Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

منصة تقنية مفتوحة المصدر لتصنيع نماذج ثقافة 3D القائمة على الهيدروجيل بطريقة آلية وموحدة

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/61261
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1,3,4,5, 1,2, 1,2,3,4,6
1Centre in Regenerative Medicine, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 2School of Mechanical, Medical and Process Engineering, Science and Engineering Faculty, Queensland University of Technology, 3School of Biomedical Sciences, Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Australian Prostate Cancer Research Centre, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 5Translational Research Institute, Queensland University of Technology, 6ARC ITTC in Additive Biomanufacturing, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology

Summary

يعمل هذا البروتوكول كبرنامج تعليمي شامل للخلط الموحد والقابل للتكرار للمواد اللزجة مع تقنية أتمتة مفتوحة المصدر جديدة. وتقدم تعليمات مفصلة بشأن تشغيل محطة عمل مفتوحة المصدر مطورة حديثا، واستخدام مصمم بروتوكول مفتوح المصدر، والتحقق من الصحة والتحقق لتحديد المخاليط القابلة للاستنساخ.

Abstract

تعتمد خطوات الخلط الحالية للمواد اللزجة على المهام المتكررة والمستهلكة للوقت والتي يتم تنفيذها يدويا بشكل أساسي في وضع الإنتاجية المنخفضة. تمثل هذه المشكلات عيوبا في سير العمل يمكن أن تؤدي في النهاية إلى عدم إمكانية تكرار نتائج البحوث. كما أن سير العمل اليدوي يزيد من الحد من تقدم المواد اللزجة واعتمادها على نطاق واسع، مثل المواد الهلامية المائية المستخدمة في التطبيقات الطبية الحيوية. يمكن التغلب على هذه التحديات باستخدام سير العمل الآلي مع عمليات خلط موحدة لزيادة قابلية التكرار. في هذه الدراسة ، نقدم إرشادات خطوة بخطوة لاستخدام مصمم بروتوكول مفتوح المصدر ، لتشغيل محطة عمل مفتوحة المصدر ، وتحديد المخاليط القابلة للتكرار. على وجه التحديد ، يقوم مصمم البروتوكول مفتوح المصدر بتوجيه المستخدم خلال اختيار المعلمة التجريبية وإنشاء رمز بروتوكول جاهز للاستخدام لتشغيل محطة العمل. تم تحسين محطة العمل هذه لسحب المواد اللزجة لتمكين المعالجة الآلية والموثوقة للغاية من خلال دمج أرصفة درجة الحرارة للمواد المستجيبة للحرارة ، وماصات الإزاحة الإيجابية للمواد اللزجة ، وقاعدة لمس طرف اختيارية لإزالة المواد الزائدة من طرف الماصة. يتم التحقق من صحة المخاليط والتحقق منها عن طريق قياس امتصاص سريع وغير مكلف ل Orange G. يقدم هذا البروتوكول نتائج للحصول على 80٪ (v / v) مخاليط الجلسرين ، وسلسلة تخفيف للجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA) ، وهيدروجيل الشبكة المزدوجة من 5٪ (w / v) GelMA و 2٪ (w / v) alginate. يتم تضمين دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها لدعم المستخدمين في اعتماد البروتوكول. يمكن تطبيق سير العمل الموصوف على نطاق واسع على عدد من المواد اللزجة لإنشاء تركيزات محددة من قبل المستخدم بطريقة آلية.

Introduction

تعتبر قابلية التكرار والتكرار ذات أهمية قصوى في العمل العلمي1،2،3،4. ومع ذلك، فقد سلطت الأدلة الحديثة الضوء على تحديات كبيرة في تكرار الدراسات الطبية الحيوية عالية التأثير في العلوم الأساسية وكذلك البحوث الانتقالية4،5،6،7. العوامل التي تسهم في نتائج غير قابلة للتكرار معقدة ومتعددة ، مثل تصميم الدراسة الضعيف أو المنحاز 6,8 ، أو القوة الإحصائية غير الكافية3,9 ، أو عدم الامتثال لمعايير الإبلاغ 7,10,11 ، أو الضغط للنشر6 ، أو الطرق أو التعليمات البرمجية البرمجية غير المتاحة6,9 . ومن بينها، تم تحديد التغييرات الطفيفة في البروتوكول والأخطاء البشرية في تنفيذ التجارب كعناصر أخرى تمثل عدم قابلية الاستنساخ4. على سبيل المثال، تؤدي مهام السحب اليدوي إلى عدم الدقة داخل الأفراد وفيما بينهم12،13 وتزيد من احتمال وقوع أخطاء بشرية14. في حين أن روبوتات مناولة السوائل التجارية قادرة على التغلب على هذه العيوب وأظهرت موثوقية متزايدة للسوائل15،16،17 ، فإن المعالجة الآلية للمواد ذات الخصائص اللزجة الكبيرة لا تزال تمثل تحديا.

تستخدم روبوتات مناولة السوائل التجارية عادة ماصات وسادة الهواء ، والمعروفة أيضا باسم مكبس الهواء أو ماصات إزاحة الهواء. يتم فصل الكاشف والمكبس بواسطة وسادة هوائية تتقلص أثناء خطوات الاستغناء وتتوسع أثناء خطوات الشفط. باستخدام ماصات وسادة الهواء ، فإن المواد اللزجة "تتدفق" ببطء فقط داخل وخارج الطرف ، وقد يؤدي السحب المبكر للماصة من الخزان إلى شفط فقاعات الهواء. أثناء مهام التوزيع ، تترك المادة اللزجة فيلما على جدار الطرف الداخلي الذي "يتدفق" ببطء فقط أو لا يتدفق على الإطلاق عندما يتم إجباره على الهواء. للتغلب على هذه المشكلات ، تم إدخال ماصات الإزاحة الإيجابية تجاريا لبثق المواد اللزجة بنشاط من الطرف باستخدام مكبس صلب. على الرغم من أن ماصات الإزاحة الإيجابية هذه تمكن من التعامل الدقيق والموثوق به مع المواد اللزجة، إلا أن الحلول الآلية مع ماصات الإزاحة الإيجابية لا تزال مكلفة للغاية بالنسبة لإعدادات المختبرات الأكاديمية، وبالتالي، فإن معظم مهام سير العمل التي تحتوي على مواد لزجة تعتمد فقط على مهام السحب اليدوي18.

بشكل عام ، يتم تعريف اللزوجة على أنها مقاومة السائل للتدفق ، ويتم تعريف المواد اللزجة أيضا على أنها مواد ذات لزوجة أكبر للماء (0.89 mPa·s s عند 25 درجة مئوية). في مجال التطبيقات الطبية الحيوية ، غالبا ما تحتوي الإعدادات التجريبية على مواد متعددة ذات لزوجة أكبر من الماء ، مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO ؛ 1.99 mPa ·s عند 25 درجة مئوية) ، الجلسرين (208.1 mPa ·s عند 25 درجة مئوية ل 90٪ الجلسرين [v / v]) ، Triton X-100 (240 mPa ·s عند 25 درجة مئوية) ، والبوليمرات المتورمة بالماء ، ويشار إليها باسم hydrogels19 ، 20. الهلاميات المائية هي شبكات بوليمر محبة للماء مرتبة في وضع فيزيائي و / أو كيميائي يستخدم لتطبيقات مختلفة ، بما في ذلك تغليف الخلايا ، وتوصيل الأدوية ، والمحركات اللينة 19،20،21،22. تعتمد لزوجة الهلاميات المائية على تركيز البوليمر والوزن الجزيئي19. تظهر الهلاميات المائية المستخدمة بشكل روتيني للتطبيقات الطبية الحيوية قيم لزوجة تتراوح بين 1 و 1000 mPa ·s ، في حين تم الإبلاغ عن أنظمة هيدروجيل محددة بقيم تصل إلى 6 × 107 mPa ·s19,23,24. ومع ذلك ، فإن قياسات اللزوجة للهيدروجيل غير موحدة من حيث بروتوكول القياس وإعداد العينات ، وبالتالي ، يصعب مقارنة قيم اللزوجة بين الدراسات المختلفة.

نظرا لأن الحلول الآلية المتاحة تجاريا والمصممة خصيصا للهيدروجيل إما مفقودة أو مكلفة للغاية، فإن سير العمل الحالي للهيدروجيل يعتمد على المناولة اليدوية18. لفهم القيود المفروضة على سير العمل الحالي القائم على الدليل لسحب المواد الهلامية المائية، من المهم فهم مهام المناولة الأساسية18. على سبيل المثال ، بمجرد تصنيع مادة هيدروجيل جديدة ، يتم إنشاء تركيز مرغوب فيه أو سلسلة تخفيف بتركيزات متفاوتة لتحديد بروتوكولات التوليف الموثوقة وخصائص الربط مع التحليل اللاحق للخصائص الميكانيكية 25،26،27،28 . بشكل عام ، يتم تحضير محلول المخزون أو شرائه ، ثم يتم خلطه لاحقا مع كاشف مخفف و / أو كواشف أخرى للحصول على خليط. لا يتم تنفيذ مهام الخلط في الغالب مباشرة في لوحة بئر (أو أي تنسيق إخراج) ، ويتم تنفيذها بدلا من ذلك في أنبوب تفاعل منفصل ، والذي يشار إليه عادة باسم المزيج الرئيسي. خلال مهام التحضير هذه ، هناك حاجة إلى خطوات مختلفة للشفط والتوزيع لنقل المادة (المواد) اللزجة ، وخلط الكواشف ، ونقل الخليط إلى شكل إخراج (على سبيل المثال ، لوحة بئر 96). تتطلب هذه المهام قدرا كبيرا من العمل البشري18 ، وساعات تجريبية طويلة ، وتزيد من احتمال حدوث أخطاء بشرية يمكن أن تظهر كنتائج غير دقيقة. علاوة على ذلك ، تمنع المعالجة اليدوية الإعداد الفعال لأرقام العينات العالية لفحص مجموعات المعلمات المختلفة للتوصيف التفصيلي. كما تعيق المعالجة اليدوية استخدام المواد الهلامية المائية في تطبيقات الفحص عالية الإنتاجية، مثل تحديد المركبات الواعدة أثناء تطوير الأدوية. خطوات التحضير الحالية القائمة على الأدلة غير مجدية لفحص مكتبات الأدوية التي تتكون من آلاف الأدوية. لهذه الأسباب، هناك حاجة إلى حلول آلية لتوفير عملية تطوير فعالة وتمكين الترجمة الناجحة للهيدروجيل لتطبيقات فحص الأدوية.

