Framåt genetisk skärm med transgenkalcerande kalcium reporter Aequorin att identifiera nya mål i kalcium signalering
Summary
En främre genetisk skärm baserad på Ca2 + höjd som en avläsning leder till identifiering av genetiska komponenter som deltar i kalciumberoende signalering vägar i växter.
Abstract
Framåtgenetiska skärmar har varit viktiga verktyg för opartisk identifiering av genetiska komponenter som är involverade i flera biologiska vägar. Grunden för skärmen är att generera en mutant population som kan screenas med en fenotyp av intresse. EMS (etylmetaulfonat) är ett vanligt alkylerande medel för att inducera slumpmässig mutation i en klassisk framåt genetisk skärm för att identifiera flera gener som deltar i en viss process. Cytosoliskt kalcium (Ca2 +) höjd är en viktig tidig signalering väg som aktiveras vid stress perception. Men identiteten på receptorer, kanaler, pumpar och transportörer av Ca2 + är fortfarande svårfångade i många studiesystem. Aequorin är en cellulär kalcium reporter protein isolerat från Aequorea victoria och stabilt uttryckt i Arabidopsis. Utnyttja detta, utformade vi en framåt genetisk skärm där vi EMS-mutagenized aequorin transgena. Fröna från de muterade växterna samlades in (M1) och screening för fenotyp av intresse utfördes i segregerande (M2)befolkningen. Med hjälp av ett 96-väl hög genomströmningsprotokoll ca2 + mätprotokoll kan flera nya mutanter identifieras som har en varierande kalciumrespons och mäts i realtid. Mutanterna med fenotyp av intresse räddas och förökas tills en homozygous mutant växtpopulation erhålls. Detta protokoll ger en metod för framåt genetiska skärmar i Ca2 + reporter bakgrund och identifiera nya Ca2 + reglerade mål.
Introduction
En förändring i cytosoliskt kalcium (Ca2 +) koncentration vid uppfattning av biotiska eller abiotiska stimulans är en väl studerad tidig signalering händelse som aktiverar många signalering vägar1,2,3,4. En cell i sitt basala vilotillstånd upprätthåller en lägre Ca2 + koncentration i cytosol och bindare överskott Ca2 + i olika intracellulära organeller och extracellulära apoplast leder till en brant Ca2 + lutning5,6. Vid signaluppfattning, Ca2 + nivåer ökning av cytosol på grund av ett inflöde av Ca2 + från extracellulära och / eller intracellulära källor och generera en stimuli specifik kalcium signatur7,8,9. Ca2 + höjder i cytosolen aktiveras av många stimuli, men specificitet upprätthålls av distinkta butiker släppa Ca2 +, en unik Ca2 + signatur och lämpliga sensorproteiner10,11.
Användning av alkylerande medel, etyl-metansulfonat (EMS) för mutagenesis är ett kraftfullt verktyg i klassisk framåt genetiska skärmar för att identifiera flera oberoende gener som deltar i en process. EMS är en kemisk mutagen huvudsakligen inducera C till T och G till A övergångar slumpmässigt genomet och producerar en 1 bp förändring i varje 125 kb av arvsmassan. EMS mutagenesis kommer att inducera ≈1000 enda baspar förändringar, antingen insättning / borttagningar (InDel) eller enda nukleotid polymorfism (SNP) per genom12. EMS-inducerad mutationer är flera punkt mutationer med en mutation frekvens som sträcker sig från 1/300 till 1/30000 per locus. Detta minskar antalet M1 växter som behövs för att hitta en mutation i en viss gen. En M1 utsäde befolkningsintervall på 2000-3000 används vanligtvis för att få mutationer av intresse i Arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin transgena är Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ekotyp växter uttrycker p35S-apoaequorin (pMAQ2) i cytosol15. Aequorin är ett Ca2+ bindande protein bestående av apoprotein och en protesgrupp bestående av luciferinmolekyl, coelenterazine. Bindningen av Ca2 + till aequorin, som har tre Ca2 + bindande EF-händer platser, resulterar i coelenterazine oxideras och cyklas för att ge dioxetanon mellanliggande, följt av en konformationell förändring av proteinet tillsammans med utsläpp av koldioxid och singlet-upphetsad coelenteramide16. Den coelenteramid som produceras på detta sätt avger ett blått ljus (λmax, 470 nm) som kan detekteras av luminometern17. Den extremt snabba Ca2 + höjder kan därmed mätas i realtid, och utnyttjas för snabb framåt genetiska skärmar. Detta protokoll syftar till att använda specificiteten av kalcium svar för att identifiera nya nyckelaktörer som är inblandade i Ca2 + signatur. För att uppnå denna uppgift använder vi EMS mutagenesis i transgena aequorin och identifiera SNPs i samband med förändrad Ca2 + signalering. Protokollet identifierar mutanter som inte visar några eller minskade Ca2 + höjder vid stimuli tillägg. Dessa mutanter kan sedan kartläggas för att identifiera de gener som är ansvariga för Ca2+ svaret. Metoden är tillämplig på alla typer av flytande stimuli i växter som resulterar i en Ca2 + höjd. Eftersom Ca2 + höjd är en av de första svaren i anläggningen försvar signalering väg, identifiering av uppströms responskomponenter kan ge kandidater för genteknik för att utveckla motståndskraftiga växter.
Protocol
Representative Results
Discussion
EMS mutagenesis är ett kraftfullt verktyg för att generera mutationer i befolkningen. De klassiska genetiska skärmarna med EMS har varit ett effektivt verktyg för att identifiera nya gener av två viktiga skäl: för det första kräver de inga tidigare antaganden om genidentitet och för det andra inför de inga fördomar. Det finns flera metoder för att generera en screening populationer som EMS, T-DNA infogningar, strålning etc. Av alla metoder har EMS-baserad mutagenesis få fördelar jämfört med de andra met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar National Institute of Plant Genome Research – Phytotron Facility för växttillväxt, Bombay Locale för videoinspelning, och Institutionen för bioteknik- eLibrary Consortium för att ge tillgång till e-resurser. Detta arbete stöddes av Institutionen för bioteknik, Indien genom National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; och CSIR-Junior Research Fellowship (till D.M och S.M) och Institutionen för bioteknik-Junior Research Fellowship (till R.P).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M., Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. , 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G., Running, M. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G., Rosato, E. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G., Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J., Flanders, D., Dean, C. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). , 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
