete-excited16. La coelenteramida así producida emite unamaxluz azul (máx., 470 nm) que puede ser detectada por el luminómetro17. Por lo tanto, las elevaciones extremadamente rápidas de Ca2+ se pueden medir en tiempo real y explotarse para detectar pantallas genéticas de avance rápido. Este protocolo tiene como objetivo utilizar la especificidad de la respuesta al calcio para identificar a los nuevos actores clave que participan en la firma Ca2+. Para lograr esta tarea, utilizamos la mutagénesis ems en la aequorin transgénica e identificamos los SNP asociados con la señalización alterada de Ca2+. El protocolo identifica mutantes que no muestran elevaciones de Ca2+ o reducidas tras la adición de estímulos. Estos mutantes pueden ser mapeados para identificar los genes responsables de la respuesta de Ca2+. El método es aplicable a cualquier tipo de estímulo líquido en las plantas que resulta en una elevación de Ca2+. Dado que la elevación de Ca2+ es una de las primeras respuestas en la vía de señalización de defensa vegetal, la identificación de los componentes de respuesta aguas arriba puede proporcionar candidatos para la ingeniería genética para desarrollar plantas resistentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mutagénesis del SME es una poderosa herramienta para generar mutaciones en la población. Las pantallas genéticas delanteras clásicas que utilizan EMS han sido una herramienta eficaz para identificar genes nuevos por dos razones principales: en primer lugar, no requieren ninguna suposición previa sobre la identidad génica y, en segundo lugar, no introducen ningún sesgo. Existen varios métodos para generar poblaciones de cribado como EMS, inserciones de ADN-T, radiaciones, etc. De todos los métodos, la mutagén…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Instituto Nacional de Investigación del Genoma Vegetal – Phytotron Facility por el crecimiento de las plantas, Bombay Locale por la sesión de vídeo y el Departamento de Biotecnología- Consorcio eLibrary por proporcionar acceso a los recursos electrónicos. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Biotecnología de la India a través del National Institute of Plant Genome Research Core Grant, programa Max Planck Gesellschaft-India Partner Group; y la Beca de Investigación CSIR-Junior (a D.M y S.M) y al Departamento de Biotecnología-Beca de Investigación Junior (a R.P).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
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