للانتقال من سير العمل اليدوي إلى العمليات الآلية، قمنا بتحسين روبوت سحب تجاري مفتوح المصدر للتعامل مع المواد اللزجة من خلال دمج أرصفة درجة الحرارة للمواد المستجيبة للحرارة، واستخدام ماصات الإزاحة الإيجابية الجاهزة باستخدام أطراف المكبس الشعرية، ورصيف اختياري يعمل باللمس لتنظيف طرف الماصة. تم دمج روبوت السحب هذا كوحدة سحب في محطة عمل مفتوحة المصدر تم تطويرها حديثا ، والتي تتكون من وحدات جاهزة للتثبيت وقابلة للتخصيص 18,29. يمكن الوصول بحرية إلى تعليمات التجميع التفصيلية لمحطة العمل المطورة بما في ذلك ملفات الأجهزة والبرامج من GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) ومستودع Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). بالإضافة إلى تطوير الأجهزة ، تمت برمجة تطبيق تصميم بروتوكول مفتوح المصدر وإصداره لتوجيه المستخدم خلال عملية اختيار المعلمة وإنشاء رمز بروتوكول جاهز للاستخدام (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). يعمل هذا الرمز على روبوت السحب التجاري مفتوح المصدر وكذلك على محطة العمل مفتوحة المصدر المطورة.

هنا ، يتم توفير برنامج تعليمي شامل حول تشغيل محطة العمل مفتوحة المصدر لأتمتة مهام الخلط للمواد اللزجة (الشكل 1). يمكن تنفيذ خطوات البروتوكول الخاصة بالبرنامج التعليمي باستخدام محطة العمل مفتوحة المصدر المطورة بالإضافة إلى روبوت السحب التجاري مفتوح المصدر. بدعم من تطبيق تصميم بروتوكول مفتوح المصدر تم تطويره داخليا ، يتم عرض الخلط الآلي وإعداد التركيزات المطلوبة للجليسرين والجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA) والجينات. تم اختيار الجلسرين في هذا البرنامج التعليمي ، نظرا لأنه يتميز بشكل جيد30,31 ، فهو غير مكلف ومتاح بسهولة ، وبالتالي ، فإنه يستخدم عادة كمادة مرجعية لزجة لمهام السحب الآلية. وكأمثلة على المواد الهلامية المائية المستخدمة في التطبيقات الطبية الحيوية، تم تطبيق حلول سلائف هيدروجيل GelMA و alginate لتجارب الخلط الآلية. يقدم GelMA أحد أكثر الهلاميات المائية استخداما لدراسات تغليف الخلايا32,33 ، وتم اختيار الجينات في هذه الدراسة لإثبات القدرة على تصنيع هيدروجيلات الشبكة المزدوجة 34,35. باستخدام Orange G كصبغة ، تم تنفيذ إجراء سريع وغير مكلف للتحقق من صحة نتائج الخلط والتحقق منها باستخدام مقياس الطيف الضوئي16.

تم دمج روبوت سحب تجاري مفتوح المصدر كوحدة سحب في محطة العمل مفتوحة المصدر المطورة (الشكل 2 أ) ، وبالتالي ، يتم استخدام اسم "وحدة السحب" بشكل أكبر لوصف روبوت السحب. إن وصفا مفصلا للأجهزة المثبتة خارج نطاق هذا البروتوكول وهو متاح عبر المستودعات المقدمة والتي تتضمن أيضا إرشادات خطوة بخطوة للجمعية العامة للنظام الأساسي مفتوح المصدر. يمكن تجهيز وحدة السحب بماصتين (ماصة أحادية أو 8 قنوات) مثبتة على المحور A (يمين) والمحور B (يسار) (الشكل 2b). توفر وحدة السحب سعة 10 طوابق وفقا لمعايير المعهد الوطني الأمريكي للمعايير / جمعية أتمتة المختبرات وفحصها (ANSI / SLAS) ، ويتم تحديد مواقع الموقع التالية على سطح السفينة: A1 و A2 و B1 و B2 و C1 و C2 و D1 و D2 و E1 و E2 (الشكل 2 ج). لبدء البلمرة المستحثة بالضوء لحلول الهيدروجيل ، يلزم وجود وحدة ربط متقاطع منفصلة وقد تمت إضافتها إلى محطة العمل. تم تجهيز وحدة الوصلة المتقاطعة بمصابيح LED بطول موجي يبلغ 400 نانومتر ، وبالتالي ، يمكن استخدام المواد التي تثير بطول موجي للضوء المرئي مع الأنظمة الحالية ، مثل ليثيوم فينيل-2،4،6 ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP) 36،37. يمكن للمستخدم معالجة شدة (بالميجاوات / سم 2) لمصابيح LED في تطبيق تصميم البروتوكول لدراسة سلوك الربط المتبادل38. وتتضمن محطة العمل أيضا وحدة تخزين للتمكين من زيادة دراسات الإنتاجية؛ ومع ذلك ، لا يتم استخدام هذه الوحدة في هذه الدراسة ، وبالتالي ، لا يتم وصفها بشكل أكبر. بشكل عام ، يوصى بتشغيل وحدة السحب في خزانة السلامة البيولوجية لتجنب تلوث العينة. دائرة الطاقة الرئيسية لتشغيل وحدة السحب هي دائرة 12 فولت ، والتي تعتبر تطبيقا منخفض الجهد في معظم البلدان. تعتمد جميع المكونات الكهربائية في صندوق تحكم مخصص يمنع المستخدمين من ملامسة مصدر الخطر الكهربائي.

من خلال اتباع بروتوكولات الخلط الموحدة هذه ، يمكن للباحثين تحقيق مخاليط موثوقة للمواد اللزجة وغير اللزجة بطريقة آلية. يسمح نهج المصدر المفتوح للمستخدمين بتحسين تسلسلات الخلط ومشاركة البروتوكولات المطورة حديثا مع المجتمع. وفي نهاية المطاف، سيسهل هذا النهج فحص مجموعات المعلمات المتعددة للتحقيق في أوجه الاعتماد المتبادل بين العوامل المختلفة، وبالتالي تسريع التطبيق الموثوق به وتطوير المواد اللزجة للتطبيقات الطبية الحيوية.

Protocol

ملاحظة: يبدأ البروتوكول بمقدمة إلى (1) البرنامج و (2) إعداد الأجهزة لتعريف المستخدم بعمليات التثبيت المطلوبة ومحطة العمل. بعد قسم حول (3) إعداد المواد و (4) استخدام تطبيق مصمم البروتوكول ، (5) معايرة وحدة السحب و (6) يتم تسليط الضوء على تنفيذ البروتوكول الآلي بالتفصيل. وأخيرا، يتم وصف (7) إجراءات التحقق والتحقق، بما في ذلك قراءة الاستيعاب وتحليل البيانات. يتم عرض سير عمل بروتوكول عام مع مهام فردية في الشكل 1.

1. إعداد البرنامج

ملاحظة: يتضمن هذا القسم تعليمات مفصلة لتثبيت واجهة برمجة التطبيقات (API) بالإضافة إلى تطبيق مصمم البروتوكول المطلوب ومحطة المعايرة. تتم كتابة الإرشادات التالية لجهاز كمبيوتر أحادي اللوحة Raspberry Pi (RPi) ؛ ومع ذلك ، تم استخدام Windows 8 و 10 و macOS 10.13 + بنجاح مع واجهة برمجة التطبيقات والتطبيقات.

  1. قم بإعداد بيئة الكمبيوتر.
    ملاحظة: كن على دراية بأساسيات Python39 ، وكيفية إعداد واستخدام Raspberry Pi40,41 ، وكيفية الاتصال بالإنترنت42. تركز الخطوات التعليمية التالية على الخطوات الخاصة بالبروتوكول وتتوفر معلومات إضافية حول استخدام Raspberry Pi عبر الإنترنت40.
    1. افتح نافذة طرفية من شريط المهام أو قائمة التطبيقات.
    2. تحديث قائمة حزم النظام:
      sudo apt-get update
    3. ترقية جميع الحزم المثبتة:
      sudo apt-get dist-upgrade
    4. أعد تشغيل Raspberry Pi:
      سودو إعادة التشغيل
    5. تحقق من إصدار بايثون المثبت:
      python3 --- الإصدار
      تأكد من تثبيت Python 3.5 على الأقل ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتثبيت أحدث إصدار43.
    6. تثبيت نقطة بايثون، التي تنشر حزم بايثون مع فهرس حزمة بايثون44:
      sudo apt-get install python3-pip
    7. تثبيت التبعيات:
      نقطة تثبيت numpy
      نقطة تثبيت بايثون تغيير حجم الصورة
      ملاحظة: إذا كنت تستخدم ويندوز، تحتاج إلى تثبيت حزمة ويندوز لعنات عبر: بايثون -م نقطة تثبيت ويندوز لعنات
  2. قم بتثبيت واجهة برمجة التطبيقات (API).
    ملاحظة: توفر واجهة برمجة التطبيقات إطار عمل Python بسيطا مصمما لكتابة البرنامج النصي للبروتوكولات التجريبية وتشغيل محطة العمل. يلزم وجود مواجهتي برمجة التطبيقات التاليتين لتنفيذ التعليمات البرمجية للبروتوكول الذي تم إنشاؤه بنجاح.
    1. تثبيت واجهة برمجة تطبيقات محطة العمل:
      نقطة تثبيت محطة العمل المفتوحة
    2. قم بتثبيت Opentrons API لتشغيل وحدة السحب:
      نقطة تثبيت opentrons == 2.5.2
    3. تحقق مما إذا تم تثبيت واجهة برمجة التطبيقات بنجاح:
      بايثون3
      >>> استيراد محطة عمل مفتوحة
      >>> استيراد opentrons
      ملاحظة: حجم واجهة برمجة التطبيقات وتطبيق تصميم البروتوكول هو 2.2 ميغابايت و 1.2 ميغابايت على التوالي. لم تواجه أي مشكلات أثناء التثبيت عند استخدامها مع مساحة قرص محدودة (200 ميغابايت). ومع ذلك، تعتمد متطلبات مساحة القرص على نظام التشغيل.
  3. حدد دليلا لتنزيل الملف (محطة المعايرة ، تطبيق تصميم البروتوكول ، إلخ).
    ملاحظة: يمكن نسخ الملفات ولصقها في مكان آخر بعد ذلك.
  4. نسخ الملفات من مستودع GitHub:
    جيت استنساخ https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
    ملاحظة: يقوم الأمر "git clone" باستنساخ كافة الملفات ثم حفظها لاحقا في الدليل ، وهو مفتوح في المحطة الطرفية في هذا الوقت. نظرا لأن المستودع يتضمن أيضا ملفات الأجهزة الخاصة بالتجميع ، فلا يلزم المستودع بأكمله لتنفيذ البروتوكولات المقدمة. تتوفر جميع الملفات المطلوبة لتكرار التجارب كملف تكميلي وفي مستودع GitHub ضمن "/examples/publication-JoVE".
  5. افتح المجلد الذي تم تنزيله. إذا تم تنزيل المستودع بأكمله ، فانتقل إلى مجلد "publication-JoVE" عبر
    CD openworkstation/examples/publication-JoVE
    ملاحظة: يتضمن هذا المجلد الملفات المطلوبة لتشغيل محطة العمل واستخدام تطبيق مصمم البروتوكول ومحطة المعايرة.

2. إعداد الأجهزة

  1. ضع محطة العمل في خزانة السلامة البيولوجية لتجنب تلوث العينة.
  2. تثبيت الماصات على محطة العمل.
    1. حدد حجم الماصة استنادا إلى الإعداد التجريبي. بشكل عام ، خذ حجم ماصة أي حجم يتم شفطه في الطرف الأعلى من النطاق. إذا كانت هناك حاجة إلى خلط المهام مع وحدات تخزين أكبر من 1 مل لإعداد معين (على سبيل المثال، شفط/توزيع 2 مل)، فاختر M1000E مع حد أقصى لحجم الشفط/الاستغناء يبلغ 1000 ميكرولتر لتقليل خطوات السحب وتوفير الوقت.
      ملاحظة: تتوفر تعليمات مفصلة عن ماصات إزاحة الهواء عبر الإنترنت45. وحدة السحب المطورة قادرة على دمج ماصات الإزاحة الإيجابية الجاهزة التالية: M10E (1-10 ميكرولتر) ، M25E (3-25 ميكرولتر) ، M50E (20-50 ميكرولتر) ، M100E (10-100 ميكرولتر) ، M250E (50-250 ميكرولتر) ، M1000E (100-1000 ميكرولتر).
    2. استخدم مفتاح M4 Allen لتخفيف البراغي وشدها.
    3. قم بتوصيل لوحين تثبيت الماصة (ألواح الأكريليك الأبيض) بسكة الألومنيوم وشد مسامير M5 بشكل فضفاض.
    4. أدخل الماصة في لوحين تثبيت الماصة وتأكد من أن الذيل المريح للماصة يستقر على الجانب الآخر من لوحة تركيب الأكريليك.
    5. شد البراغي الأربعة لاثنين من لوحات تثبيت ماصة بإحكام.
    6. حرك صواميل التثبيت المربعة ، المرفقة بلوحة تركيب الأكريليك ، في فتحة البثق في المحور z وشد البراغي.
      ملاحظة: اربط الماصة بإحكام لتجنب أي حركة أثناء التشغيل.

3. إعداد المواد

ملاحظة: تستخدم المواد اللزجة (الجلسرين ، GelMA ، alginate) للتجارب المقدمة في هذه الدراسة ، وبالتالي ، فإن الأحجام المعدة ومهام المناولة (على سبيل المثال ، إضافة 5 مل من محلول المخزون في أنابيب تفاعل 5 مل) مخصصة لهذا الإعداد التجريبي.

  1. الجيلاتين ميثاكريلويل (جيلما)
    ملاحظة: إن وظائف GelMA وغسيل الكلى والتجميد ليست نطاق هذه الورقة ، ويتوفر بروتوكول خطوة بخطوة في Loessner et al.33. يبدأ البروتوكول باستخدام GelMA المجفف بالتجميد ، والذي يمكن إعداده داخليا أو شراؤه تجاريا.
    1. احسب الكتلة المطلوبة من GelMA (mGelMA) استنادا إلى تركيز المخزون النهائي المطلوب (cGelMA) والحجم (VGelMA) باستخدام المعادلة:
      mGelMA = cGelMA x VGelMA
      ملاحظة: يعتمد VGelMA على الإعداد التجريبي ويوصى بإعداد مواد زائدة بنسبة 20-30٪. تبدأ البروتوكولات المقدمة ب 5 مل من 20٪ (ث / v) GelMA كحل للمخزون.
    2. قم بوزن الكمية المطلوبة من GelMA المجفف بالتجميد ، وأضفه إلى أنبوب تفاعل 50 مل وأضف الكمية المطلوبة من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    3. امزج GelMA إما عن طريق النقع في المذيب عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو عن طريق التسخين إلى 60 درجة مئوية لمدة 6 ساعات في حمام مائي.
      ملاحظة: يمكن تخزين محاليل GelMA المعقمة محمية من الضوء عند 4 درجات مئوية لمدة ستة أشهر على الأقل.
    4. املأ 5 مل من GelMA في أنابيب تفاعل 5 مل.
  2. البادئ الضوئي: ليثيوم فينيل-2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP)
    ملاحظة: تجنب التعرض الإضافي لضوء الغرفة، لأن LAP حساس للضوء.
    1. احسب الكتلة المطلوبة من LAP (mLAP) استنادا إلى تركيز المخزون النهائي المطلوب (cLAP) والحجم المطلوب (VLAP) باستخدام المعادلة:
      mLAP = cLAP × VLAP
      ملاحظة: يوصى بإعداد محلول مخزون بنسبة 3٪ (ث / v).
    2. قم بوزن الكمية المطلوبة من LAP ، وأضفها إلى أنبوب تفاعل 15 مل وأضف PBS.
    3. لف الأنبوب بورق الألومنيوم لمنع التحلل الناجم عن الصورة.
    4. قم بإذابة LAP عن طريق وضع أنبوب التفاعل في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أو حتى يذوب بالكامل.
    5. املأ 1 مل من محلول مخزون LAP في أنابيب 5 مل.
  3. الجينات
    1. احسب الكمية المطلوبة من الجينات (الملغينات) بناء على تركيز المخزون النهائي المطلوب (الكالجينات) والحجم (فالجينات) باستخدام المعادلة:
      مالجينات = كالجينات × فالجينات
      ملاحظة: يعتمد Valginate على الإعداد التجريبي ويوصى بإعداد مواد زائدة بنسبة 20-30٪. تبدأ البروتوكولات المقدمة ب 5 مل من 4٪ (ث / v) ألجينات كحل للمخزون.
    2. وزن الكتلة المطلوبة من الجينات ، وإضافتها إلى أنابيب تفاعل 50 مل ، وإضافة PBS.
    3. ضع مزيج الجينات في حمام مائي على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
      ملاحظة: سيؤدي استخدام خلاط الدوامة إلى تسريع عملية الذوبان ، ولكنه سيولد أيضا فقاعات هواء. يمكن تخزين الجينات الذائبة عند 4 درجات مئوية لمدة ستة أشهر على الأقل.
    4. املأ 5 مل من الجينات في أنابيب تفاعل 5 مل.
  4. املأ 5 مل من الجلسرين في أنابيب تفاعل 5 مل.
  5. حل أورانج جي
    1. تحضير محلول مخزون 10 ملغم / مل من Orange G في أنبوب تفاعل 50 مل.
      ملاحظة: يعتمد الحجم على عدد التجارب. اعتمادا على النوع المخفف ، قم بإعداد محلول المخزون إما في ماء فائق النقاء أو PBS أو كاشف مخفف مناسب. في التجارب المقدمة ، تم استخدام المياه فائقة النقاء لتخفيف الجلسرين و PBS لتخفيف GelMA و alginate. تم استخدام PBS كمخفف ل GelMA و alginate ، ويمكن تحضيره إما باستخدام أقراص أو شراؤه من الرف.
    2. مزيج لمدة 10 ثانية عن طريق الدوامة.
    3. لف الأنبوب بورق الألومنيوم لمنع التحلل الناجم عن الصورة.
      ملاحظة: يمكن استخدام محلول المخزون بعد 24 ساعة لضمان الذوبان السليم ل Orange G.
    4. قم بتخفيف محلول المخزون إلى محلول عمل 1 ملغم / مل في أنبوب تفاعل 50 مل.
    5. نقل حل العمل إلى قوارير / أنابيب مناسبة للإعداد التجريبي.
      ملاحظة: بالنسبة للتجارب المقدمة ، تم ملء محلول العمل في أنابيب 5 مل. يمكن تخزين مخزون Orange G ومحلول العمل في 4 درجات مئوية واستخدامه في غضون ثلاثة أشهر عند التحضير.
    6. املأ 5 مل من محلول العمل Orange G 1 ملغم / مل في أنابيب تفاعل 5 مل.

4. إنشاء رمز البروتوكول باستخدام تطبيق مصمم البروتوكول

ملاحظة: المعلمات المحددة في الخطوات 4-2-4-7 هي نفسها بالنسبة لجميع التجارب التي أجريت، باستثناء تركيز مخزون المادة وتركيز الناتج النهائي. يتم تلخيص هذه المعلمات في الجدول 1 ، وفي ما يلي ، يتم استخدام المعلمات لإعداد هيدروجيل مزدوج الشبكة مع 5٪ (ث / v) GelMA ، 2٪ (ث / v) ألجينات ، 0.15٪ (ث / v) LP ، و PBS كمخفف.

  1. افتح تطبيق مصمم البروتوكول عن طريق تشغيل "ProtocolDesignApp.html".
    ملاحظة: يقوم التطبيق "ProtocolDesignApp.html" بتوجيه المستخدم خلال عملية تحديد المعلمة ويقوم تلقائيا بإنشاء البروتوكول الجاهز للاستخدام لتشغيل محطة العمل. تعمل واجهة المستخدم على كل متصفح إنترنت شائع الاستخدام (مثل Chrome و Firefox و Safari و edge و Internet Explorer).
  2. أدخل اسم البروتوكول (على سبيل المثال، الهلاميات المائية المزدوجة الشبكة) في صفحة الإعداد.
  3. انقر فوق "متابعة" لتأكيد اسم البروتوكول والمتابعة إلى الخطوة التالية.
  4. حدد درج الإدخال عن طريق تحديد "كتلة تسخين 3x4" من القائمة المنسدلة ومعلمات الإدخال التالية:
    1. حدد "Gel 1" من القائمة المنسدلة ، وأدخل الاسم "GelMA" ، وأدخل تركيز المخزون "20٪" ، واضبط "عدد العينات" على "3" لملء عمود واحد. انقر فوق "+إضافة" لحفظ الإدخالات.
    2. حدد "Gel 2" من القائمة المنسدلة ، وأدخل الاسم: "Alginate" ، وأدخل تركيز المخزون "4٪" ، واضبط "عدد العينات" على "3" لملء عمود واحد. انقر فوق "+إضافة" لحفظ الإدخالات.
    3. حدد "Photoinitiator" من القائمة المنسدلة ، وأدخل الاسم: "LAP" ، وأدخل تركيز المخزون "3٪" ، واضبط "عدد العينات" على "3" لملء عمود واحد. انقر فوق "+إضافة" لحفظ الإدخالات.
    4. حدد "مخفف 1" من القائمة المنسدلة ، وأدخل الاسم: "PBS" ، واضبط "عدد العينات" على "3" لملء عمود واحد. انقر فوق "+إضافة" لحفظ الإدخالات.
      ملاحظة: يتم تحديث مرئيات درج الإدخال تلقائيا، بمجرد النقر فوق "+add". إذا تمت إضافة مدخلات أكثر من سعة الدرج، عرض التحذير الكثير من العينات لهذا الدرج للمستخدم.
  5. حدد معلمات الربط المتقاطع عن طريق التحقق من "الربط المتقاطع للصور" وكتابة الوقت بالثواني ، "30" ، والكثافة W / m2 مع "2".
  6. قم بإنهاء إعداد الإدخال بالنقر فوق "متابعة".
  7. حدد إعداد درج الإخراج عن طريق تحديد "لوحة البئر 96" في القائمة المنسدلة لنوع لوحة البئر.
  8. انقر فوق "Group1" لتحديد المخرجات عن طريق إنشاء مجموعة من العينات.
    1. حدد تكوين المخرجات عن طريق إدخال التركيزات المطلوبة وحجم العينة في الحقول لكل مدخل: GelMA = '5' ، Alginate = '2' ، LAP = '0.15' ، الحجم الإجمالي = '60'.
    2. خانة الاختيار لتطبيق بروتوكول الخلط المتقدم.
  9. حدد عدد العينات عن طريق إدخال عدد العينات في الحقل "عدد العينات": "96".
    ملاحظة: يتم تحديث مرئيات درج العينات تلقائيا، بمجرد النقر فوق "+إضافة مجموعة". إذا تمت إضافة عينات أكثر من سعة الدرج، عرض التحذير عدد كبير جدا من العينات لهذا الدرج للمستخدم.
  10. قم بإنهاء إعداد الإخراج بالنقر فوق "متابعة".
    1. حدد موضع الدرج على تخطيط سطح السفينة وقم بإعداد النظام الأساسي وفقا لذلك:
    2. تحقق من علامة الاختيار في الحقل "SLOT A1" وحدد "Empty_Cell" من القائمة المنسدلة.
    3. تحقق من علامة الاختيار في الحقل "SLOT A2" وحدد "Trash_Cell" من القائمة المنسدلة.
    4. حدد علامة الاختيار في الحقل "SLOT B1" وحدد "Tips_Cell_100 μL" من القائمة المنسدلة.
    5. تحقق من علامة الاختيار في الحقل "SLOT B2" وحدد "Tips_Cell_1000 μL" من القائمة المنسدلة.
    6. تحقق من علامة الاختيار في الحقل "SLOT C1" وحدد "Input_Cell" من القائمة المنسدلة.
    7. حدد علامة الاختيار في الحقل "SLOT C2" وحدد "Empty_Cell" من القائمة المنسدلة.
    8. تحقق من علامة الاختيار في الحقل "SLOT D1" وحدد "Mixing_Cell" من القائمة المنسدلة.
    9. تحقق من علامة الاختيار في الحقل "SLOT D2" وحدد "Output_Cell" من القائمة المنسدلة.
    10. حدد نوع وخصائص الماصة الأولى (M100E) عن طريق التحقق من "ماصة يسار" ، وتحديد "10-100μL إزاحة موجبة" من القائمة المنسدلة وتعيين سرعة الشفط = "600" ، وسرعة التوزيع = "800".
    11. حدد نوع وخصائص الماصة الثانية (M1000E) عن طريق التحقق من "يمين الماصة" ، وتحديد "الإزاحة الإيجابية 100-1000μL" من القائمة المنسدلة وتعيين سرعة الشفط = "800" ، وسرعة التوزيع = "1200".
  11. انقر فوق "إنشاء بروتوكول" لتأكيد الإعداد وإنشاء البرنامج النصي للبروتوكول.
    ملاحظة: يقوم تطبيق مصمم البروتوكول الذي تم تطويره بإنشاء مجلد جديد تلقائيا كلما تم إنشاء بروتوكول جديد. يتم حفظ كافة الملفات المطلوبة لهذه التجربة ولتشغيل محطة العمل في هذا المجلد الذي سمي باسم البروتوكول. يمكن نسخ المجلد إلى أدلة مختلفة دون التسبب في مشاكل.
  12. لا تغلق الواجهة، حيث سيتم استخدامها لتنفيذ البروتوكول (راجع الخطوة 6.6).

5. معايرة وحدة السحب

ملاحظة: يجب معايرة الحاويات (مثل ألواح الآبار ورف الأطراف والقمامة) والماصات (مثل M1000E) في البداية. إذا تم تعديل/تغيير مواضع حاوية و/أو ماصة، فيجب معايرة الموضع الجديد.

  1. انتقل إلى مجلد البروتوكول وافتح محطة المعايرة عن طريق تنفيذ الملف "calibrate.py" في windox الطرفية (راجع الخطوة 1.1.1):
    phython.calibrate.py
    ملاحظة: تقوم واجهة "calibrate.py" بتوجيه المستخدم خلال معايرة إعداد سطح السفينة والماصات. تأكد من أن الملف في نفس المجلد مثل ملف البروتوكول وملفات الوحدة النمطية. يتم إنشاؤه تلقائيا في الخطوة 4.10.
  2. حدد زيادات الحركة لحركة المكبس ، y ، z باستخدام لوحة المفاتيح الرقمية (1−8): "1" ل 0.1 مم ، "2" ل 0.5 مم ، "3" ل 1 مم ، "4" ل 5 مم ، "5" ل 10 ، "6" ل 20 مم ، "7" ل 40 مم ، و "8" ل 80 مم.
  3. معايرة الماصة.
    1. اضغط على اختصار لوحة المفاتيح P لتحديد حجم الماصة.
    2. اضغط على اختصار لوحة المفاتيح V للدخول في وضع معايرة المكبس.
      ملاحظة: يوصى بالبدء بزيادات صغيرة (2 و 5 و 10 مم) للتعرف على حجم الزيادة وحركة رأس الماصة.
    3. معايرة مواضع المكبس التالية لماصة إزاحة موجبة: T–Top = موضع السكون; B-Bottom = يتم دفع المكبس حتى يتم تلبية المقاومة. P-Pick-up = يتم دفع المكبس إلى وضع يمكن فيه توصيل طرف المكبس ؛ E–Eject = يتم دفع المكبس حتى يتم إخراج طرف مرفق. قم بتغيير مواضع المكبس باستخدام السهمين لأعلى ولأسفل على لوحة المفاتيح، واحفظ الموضع النهائي باستخدام S على لوحة المفاتيح.
    4. اترك وضع معايرة مكبس الماصة بالضغط على اختصار لوحة المفاتيح V.
  4. معايرة موضع الحاوية بالنسبة لطرف الماصة.
    1. اضغط على اختصار لوحة المفاتيح P لتحديد نوع الماصة. تأكد من توصيل طرف بالمنصة المحددة.
    2. اضغط على اختصار لوحة المفاتيح C لتحديد نوع الحاوية.
    3. حدد زيادة حركة مناسبة وحرك طرف الماصة إلى المواضع التالية. بالنسبة لألواح الآبار ، قم بالمعايرة إلى موضع البئر "A1" في الأسفل ؛ بالنسبة لحامل الطرف ، قم بالمعايرة إلى الموضع "A1" ؛ بالنسبة إلى المهملات، اختر موضعا (يعرف على أنه نقطة) حيث يمكن إخراج الطرف إلى سلة المهملات.
    4. اضغط على اختصار لوحة المفاتيح S لحفظ الموضع.
    5. كرر الخطوات 5.3.1−5.3.3 لكافة الحاويات المدرجة ضمن "C" لنوع الماصة المحدد.
    6. كرر 5.3.1-5.3.5 لنوع الماصة الثاني.
    7. أغلق البرنامج النصي للمعايرة.

6. تنفيذ البروتوكول مع محطة العمل

ملاحظة: يمكن الوصول إلى ملفات البروتوكول عبر المستودع وتتوفر أيضا كملف تكميلي.

  1. ضع حاوية المهملات ورفوف الأطراف ودرج الإدخال ودرج الخلط والإخراج على سطح السفينة (المحدد في الخطوة 4.3).
  2. معايرة الماصات والأدوات على النحو المحدد في القسم 5.
  3. إذا لزم الأمر، قم بتشغيل قاعدة درجة الحرارة وحدد درجة الحرارة لدرج الإدخال والخلط.
    ملاحظة: أجريت التجارب في هذا البرنامج التعليمي دون التحكم في درجة الحرارة وعند 40 درجة مئوية للجليسرين، و 37 درجة مئوية ل GelMA وسحب الجينات.
  4. ضع الأنابيب مع كواشف الإدخال في كتل الألومنيوم على أرصفة درجة الحرارة وفقا للإعداد المحدد.
  5. انتظر حتى تصل كواشف الإدخال إلى درجة الحرارة المطلوبة.
    ملاحظة: لضمان التوزيع السليم لدرجة الحرارة ، يوصى بوقت حضانة لمدة 30 دقيقة ل GelMA و alginate.
  6. قم بتنفيذ ملف البروتوكول بالنقر فوق "تشغيل برنامج PYTHON النصي"
    ملاحظة: يتم الآن تنفيذ البروتوكول المحدد بواسطة محطة العمل. يسلط الفيديو المصاحب الضوء على الخلط الآلي ل GelMA وتوزيع 60 ميكرولتر في لوحة بئر 96.
  7. يكتمل التشغيل ، عند عرض "انتهى".

7. عملية التحقق والتحقق

  1. قم بإزالة صفيحة البئر من محطة العمل وانقل صفيحة البئر مع العينات إلى مقياس الطيف الضوئي.
  2. قراءة الامتصاص باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 450 نانومتر. اقرأ كل لوحة 2x لمقارنة النتائج وضمان نتائج متسقة.
  3. تصدير وحفظ قراءات الامتصاص.
  4. تحليل البيانات.
    ملاحظة: يمكن معالجة البيانات التجريبية بشكل فردي أو نسخها ولصقها في القالب المقدم لتقييم المتوسط والانحراف المعياري ومعامل قيمة التباين (CV) باستخدام برنامج جدول البيانات.
    1. افتح الملف التكميلي 'supplementary_template-analysis.xlsx"، وهو أيضا متاح داخل مستودع GitHub ضمن 'openworkstation/examples/publication-JoVE.
    2. انسخ قراءات الامتصاص إلى ورقة "البيانات الخام" ، وتأكد من تعريف جميع مراجع الخلايا بشكل صحيح في جميع الجداول ، وانقر فوق ورقة "التحليل" للحصول على معلومات حول قيم المتوسط والانحراف المعياري ومعامل التباين (CV).
      ملاحظة: اعتمادا على توزيع العينة على لوحة البئر، تتوفر أنواع التقييم المحددة مسبقا التالية مع القالب: يتم استخدام النوع "موحد" عندما يكون لجميع العينات نفس التكوين، ويتم استخدام نوع "حسب الصفوف" عندما يكون للعينات في صفوف مختلفة تركيبات مختلفة، ويتم استخدام نوع "حسب الأعمدة" عندما يكون للعينات في أعمدة مختلفة تركيبات مختلفة، ويتم استخدام النوع "مخصص" عندما تكون مواضع العينة خاصة بالمستخدم.

Representative Results

يقدم هذا البرنامج التعليمي نتائج التجارب مع الجلسرين (الشكل 3) و GelMA مع LAP و alginate (الشكل 4).

تم التحقيق في توليد محلول جليسرين بنسبة 80٪ (v / v) إما بدون التحكم في درجة الحرارة (درجة حرارة الغرفة ، 22 درجة مئوية) وبدون لمس الطرف (المحدد باسم الإعداد 1) ، مع التحكم في درجة الحرارة (40 درجة مئوية) وبدون لمس الطرف (الإعداد 2) ، أو مع التحكم في درجة الحرارة (40 درجة مئوية) ومع اللمس الطرفي (الإعداد 3) (الشكل 3a-i). تم اختيار هذين الإعدادين لدرجة الحرارة لتقييم فرق المناولة ، نظرا لأن لزوجة الجلسرين تتناقص تقريبا بعامل 3 عند تسخينه من 22 درجة مئوية (139.5 مللي باسكال ·s) إلى 40 درجة مئوية (46.6 mPa·s)30. تم تخفيف محلول مخزون 85٪ (v / v) من الجلسرين إلى تركيز نهائي قدره 80٪ ووزع بشكل موحد في صفيحة بئر 96 (n = 96 لكل إعداد). كان الوقت التجريبي ، الذي يتضمن توزيع كل مادة في أنبوب الخليط ، ومهام الخلط المعنية ، وتوزيع العينات في صفيحة بئر 96 ، 30 دقيقة و 42 ثانية. لتحديد الاختلافات بين مخاليط التخفيف ، تم تحضير الماء فائق النقاء - كمخفف للجلسرين - باستخدام 1 ملغ / مل برتقالي G. تسلط قراءات الامتصاص الضوء على أن تكامل التحكم في درجة الحرارة ولمس الطرف يؤثر بشكل كبير على المخاليط (p < 0.0001). بالإضافة إلى التحليل ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA) ، تم حساب قيم CV لتقييم الانحراف المعياري النسبي. يصف معامل التباين مؤشرا موحدا لتحديد درجة الانحراف فيما يتعلق بالمتوسط ويتم التعبير عنه كنسبة مئوية. وإذا لم تكن وسائل العينة هي نقطة الاهتمام على وجه الخصوص، بل التباين داخل القياسات، فإن معامل التباين يوفر رؤى إضافية لتحديد المخاليط القابلة للتكرار46. ضمن هذه التجربة مع ثلاثة إعدادات مختلفة، أظهرت قيم الامتصاص انخفاضا في قيم السيرة الذاتية من 5.6٪ و 4.2٪ إلى 2.0٪ للإعداد 1 والإعداد 2 والإعداد 3 على التوالي، مما يدل على التأثير الكبير لرصيف درجة الحرارة ووظيفة لمس الطرف على تحقيق نتائج موثوقة (الشكل 3a-ii). إن رسم قيم امتصاص العينة للإعداد 3 (رقم العينة من #1 إلى #96 في صفيحة بئر 96) لا ينتج عنه قيم متزايدة أو متناقصة طوال التجربة ، وبالتالي ، لا يشير إلى أي تأثير لموضع العينة على قيم الامتصاص (الشكل 3a-iii). يوفر تصور البيانات لكل صفيحة بئر تم قياسها باستخدام الخرائط الحرارية رؤى إضافية لتحديد عدم التجانس لصف أو عمود معين ، أو قيم امتصاص مختلفة طوال مهام التوزيع. تعرض الخرائط الحرارية المرئية للإعدادات الثلاثة انخفاضا في عدم التجانس عبر لوحات البئر بأكملها من الإعداد 1 إلى الإعداد 3 (الشكل 3 ب). وأخيرا، تم تقييم قابلية تكرار الخلط الذي تم إجراؤه ضمن ثمانية أشواط مستقلة (الشكل 3c-i,ii)، حيث استغرق كل شوط 6 دقائق و57 ثانية. أظهرت عمليات الخلط الفردية قيم CV منخفضة تتراوح بين 1.1٪ و 2.6٪ ، مما يشير إلى مهام خلط وتوزيع موثوقة للغاية لعمليات التشغيل الفردية. أسفرت قيم الامتصاص لجميع الأشواط الثمانية عن قيمة CV بنسبة 3.3٪ وأظهرت قابلية تكرار بروتوكول الخلط المعمول به.

تم تحضير سلسلة تخفيف GelMA عن طريق تخفيف محلول مخزون 20٪ (w / v) مع PBS إلى 14 و 12 و 10 و 8 و 6 و 4 و 2 و 0٪ (w / v) وإضافة LAP إلى تركيز ثابت قدره 0.15٪ (w / v) (الشكل 4a-i) ، والذي استغرق ما مجموعه 55 دقيقة 12 ثانية. كما هو محدد في نص البروتوكول التجريبي ، كان الهيدروجيل متقاطعا لمدة 30 ثانية بكثافة 2.0 mW / cm2 عند 400 nm. لتقييم الاختلافات بين المخاليط ، تم تحضير PBS - كمخفف ل GelMA و alginate - باستخدام 1 mg / mL Orange G. وبالتالي ، يتم تحديد فرق الامتصاص بين العينات داخل خليط واحد وكذلك بين التخفيفات التسلسلية باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تختلف قيم الامتصاص المقاسة لكل خطوة تركيز اختلافا كبيرا (p < 0.0001) ولها قيم CV منخفضة جدا تتراوح بين 1.2٪ و 3.4٪ طوال خطوات التركيز (n = 12 لكل خطوة تركيز). أظهر الانحدار الخطي ملاءمة عالية مع قيمة R² قدرها 0.9869 (الشكل 4a-ii) وأكدت خريطة حرارية التوزيع المتجانس لكل تركيز والفرق بين التركيزات (الشكل 4a-iii). تم إجراء خلط آلي لأربعة كواشف لتوليد 5٪ (w / v) GelMA ، و 2٪ (w / v) alginate ، و 0.15٪ (w / v) LP ، و PBS كمخفف بدون (إعداد 2) ومع (إعداد 3) طرف لمس (n = 96 لكل إعداد) مع نفس معلمات الربط المتقاطع (30 ثانية ، 2.0 ميجاوات / سم 2 ، 400 نانومتر). استغرق توزيع المواد الأربع وخلطها وتوزيعها في لوحة بئر 96 دقيقة 32 دقيقة و 22 ثانية. أجريت جميع التجارب مع GelMA و alginate عند 37 درجة مئوية لمنع التبلور الحراري الذي يمنع سحب GelMA. مع خيار لمس الطرف ، تم تخفيض قيمة CV من 5.2٪ إلى 3.4٪ ، وخاصة ، تم منع القيم المتطرفة في المنطقة السفلية عن طريق إزالة المواد الزائدة من الطرف (الشكل 4b-i). على الرغم من أن القيمة المتوسطة 1.927 و 1.944 للإعداد 2 والإعداد 3 قريبة جدا ، إلا أن معامل التباين يسلط الضوء على الانحراف المتناقص فيما يتعلق بالمتوسط. يمكن مقارنة صفوف مفردة من لوحة البئر 96 مع بعضها البعض باستخدام تصور خريطة حرارية للكشف عن الاختلافات في الصفوف و / أو الأعمدة (الشكل 4b-ii).

Figure 1
الشكل 1: سير عمل البروتوكول مع المهام الفردية. ينقسم سير العمل الموصوف إلى سبع مهام، يتم فصلها إلى إعداد وإعداد وتنفيذ وتحليل. في البداية ، يجب إعداد البرنامج (المهمة 1) وكذلك الأجهزة (المهمة 2). بعد إعداد المواد (المهمة 3) وإنشاء البرنامج النصي للبروتوكول (المهمة 4) ، تتم معايرة وحدة السحب عن طريق تحديد مواضع الماصة والحاوية (المهمة 5). بعد ذلك ، يتم تنفيذ البرنامج النصي للبروتوكول على محطة العمل (المهمة 6) ويتم التحقق من الصحة والتحقق (المهمة 7) من المخاليط لتقييم المخاليط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: محطة عمل مفتوحة المصدر وإعداد سطح السفينة لوحدة السحب. (أ) محطة العمل المطورة مستوحاة من نهج خط التجميع، حيث يجري نقل العينات من خلال وحدات مختلفة، وتتألف من الوحدات التالية: السحب، والربط المتقاطع، والتخزين، والنقل، والوحدة الحسابية. (ب) يتم إعداد سطح وحدة السحب اعتمادا على التصميم التجريبي (على سبيل المثال، نوع لوحة البئر، وحجم الأنبوب، وما إلى ذلك). تم استخدام إعداد سطح السفينة المعروض للتجارب المقدمة ويتكون من ماصات إزاحة إيجابية مع نطاق يتراوح من 10-100 ميكرولتر (M100E) و 100−1000 ميكرولتر (M1000E) ، ورفوف طرفية مع مكابس شعرية (CP) ل 100 ميكرولتر (CP1000) و 1000 ميكرولتر (CP1000) ، وحاوية قمامة ، وصينية خلط ، وصينية إدخال لكواشف الإدخال. (ج) تحدد مواقع سطح السفينة المتاحة بالأرقام المعروضة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نتائج السحب الآلي لمخاليط الجلسرين. (أ) يتيح التصميم المرن لمحطة العمل تقييم ثلاثة إعدادات مختلفة (ط) لتحديد البارامترات المثلى للنتائج القابلة للتكرار. '2' أدت إضافة لمسة طرفية وتسخين المادة إلى انخفاض معامل قيم التباين (CV) ومخاليط قابلة للتكرار بدرجة عالية للإعداد 3. أجريت كل تجربة مع 96 عينة. '3' لم يظهر رسم قيم العينة المفردة أي تأثير على تسلسل السحب. (ب) تم تصور النتائج التجريبية لكل إعداد باستخدام خرائط حرارية لتحديد التأثير على الاختلافات الخام/العمود أو الحواف أو الخليط الرئيسي. (ج) تم تحليل قابلية إعادة إنتاج الإعداد 3 في ثمانية أشواط مستقلة باستخدام (i) الوسيط والانحراف المعياري وقيمة CV و (ii) الخرائط الحرارية. يتم عرض البيانات في اللوحات a-ii (n = 96) و b-i (n = 12) مع الوسائل ونقاط البيانات المفردة. تم تعريف الدلالة الإحصائية على أنها ****p < 0.0001 باستخدام التحليل ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نتائج خلط المهام مع الهلاميات المائية. (أ) من محلول ميتاكريلويل الجيلاتين (GelMA) 20 في المائة (w/v)، تم توليد تخفيف تسلسلي قدره 14 و 12 و 10 و 8 و 6 و 4 و 2 و 0 في المائة (w/v) خلال تشغيل تجريبي واحد باستخدام صفيحة بئر 96 (n = 12 لكل تركيز). (ط) تراوحت قيم معامل التباين (CV) بين 1.2٪ و3.4٪ في جميع التركيزات المحضرة، و(ب) أظهر الانحدار الخطي ملاءمة عالية بقيمة R² بلغت 0.9869. (iii) تم تأكيد التخفيفات المتجانسة بصريا باستخدام الخريطة الحرارية المتولدة. (ب) تم توليد هيدروجيل مزدوج الشبكة بنسبة 5٪ (w/v) GelMA ، و 2٪ (w / v) alginate ، و 0.15٪ (w / v) LAP (i) مع وبدون لمس طرف (n = 96 لكل إعداد) ومترابطة لمدة 30 ثانية بكثافة 2.0 mW / cm2 عند 400 نانومتر. أدى دمج لمسة الطرف إلى انخفاض قيم السيرة الذاتية من 5.2٪ إلى 3.4٪. (ii,iii) تؤكد الخرائط الحرارية انحرافات أقل عند استخدام اللمس التلميحي لإزالة المواد الزائدة من الطرف. يتم عرض البيانات في اللوحات a-i و b-i مع الوسائل ونقاط البيانات المفردة. تم تعريف الدلالة الإحصائية على أنها *p < 0.05 و ***p < 0.001 و ****p < 0.0001 باستخدام تحليل أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: ملخص لاختلاف نوع الماصة والمشكلات المتعلقة بالمواد الحيوية اللزجة. (أ) يفصل بين الكاشف والمكبس وسادة هوائية تتقلص أثناء خطوات التوزيع وتتوسع أثناء خطوات الشفط. عند شفط المواد اللزجة وتوزيعها ، فإن "التدفق" البطيء يطرح مشاكل مثل فقاعات الهواء وسلوك السحب غير المنتظم. (ب) تتيح ماصات الإزاحة الإيجابية إمكانية شفط المواد اللزجة وتوزيعها بصورة موثوقة باستخدام مكبس داخل الطرف. (ج) يمكن أن يؤدي سحب مواد شديدة اللزوجة (مثل 4٪ (مع / v) من الجينات) إلى تراكم المواد الزائدة على الطرف ، مما يؤدي إلى عدم الدقة طوال التجارب. (د) يتيح تنفيذ صينية بسيطة تعمل باللمس لإزالة المواد الزائدة على الطرف ويؤدي إلى أحجام شفط وتوزيع دقيقة. ويتحقق ذلك باستخدام الجانب الداخلي من غطاء لوحة البئر الموضوعة على حاوية رف طرف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المادة رقم 1 (تركيز المخزون) التركيز النهائي للمادة #1 المادة #2 (تركيز المخزون) التركيز النهائي للمادة #2 المواد رقم 3 (تركيز المخزون) التركيز النهائي للمادة #3 مخفف (حل عمل Orange G) تركيز G البرتقالي النهائي في الخليط معروض في الشكل
الجلسرين (85٪ (ث / v)) 80٪ (ث/ت) ماء (1 ملغم/مل برتقال ز) 0.059 ملغم/مل الشكل 3 أ-ج
GelMA (20٪ (ث / v)) 0٪ (ث / v) LAP (3٪ (ث / v)) 0.15٪ (ث / v) PBS (1 ملغم / مل برتقالي G) 1 ملغم/مل الشكل 4 (أ)
GelMA (20٪ (ث / v)) 2٪ (ث / v) LAP (3٪ (ث / v)) 0.15٪ (ث / v) PBS (1 ملغم / مل برتقالي G) 0.85 ملغم/مل الشكل 4 (أ)
GelMA (20٪ (ث / v)) 4٪ (ث / v) LAP (3٪ (ث / v)) 0.15٪ (ث / v) PBS (1 ملغم / مل برتقالي G) 0.75 ملغم/مل الشكل 4 (أ)
GelMA (20٪ (ث / v)) 6٪ (ث/ت) LAP (3٪ (ث / v)) 0.15٪ (ث / v) PBS (1 ملغم / مل برتقالي G) 0.65 ملغم/مل الشكل 4 (أ)
GelMA (20٪ (ث / v)) 8٪ (ث / v) LAP (3٪ (ث / v)) 0.15٪ (ث / v) PBS (1 ملغم / مل برتقالي G) 0.55 ملغم/مل الشكل 4 (أ)
GelMA (20٪ (ث / v)) 10٪ (ث/ت) LAP (3٪ (ث / v)) 0.15٪ (ث / v) PBS (1 ملغم / مل برتقالي G) 0.45 ملغم/مل الشكل 4 (أ)
GelMA (20٪ (ث / v)) 12٪ (ث/ت) LAP (3٪ (ث / v)) 0.15٪ (ث / v) PBS (1 ملغم / مل برتقالي G) 0.35 ملغم/مل الشكل 4 (أ)
GelMA (20٪ (ث / v)) 14٪ (ث/ت) LAP (3٪ (ث / v)) 0.15٪ (ث / v) PBS (1 ملغم / مل برتقالي G) 0.25 ملغم/مل الشكل 4 (أ)
GelMA (20٪ (ث / v)) 5٪ (ث / v) الجينات (4٪ (ث / v)) 2٪ (ث / v) LAP (3٪ (ث / v)) 0.15٪ (ث / v) PBS (1 ملغم / مل برتقالي G) 0.2 ملغم/مل الشكل 4 ب

الجدول 1: نظرة عامة على المعلمات للتجارب التي أجريت.

خطوة البروتوكول مشكلة السبب المحتمل حل
1.1 لا يمكن تثبيت البرنامج أو تحديثه نفاد مساحة القرص على بطاقة SD تحقق من مساحة القرص على بطاقة SD. إذا لزم الأمر، قم بإزالة العناصر غير الضرورية أو إفراغ سلة المهملات أو استخدام بطاقة SD ذات حجم مناسب
1.2 لا يمكن تثبيت واجهة برمجة التطبيقات قدرة المستخدمين على التثبيت مقيدة (لا يوجد إذن مستخدم الجذر) استخدم الأمر "sudo" أمام الأوامر المحددة للحصول على حقوق المسؤول. في Linux ، يعرف هذا النوع من الوصول باسم المستخدم الخارق.
3.1 مشاكل مع GelMA التشغيل الوظيفي أو غسيل الكلى أو التجفيد بروتوكول مفصل خطوة بخطوة بما في ذلك قائمة استكشاف الأخطاء وإصلاحها المتوفرة في Loessner et al.33.
5.1 و 6.2 محطة العمل لا تتفاعل مع الأوامر مشكلات الاتصال قم بتشغيل كل شيء وقم بإيقاف تشغيل الكمبيوتر. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة لمدة 10 ثوان. تشغيل الكمبيوتر ومحطة العمل مرة أخرى.
5.1 و 6.2 محطة العمل لا تتفاعل مع الأوامر مشكلات الاتصال تحقق مما إذا كان الكمبيوتر يتعرف على اتصال USB وتم تعريف منفذ USB بشكل صحيح. تأكد من أن جدار الحماية لا يمنع عملية الاتصال (انظر الرابط أدناه الجدول 2).
5.1 و 6.2 لا يمكن فتح الملف دليل خاطئ تحقق من المخرج (مسار المجلد) للتأكد من استخدام المسار الصحيح. إذا تعذر العثور على ملف (على سبيل المثال، interface.py)، فمن المحتمل أن يكون المسار الخاطئ قيد الاستخدام.
6.6.2 الطرف غير متصل بشكل صحيح أو يسقط أثناء الحركة مشكلة المعايرة كرر خطوات المعايرة للماصة وتأكد من توصيل المكبس الشعري بشكل صحيح مع الماصة.
6.6.2 الطرف غير متصل بشكل صحيح أو يسقط أثناء الحركة مشكلة المرفق لا يتم توصيل الماصة بشكل صحيح بمحور الماصة وتتحرك أثناء خطوات الحركة. شد البراغي بإحكام لمنع ذلك.
6.6.2 تلميح يستنشق فوق المواد مشكلة المعايرة كرر معايرة هذا النوع من الدرج لتحديد الارتفاع بشكل صحيح.
6.6.2 تلميح يستنشق فوق المواد مشكلة المعايرة تحقق من مستوى الصوت في الأنبوب وتأكد من أن وحدة التخزين تساوي الحجم المحدد في تطبيق مصمم البروتوكول.
6.6.2 المواد تتراجع أثناء الحركة الكثير من المواد الزائدة على الطرف إضافة خيار قفص الاتهام باللمس تلميح ؛ اختياريا ، يمكن أيضا زيادة وقت لمس الطرف.
6.6.2 المواد صلبة أو لزجة جدا للسحب السلوك المستجيب للحرارة للمواد تحقق من توصيف المواد المستجيبة للحرارة واضبط درجة حرارة التدفئة / التبريد لرصيف درجة الحرارة وفقا لذلك.
https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting

الجدول 2: جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها مع المشكلات المحددة والأسباب المحتملة بالإضافة إلى حلول لحل المشكلات.

ملف تكميلي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يعد سحب المواد اللزجة، وخاصة المواد الهلامية المائية للتطبيقات الطبية الحيوية19،20،21،33،47، من المهام الروتينية في العديد من مختبرات البحوث لإعداد تركيز محدد من قبل المستخدم أو سلسلة تخفيف بتركيزات مختلفة. على الرغم من أنه متكرر والتنفيذ بسيط إلى حد ما ، إلا أنه يتم تنفيذه يدويا في الغالب باستخدام إنتاجية عينة منخفضة18. يقدم هذا البرنامج التعليمي تشغيل محطة عمل مفتوحة المصدر ، والتي تم تصميمها خصيصا للمواد اللزجة ، لتمكين الخلط الآلي للمواد اللزجة لتوليد التركيزات المطلوبة القابلة للتكرار. تم تحسين محطة العمل هذه لسحب المواد الهلامية المائية لتمكين المعالجة الآلية والموثوقة للغاية من خلال دمج أرصفة درجة الحرارة للمواد المستجيبة للحرارة ، وماصات الإزاحة الإيجابية للمواد اللزجة ، وقاعدة لمس طرفية اختيارية لإزالة المواد الزائدة من الحافة. تم تحسين وحدة السحب على وجه التحديد لتمكين معالجة المواد اللزجة بطريقة موحدة وآلية. بالمقارنة مع ماصات وسادة الهواء (الشكل 5 أ) ، تقوم ماصات الإزاحة الإيجابية (الشكل 5 ب) بتوزيع المواد اللزجة دون ترك المواد المتبقية في الطرف ، مما يؤدي إلى أحجام شفط وتوزيع دقيقة. يزيل الرصيف الاختياري الذي يعمل باللمس من طرف العينة الزائدة من الطرف (الشكل 5 ج ، د) ، وهو أمر مفيد للمواد اللاصقة (على سبيل المثال ، 4٪ (ث / v) جينات).

تمت برمجة تطبيق مصمم البروتوكول خصيصا للهيدروجيل ويسمح بتخفيف ما يصل إلى أربعة كواشف بتركيزات مختلفة وما يصل إلى اثنين من المواد المخففة. يتم منع خطر حدوث أخطاء في حساب التخفيفات النهائية في هذا التطبيق ، حيث يختار المستخدمون فقط التركيز المطلوب أو خطوات التخفيف التسلسلية. يتم حساب وحدات التخزين المطلوبة للشفط والتوزيع تلقائيا، ويتم حفظها في ملف نصي منفصل للوثائق، ثم تعبئتها في البرنامج النصي للبروتوكول. يمنح تطبيق تصميم البروتوكول هذا المستخدم التحكم الكامل في جميع المعلمات التجريبية (على سبيل المثال ، سرعة السحب) ويضمن التوثيق الداخلي للمعلمات المهمة. يأخذ تطبيق تصميم البروتوكول مستوى ملء الخزان (على سبيل المثال ، جيدا) في الاعتبار ويغير ارتفاع الشفط / التوزيع لمنع الغمس غير الضروري في المواد اللزجة. تتجنب هذه الميزة المدمجة تراكم المواد على الجدار الخارجي للطرف ، وبالتالي تضمن مهام الشفط والتوزيع الموثوقة في جميع أنحاء البروتوكول. على الرغم من أن تطبيق مصمم البروتوكول قد تم تطويره لخطوات تخفيف الهيدروجيل ، إلا أنه يمكن استخدامه أيضا لتخفيف السوائل غير اللزجة ، مثل أصباغ Orange G. تطبيق مصمم البروتوكول ، الذي يمكن الوصول إليه عبر المستودع تحت عنوان "/ الأمثلة / المنشور-JoVE" ، هو الإصدار الذي يتم شرحه في قسم البروتوكول وتمييزه في الفيديو. لن يتم تحديث هذا الإصدار. ومع ذلك ، يتوفر إصدار محدث من تطبيق مصمم البروتوكول عبر صفحة المستودع الرئيسية. تم تطوير محطة المعايرة في البداية بواسطة Sanderson48 وتم تحسينها لمعايرة ماصات الإزاحة الإيجابية.

كما هو موضح في قسم البروتوكول 4 ، يجب معايرة الماصات وكذلك الحاويات في البداية. تعد عملية المعايرة هذه ضرورية لتحديد وحفظ المواضع التي يتم استخدامها بعد ذلك لحساب زيادات الحركة. لذلك ، يعتمد تنفيذ البروتوكول الناجح على مواضع معايرة محددة جيدا ، حيث يمكن أن تؤدي نقاط المعايرة الخاطئة إلى تحطم الطرف في حاوية. نظرا لأنه يجب معايرة مواضع المكبس للماصات يدويا ، فإن دقة السحب ودقته تعتمد بشكل كبير على المعايرة التي يتم إجراؤها. تعتمد إجراءات المعايرة هذه بشكل كبير على تجربة المستخدم مع وحدة السحب ، وبالتالي ، يوصى بالتدريب مع الموظفين ذوي الخبرة في البداية لضمان إجراءات المعايرة المناسبة. بالإضافة إلى المعايرة اليدوية على وحدة السحب ، يجب معايرة الماصة نفسها لضمان السحب الدقيق. يوصى بمعايرة الماصات كل 12 شهرا على الأقل لتلبية معايير القبول كما هو محدد في ISO 8655. لتقييم معايرة الماصة داخليا ، يتوفر التحقق والتحقق كما هو موضح من قبل Stangegaard et al.16.

من أجل توليد مجموعة بيانات موثوقة ، من الأهمية بمكان البدء بكواشف ذات جودة عالية. هذا مهم بشكل خاص لمهام معالجة الهيدروجيل ، حيث قد تؤثر الاختلافات من دفعة إلى دفعة على النتائج الناتجة داخل هذا البروتوكول. بالإضافة إلى الاختلافات من دفعة إلى أخرى ، قد تسهم التغييرات الطفيفة في إعداد الأحجام الصغيرة أيضا في اختلافات الخصائص. لمنع ذلك ، يوصى بإعداد كميات أكبر ، والتي يمكن استخدامها للتجارب بأكملها.

تعتمد إجراءات التحقق والتحقق على استخدام صبغة لتحديد مخاليط موثوقة. يصف البروتوكول المقدم تطبيق Orange G ، ولكن يمكن أيضا تكييف سير عمل البروتوكول والتحليل العام مع الأصباغ الفلورية49,50. يقلل استخدام Orange G من المتطلبات التقنية لمقياس الطيف الضوئي ويزيل الاحتياطات المتخذة لمنع تبييض أصباغ الفلورسنت بعد التعرض للضوء. لم يتم ملاحظة المشكلات في سلوك الذوبان أو تكوين الكتلة للصبغة مع المواد المعروضة أثناء التجارب ولكن قد تظهر مع مواد أخرى. يمكن بسهولة اكتشاف تكوين العنقود المحتمل ، وبالتالي التفاعل بين الصبغة والمواد باستخدام المجهر.

تضيف الإجراءات والتقنيات المقدمة في هذا البرنامج التعليمي إمكانية التشغيل الآلي إلى سير العمل الحالي للمواد اللزجة لتحقيق مهام موثوقة للغاية بأقل قدر من العمالة البشرية. يتضمن جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها المقدم (الجدول 2) المشكلات المحددة ويعرض الأسباب المحتملة بالإضافة إلى الحلول لحل المشكلات. تم تطبيق محطة العمل المقدمة بنجاح على المواد البوليمرية الطبيعية (الجيلاتين ، صمغ الجيلان ، الماتريجيل) والاصطناعية (على سبيل المثال ، البولي (الإيثيلين جلايكول) [PEG] ، Pluronic F127 ، Lutrol F127) لمهام السحب الآلية. على وجه الخصوص ، سيكون الجمع بين محطة عمل مفتوحة المصدر وتطبيق تصميم بروتوكول مفتوح المصدر مصمم للمواد اللزجة مفيدا جدا للباحثين العاملين في مجالات الهندسة الطبية الحيوية وعلوم المواد وعلم الأحياء الدقيقة.

Disclosures

CM و DWH هم مؤسسون ومساهمون في Gelomics Pty Ltd. CM هو أيضا مدير Gelomics Pty Ltd. يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح ذات الصلة بموضوع هذه المقالة. ليس للمؤلفين أي انتماءات أخرى ذات صلة أو مشاركة مالية مع أي منظمة أو كيان له مصلحة مالية أو تضارب مالي مع الموضوع أو المواد التي نوقشت في المقالة بصرف النظر عن تلك التي تم الكشف عنها.

Acknowledgments

يعترف المؤلفون بأعضاء مركز الطب التجديدي في جامعة كوينزلاند للتكنولوجيا ، ولا سيما أنتونيا هورست وباول ميشزانيك لاقتراحاتهم وملاحظاتهم المفيدة. تم دعم هذا العمل من قبل جائزة أبحاث الدراسات العليا في جامعة كوينزلاند للتكنولوجيا ل SE ، ومن قبل مجلس البحوث الأسترالي (ARC) بموجب اتفاقية المنحة IC160100026 (مركز تدريب التحول الصناعي ARC في التصنيع الحيوي المضاف). تم دعم NB من قبل المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) زمالة بيتر دوهرتي للبحوث المهنية المبكرة (APP1091734).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 reaction tubes Fisher Scientific, Inc. (USA) 14-959-53A
5 mL tubes Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) SCT-5ML size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name
50 mL reaction tubes Fisher Scientific, Inc. (USA) 14-432-22
70% w/w Ethanol LabChem, Inc. (USA) aja726-5Lpl
96-well plate Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055
Alginate NovaMatrix 4200001 https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/
Demineralized or ultrapure (MilliQ) water
Gelatin methacryloyl (GelMA) Synthetized in-house detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma-Aldrich, Inc. (USA) 900889
M4 and M5 Allen key OpenBuilds, inc. (USA) 179, 190 also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/
OrangeG Fisher Scientific (USA) O267-25 https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) 14190-144 alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)
Equipment
Aluminium blocks for temperature dock Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) SB16 blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html
Analytical balance Sartorius AG (Germany) ED224S
Open source liquid handling robot: commercial product Opentrons Laboratories, Inc. (USA) OT-One S Pro https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro
Open source liquid handling robot: open source hardware Assembled in-house following an open source approach hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24
Positive displacement pipette: MicromanE Gilson, Inc. (USA) FD10006 depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html
Spectrophotometer BMG LABTECH GmbH (Germany) CLARIOstar
Tips: capillary pistons Gilson, Inc. (USA) F148180 depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarvis, M. F., Williams, M. Irreproducibility in Preclinical Biomedical Research: Perceptions, Uncertainties, and Knowledge Gaps. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (4), 290-302 (2016).
  2. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
  3. Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The economics of reproducibility in preclinical research. PLoS Biology. 13 (6), 1-9 (2015).
  4. Niepel, M., et al. A Multi-center Study on the Reproducibility of Drug-Response Assays in Mammalian Cell Lines. Cell Systems. 9 (1), 35-48 (2019).
  5. Prinz, F., Schlange, T., Asadullah, K. Believe it or not: how much can we rely on published data on potential drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (9), 712 (2011).
  6. Baker, M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature. 533 (7604), 452-454 (2016).
  7. Begley, C. G., Ellis, L. M. Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
  8. Sena, E. S., van der Worp, H. B., Bath, P. M. W., Howells, D. W., Macleod, M. R. Publication Bias in Reports of Animal Stroke Studies Leads to Major Overstatement of Efficacy. PLoS Biology. 8 (3), 1000344 (2010).
  9. Ioannidis, J. P. A., Kim, B. Y. S., Trounson, A. How to design preclinical studies in nanomedicine and cell therapy to maximize the prospects of clinical translation. Nature Biomedical Engineering. 2 (11), 797-809 (2018).
  10. Enserink, M. Sloppy reporting on animal studies proves hard to change. Science. 357 (6358), 1337-1338 (2017).
  11. Freedman, L. P., Inglese, J. The Increasing Urgency for Standards in Basic Biologic Research. Cancer Research. 74 (15), 4024-4029 (2014).
  12. Lippi, G., Lima-Oliveira, G., Brocco, G., Bassi, A., Salvagno, G. L. Estimating the intra- and inter-individual imprecision of manual pipetting. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 55 (7), 962-966 (2017).
  13. Hentz, N. G., Knaide, T. R. Effect of Liquid-Handling Accuracy on Assay Performance. Journal of Laboratory Automation. 19 (2), 153-162 (2014).
  14. Reason, J. Understanding adverse events: human factors. Quality and Safety in Health Care. 4 (2), 80-89 (1995).
  15. Schober, L., et al. Cell Dispensing in Low-Volume Range with the Immediate Drop-on-Demand Technology (I-DOT). Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 154-163 (2015).
  16. Stangegaard, M., Hansen, A. J., Frøslev, T. G., Morling, N. A Simple Method for Validation and Verification of Pipettes Mounted on Automated Liquid Handlers. Journal of Laboratory Automation. 16 (5), 381-386 (2011).
  17. Crombie, D. E., et al. Development of a Modular Automated System for Maintenance and Differentiation of Adherent Human Pluripotent Stem Cells. SLAS Discovery. 22 (8), 1016-1025 (2017).
  18. Eggert, S., Hutmacher, D. W. In vitro disease models 4.0 via automation and high-throughput processing. Biofabrication. 11 (4), 043002 (2019).
  19. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Advanced Materials. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  20. Zhang, Y. S., Khademhosseini, A. Advances in engineering hydrogels. Science. 356 (6337), (2017).
  21. Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
  22. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  23. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
  24. Gao, G., Huang, Y., Schilling, A. F., Hubbell, K., Cui, X. Organ Bioprinting: Are We There Yet. Advanced Healthcare Materials. 7 (1), 1701018 (2018).
  25. Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
  26. Lim, K. S., et al. New Visible-Light Photoinitiating System for Improved Print Fidelity in Gelatin-Based Bioinks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1752-1762 (2016).
  27. Müller, M., et al. Development and thorough characterization of the processing steps of an ink for 3D printing for bone tissue engineering. Materials Science and Engineering C. 108, 110510 (2020).
  28. Sewald, L., et al. Beyond the Modification Degree: Impact of Raw Material on Physicochemical Properties of Gelatin Type A and Type B Methacryloyls. Macromolecular Bioscience. 18 (12), 1-10 (2018).
  29. Eggert, S., Mieszczanek, P., Meinert, C., Hutmacher, D. W. A modular open source technology for automated in vitro workflows. Zenodo. , (2020).
  30. Volk, A., Kähler, C. J. Density model for aqueous glycerol solutions. Experiments in Fluids. 59 (5), 75 (2018).
  31. Zhang, H., Grinstaff, M. W. Recent Advances in Glycerol Polymers: Chemistry and Biomedical Applications. Macromolecular Rapid Communications. 35 (22), 1906-1924 (2014).
  32. Klotz, B. J., Gawlitta, D., Rosenberg, A. J. W. P., Malda, J., Melchels, F. P. W. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair. Trends in Biotechnology. 34 (5), 394-407 (2016).
  33. Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  34. Ansari, S., et al. Regulation of the fate of dental-derived mesenchymal stem cells using engineered alginate-GelMA hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2957-2967 (2017).
  35. Axpe, E., Oyen, M. Applications of Alginate-Based Bioinks in 3D Bioprinting. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 1976 (2016).
  36. Ma, X., et al. 3D printed micro-scale force gauge arrays to improve human cardiac tissue maturation and enable high throughput drug testing. Acta Biomaterialia. 95, 319-327 (2019).
  37. Bas, O., et al. Rational design and fabrication of multiphasic soft network composites for tissue engineering articular cartilage: A numerical model-based approach. Chemical Engineering Journal. 340, 15-23 (2018).
  38. O'Connell, C. D., et al. Tailoring the mechanical properties of gelatin methacryloyl hydrogels through manipulation of the photocrosslinking conditions. Soft Matter. 14 (11), 2142-2151 (2018).
  39. LearnPython.org. , Available from: https://www.learnpython.org (2020).
  40. Raspberry Pi Foundation: Using your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-using (2020).
  41. Raspberry Pi Foundation: Setting up your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/4 (2020).
  42. Raspberry Pi Foundation: Connect your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/3 (2020).
  43. Python Software Foundation: python.org. , Available from: https://www.pthon.org (2020).
  44. Python Software Foundation: pypi.org. , Available from: https://pypi.org (2020).
  45. Opentrons Labworks, Inc: Installing pipettes. , Available from: https://support.opentrons.com/en/articles/689945-installing-pipettes (2020).
  46. Kang, C. W., Lee, M. S., Seong, Y. J., Hawkins, D. M. A Control Chart for the Coefficient of Variation. Journal of Quality Technology. 39 (2), 151-158 (2007).
  47. Annabi, N., et al. 25th Anniversary Article: Rational Design and Applications of Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
  48. Theo Sanderson: OpenTronsTerminalCalibration. , Available from: https://github.com/theosanderson/OpentronsTerminalCalibration (2020).
  49. Rhode, H., et al. An Improved Method for Checking HTS/uHTS Liquid-Handling Systems. Journal of Biomolecular Screening. 9 (8), 726-733 (2004).
  50. Taylor, P. B., et al. A Standard Operating Procedure for Assessing Liquid Handler Performance in High-Throughput Screening. Journal of Biomolecular Screening. 7 (6), 554-569 (2002).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 181 ، الأتمتة ، الاستنساخ ، المصدر المفتوح ، الهيدروجيل ، زراعة الخلايا 3D ، الطباعة الحيوية ، التصنيع الحيوي المضاف ، هندسة الأنسجة ، المواد اللزجة ، ماصة الإزاحة الإيجابية ، الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA)
منصة تقنية مفتوحة المصدر لتصنيع نماذج ثقافة 3D القائمة على الهيدروجيل بطريقة آلية وموحدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eggert, S., Kahl, M., Kent, R.,… More

Eggert, S., Kahl, M., Kent, R., Gaats, L., Bock, N., Meinert, C., Hutmacher, D. W. An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion. J. Vis. Exp. (181), e61261, doi:10.3791/61261 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter