Summary
マイクロコイルを用いた超高磁場共鳴顕微鏡(MRM)を用いて、高空間分解能で生体組織を研究するプロトコルを紹介する。マイクロコイルの特徴付けについて、ステップバイステップの説明が提供されています。最後に、イメージングの最適化が植物根で実証されます。
Abstract
このプロトコルは、MR顕微鏡法(MRM)とも呼ばれる、高解像磁気共鳴画像法(MRI)用に設計された生物学的サンプルと組み合わせた、電磁微小コイルのシグナル対雑音比(SNR)較正およびサンプル調製方法を記述する。これは、前臨床MRI分光計で使用することができる,メディカゴトランカトゥーラ根サンプルで実証.マイクロコイルは、RF共振器のサイズを目的のサンプルのサイズに合わせて感度を高め、データ取得時間の高い画像解像度を可能にします。比較的シンプルな設計により、ソレノイダルマイクロコイルは簡単で安価に構築でき、サンプル要件に簡単に適合させることができます。体系的に、参照溶液を用いて、新しいまたは自家製のマイクロコイルを較正する方法を説明する。キャリブレーション手順には、ヌテネーション曲線を使用したパルスパワーの測定が含まれます。RF分野均質性の推定;標準パルスシーケンスを使用して、ボリューム正規化信号対雑音比(SNR)を計算します。小さい生物学的サンプルのサンプル調製における重要なステップと、磁気感受性の違いなどの可能な緩和因子について考察する。最適化されたソレノイドコイルの用途は、ルートサンプルの高解像度(13 x 13 x 13 μm3、2.2 pL)3Dイメージングによって実証されています。
Introduction
磁気共鳴画像法は、ヒトから単一細胞1、2、3まで、多種多様な生物学的標本を非侵襲的に画像化する汎用性の高いツールである。医療用画像用途用のMRIスキャナは、通常、1.5 T~3 Tの磁場強度を有する磁石を使用するが、単一細胞用途は、より高い磁場強度1、3、4で画像化される。100マイクロメートル以下の解像度での標本の研究は、磁気共鳴顕微鏡(MRM)5と呼ばれています。しかし、MRMは、他の利用可能な顕微鏡またはイメージング技術(例えば、光学顕微鏡またはCT)と比較して、低信号対雑音比(SNR)に苦しんでいます。SNR 6 を最適化するためにいくつかのアプローチを追求することができます。1 つのアプローチは、より高い磁場強度を使用する方法ですが、相補的なアプローチは、個々のサンプルの信号検出器を最適化することです。後者の場合、検出器の寸法は、目的のサンプルの寸法に合わせて調整する必要があります。直径が≈0.5〜2mmの小さいサンプル(例えば、根組織)の場合、マイクロコイルは、SNRがコイル直径6,7に反比例するので有用である。7.8 x 7.8 x 15 μm3の解像度は、専用のマイクロコイル8を使用して動物細胞で達成されています。さまざまなマイクロコイルタイプが存在し、塗布と組織の幾何学的形状に応じて最も一般的に使用される平面コイルとソレノイドコイルが存在する。平面コイルは表面に近い高感度で、薄いスライスでの用途に役立ちます。例えば、パーフューズ組織をイメージング用に特別に設計された方法が、平面マイクロコイル10について説明されている。しかし、平面コイルは感度の高いフォールオフと明確に定義された基準パルスパワーを持っていません。ソレノイドコイルは、円筒形であり、より広い範囲の用途を有し、より厚いサンプルに好まれる。ここでは、ソレノイドコイルの特性、マイクロコイルMRI用のサンプルを調製するプロトコル、ならびにソレノイドマイクロコイルの較正について説明する(図1A)。
ソレノイドコイルは、サンプルを保持するキャピラリーの周りにコルクスクリューのようにコイル状の導線で構成されています(図1B)。マイクロコイルアセンブリは、エナメル銅線、コンデンサの品揃え、およびコンポーネントをはんだ付けするための適切なベースのみを使用して構築することができます(図1B)。主な利点は、シンプルさと低コスト、単位容積あたりのSNRおよびB1フィールド均質性の点で良好な性能特性と組み合わされる。構造の容易さはコイルの設計および幾何学の速い反復を可能にする。ソレノイドマイクロコイル設計およびプローブ特性評価の具体的な要件(すなわち、様々なコイル幾何学に関するエレクトロニクス、ワークベンチ測定、および分光計測定の理論)は、他の地域7、11、12、13、14に広く記載されている。
ソレノイドコイルは、他の15,16に記載されているガイドラインに従って、所望の寸法の設計規則を念頭に置いて構築することができます。この特定のケースでは、直径1.5mmのキャピラリーを中心にループした直径1.5mmのエナメル銅線から作られたコイルを使用しました。このソレノイドは、回路が作られたベースプレート上に保持され、調整コンデンサ(2.5pF)、可変一致コンデンサ(1.5-6 pF)、銅接続線(図1A、1C)で構成されています。チューニングコンデンサは950 MHzの望ましい共振周波数を達成するために選択され、マッチングコンデンサは50オームのインピーダンスで最大の信号伝送を達成するために選択されます。大きいコンデンサはより細かい調節を可能にする可変である。通常の操作では、プローブベースのコンデンサを使用してチューニングとマッチングが行われます。組み立てられたマイクロコイルは、磁石に挿入できるようにプローブに取り付ける必要があります。システムによっては、追加のホルダーが必要な場合があります。ここでは、Micro5プローブと組み合わせて、ブルカーコンソールAvance III HDと22.3 T磁石の組み合わせを使用します。この場合、プローブの1Hチャンネルに接続するために必要な接続を備えた修正されたサポート挿入物を使用しました(図1A)。
コイルの感受性に一致した設計には、サンプル17に近接している銅コイルから生じる感受性の不一致を減らすために、パーフルオロ化された液体を備えたリザーバが含まれる。プラスチック製のシリンジから作られた貯水池がコイルを囲み、フォーブリンで満たされました。パーフルオロ化された液体はコイルを囲む必要があるので、サンプルに対して利用可能な直径は1mmの外径に減少する。サンプル交換を容易にするために、サンプルは外径1mm、内径700μmのキャピラリーで調製した。サンプル調製に必要なツールを図 2Aに示します。
基本的な実験MRパラメータは、勾配システム、フィールド強度、およびコンソールを含む、使用されるシステムのハードウェアに大きく依存しています。システムの性能を説明するためにいくつかのパラメータを使用することができ、その中で90°パルス長と電力 、B1-均質性および単位体積当たりのSNR(SNR /mm3)が最も実用的に関連しています。SNR/mm3 は、同じシステム18上の異なるコイルの性能を比較するのに便利です。システム間でハードウェアの違いが存在する場合がありますが、ベンチマーク・プロトコルの均一な適用により、システム・パフォーマンスの比較も容易になります。
このプロトコルは、キャリブレーションとサンプル調製に焦点を当てています。ソレノイドマイクロコイルの性能の段階的な特性を示しています: 90°パルス長または電力を較正;RF-フィールドの同質性を評価する;単位体積あたりの SNR の計算 (SNR/mm3) を計算します。ファントムを用いた標準化されたスピンエコー測定は、コイル設計の比較を容易にするため、個別のアプリケーションの最適化を可能にする。マイクロコイルに特異的な幻影および生物学的試料試料調製物について説明する。このプロトコルは、市販のマイクロイメージングシステムを備えた任意の適切な狭孔(≤60mm)垂直磁石に実装することができる。他のシステムでは、ガイドラインとして機能し、いくつかの調整で使用することができます。
MRI測定のための生物学的標本調製は、通常、検体が可能な限りそのままの画像化されているため、あまり広範囲ではない。しかし、生体組織の空気空間は、磁気感受性の違いのために画像のアーティファクトを引き起こす可能性があります 19.磁界強度が20に増加すると効果が高まる。したがって、空気空間は高いフィールド強度で避けるべきであり、これは組織の周りの空気と組織構造内の空気空間の除去を避けるために流体中のサンプルの浸漬を必要とする可能性があります。具体的には、マイクロコイルが採用される場合、所望のサンプル組織の切除が必要であり、続いて適切な流体に浸す必要があります。その後、サンプルを切り取り前の毛細血管に挿入し、最後に毛細管を毛細血管ワックスで密封します。接着剤の代わりにシール剤としてワックスを使用すると、封止または代替物、試料が容易に抽出され得る。この手順は、 メディカゴトランカトゥーラ、 小さな豆類植物の根に実証されています。このプロトコルの利点は、MRI測定中にサンプルが破壊されないので、光学顕微鏡でMRIデータの後続の共登録の可能性です。
提示されたプロトコルは、その場での測定における高い空間分解能に適しており、より精巧な設計により、生命維持システムに関連する課題に対処する必要がある生体内サンプルのイメージングが可能になる可能性があります。
Protocol
注: このプロトコルは、1.5 mm 内径 (ID) ソレノイドコイルのコイル特性の使用および評価の手順を説明します (図 1)。プロトコルを実証するために使用されるコイルは、感受性に一致した貯水池に収容されていますが、プロトコルは比類のないコイルにも同様に適用可能です。プロトコルは他のサイズおよび異なった分光計のセットアップに合わせることができる。
1. 参考サンプルの準備
- 100 mLの感度参照溶液を調製し、CuSO4∙ 5H2Oの156.4 mgを、100 mL GL45フラスコに含まれるD2Oの80 mLに溶解する。硫酸銅は、T1とT2の緩和時間を短縮し、より迅速な測定を可能にし、D2Oは放射線減衰および飽和効果を防ぎます。固形物が完全に溶解するまで手動でかき混ぜます。
- 1 g/L CuSO4 (無水、6.3 mM) の最終濃度のための脱イオン水を使用して、体積を 100 mL に調整します。この濃度は、T1およびT2緩和を短くするのに十分であるが、沈殿の影響を受けるには高すぎない。参照試料をシールして、H2O:D2Oの比率を変化させない。
- 必要に応じて、プローブをネットワークアナライザに接続し、望ましい共振周波数でコイルが共鳴しているかどうかをテストします。S11 反射率試験を行い、Haaseらら14で詳細に説明したように、チューニングによって達成される周波数範囲およびQ-ファクター測定に対して測定する。同軸ケーブルを使用して、マイクロコイルをネットワークアナライザに接続します。必要に応じてBNCアダプタケーブルを使用します。
- コイルの設計対象となる磁場強度に応じて、ネットワークアナライザの中心周波数を希望の共振周波数に設定します。次に、スイープ幅を10 MHzに設定します。
- 中心周波数の反射率レベルと-7 dBレベルでの周波数f1とf2を記録します。Haaseら14に従って-7 dBレベルでのQ係数を計算するためにこれらを使用します。
2. サンプル準備
- コイルキャリブレーション用の参考サンプルを用意する場合は、CuSO4 溶液1 mLを実体顕微鏡下で時計ガラス皿に移します。
- 生体試料を調製する場合、1 mLのパーフルオロデカリン(PFD)を顕微鏡で時計ガラスに移し、試料を沈水させるために使用します。PFDは、生体細胞に入ることなく、試料中の空気空間を満たすことができるように使用される。また、プロトンMRIでは観察できません。PFDが必要になる前に、すぐにペトリ皿の蓋で時計ガラスを覆い、蒸発損失を防ぎます。
注:PFDは非常に揮発性と強力な長期的な温室効果ガス21です。その酸素溶解特性とその低粘度が要求されない場合、観察可能な 1H信号をも与えないパーフルオロエーテルであるFomblinに置換してもよいが、17のように速く蒸発しない。 - 適切な外径の毛細血管をサイズにカットし、マイクロコイルホルダー(18mm)の直径の内側に収まり、再配置を可能にする(図1C)。セラミックカッターを使用して10〜12mmごとに切開を行い、切開点を慎重に破ります。
- 参考サンプルを用意する場合は、ピンセットと実体顕微鏡を使用して、CuSO4 溶液の表面に接触する前カットの毛細管を時計ガラスの中に持ち込み、毛細血管を満たします。
- 生体試料を調製する場合は、ピンセットと実体顕微鏡を使用して、時計ガラスの内部にPFDの表面に接触する前カット毛細管を持ち込み、毛細管を完全に満たすためのキャピラリー作用を可能にする。キャピラリーを時計ガラスに放して完全に水没するようにします。
- パーライト土壌置換などの成長基材から5週間前の根系全体を慎重に抽出します。根のサンプルを細心の注意を払って根茎をきれいにしてください。ピンセットを使用して大きな土壌粒子を除去し、より小さな粒子が存在する場合は、蒸留水で根系を洗浄することによってそれらを除去する。将来の参考のために必要な場合は写真。メスを使用して根茎を含まない繊維状根の小さな部分を選択して切除する。
- 真空処理のために、適切な固定溶液を含む1.5 mLチューブにサンプルを入れる。チューブキャップを外したまま、パラフィルムでチューブを密封してチューブの開口部を密封します。次に、チューブの通気を可能にする鋭利なツールでフィルムに穴を開けます。
- サンプルチューブを真空チャンバーに入れ、チャンバーを密封し、ラボの膜真空ポンプをチャンバーに接続します。試料を最大30分間真空処理し、生物学的試料内のエアポケットの存在を低減する。気泡がサンプルから逃げ出さない場合は、真空処理を停止します。
- 実体顕微鏡を見ながら、ピンセットを使用して、先に作成した浸潤培地中に試料を沈下します。潜在的な破片のサンプルを洗います。
- ピンセットを使用して毛細血管にサンプルを挿入し、毛細管とサンプルの両方が完全に水没して気泡が含まれないようにします。より小さい毛細管または注射針の先端を押し出す棒として使用する(図2B)。
- ピンセットを使用して、中型時計ガラスからサンプルキャピラリーを取ります。PFDの場合は、ペトリ皿の蓋を覆います。
- ティッシュペーパーを細かい点に整え、毛細血管の両端から1mm前後の液体を取り除きます。
- ワックスペンを使って少量の毛細管ワックスを溶かします。両面にワックスを塗ります。ワックスは固化すると不透明になります。気を抜く気、毛管から気泡を除外する(図2C)。
注:完成したサンプルが冷却されたときに、キャビテーションポケットと同様に爆発的な沸騰を引き起こす可能性があるため、ワックスや毛細血管の過熱は避けてください。 - その後、メスを使用して毛細血管の外側から余分なワックスを削り取り、細かいティッシュペーパーできれいに拭きます。
3. サンプルの取り付け
- 実体顕微鏡の下にマイクロコイルを置き、マイクロコイルを安定したままピンセットを使用してサンプルを挿入します(図2D)。
- ソレノイドコイルの内側にキャピラリーをスライドさせて、マイクロコイル内のサンプルを中心にロッドを使用します。
- 必要に応じて、毛細血管の位置を固定するために粘着テープを適用します。
- キャピラリーを検査して、ソレノイドコイルの内部に気泡が見えないようにして、感受性の違いによって生じるMR信号破壊を避けます。
- マイクロコイルを直立したまま、プローブベースのソケットにマイクロコイルを取り付けます(図3A,3B)。
- 3軸の勾配コイルをマイクロコイルの上に慎重にスライドさせながら、勾配の水冷コネクタをプローブベースのコネクタに合わせます(図3C)。プローブベースのねじを回して、勾配を固定します。
注: この手順は、Micro5 プローブにのみ適用されます。Micro2.5やBiospectのような他のシステムの場合、勾配はコイルとは別のソケット上にあります。
4. コイル特性の決定
- コイルが初めてテストされる場合は、リファレンスサンプル溶液を使用して均質サンプルを作成し、電力校正および B1 均質性テストに役立ちます。コイルワイヤによる潜在的な感受性の問題は、この参照サンプルで容易にテストされ得る。
- プローブを磁石に挿入し、RF送信/受信ケーブル、水冷線、熱電対ケーブル、空冷線などの必要なケーブルを接続します。
- 水冷ユニットの水冷温度(推奨298K)を設定します。
- 目標温度(298K)と目標ガス流量(300L/h)を設定します。ガスの流れは、コイルの設計やサンプルの体積が異なる場合があります。これは、温度制御システムを持つシステムにのみ適用されます。
注:次のステップは、新しい(自家製)コイルをテストする場合にのみ必要です。 - 50 Ωの同軸ケーブルを使用して、意図した共振周波数を中心とした適切に広いスイープ幅(400 MHz)のネットワークアナライザにプローブを接続します。
- プローブベースに存在する変数マッチングと調整コンデンサを調整することで、共振モードを観察します。
- 共振モードを調整し、希望の周波数に合わせて調整します。
- 必要に応じて、ネットワーク アナライザのコイル品質係数 (Q 係数) を決定します。品質因子を得る方法の1つは、カップリングネットワークを用いて、中心周波数(fc)を-7dB(すなわち、Q=fc/(f1-f2)14で反射ディップの幅で割る。 fcを磁石の動作周波数に設定し、f1とf2はそれぞれfcの左右の-7 dB点に設定します。一部のネットワーク アナライザには、Q ファクター判定が組み込まれています。
- 通常はウォブルカーブと呼ばれるスキャナーの反射率テストを開始し、必要に応じて調整とマッチングを調整します。新しいコイルの範囲の中点にチューニングとマッチングコンデンサを設定することをお勧めします。そのため、高いスペクトル スイープ幅から開始します。ネットワーク アナライザで磁石の外側のコイルを調整し、一致させる方が便利な場合もあります。
- 使用可能な場合は、イメージングプローブの最大ボリュームコイルの shim ファイルを選択します。以前に使用したコイルから開始する場合は、利用可能な shim ファイルを使用します。両方のオプションが使用できない場合は、すべての shim 値を 0 に設定して開始します。
- マイクロコイルがイメージングソフトウェア(ParaVision)で利用可能な場合は、正しいコイル構成を 選択します。それ以外の場合は、システムのマニュアルに従ってコイルの仕様に一致する新しいコイル構成を作成します(例えば、シングルチューニングまたはダブルチューニング)。この研究で使用されるこのソレノイドマイクロコイルの安全限界の推定値は、1Wピークパワーで1ミリ秒、連続電力1mWです。
注意: マイクロコイルに必要な小型コンデンサ(通常は1mmの大きさ)は、高い感度で、高電圧で簡単に損傷を受けます。自動パルスパワーの測定は、非標準コイルでは機能せず、高いパワーが原因でコイルや分光器の他の部分に損傷を与える可能性があります。したがって、手動での調整をお勧めします。 - 新しいコイルの電解曲線を記録して、コイルの正しいRF電力の表示を取得します(図4)。コイルの安全限界が不明な場合は、0.6 Wの低パルス出力で10 μsから始め、信号が現れるまでパルス長を一度に1 μsずつゆっくりと増やします。
- 勾配符号化がない場合にFID実験を使用して、パルス電力を一定に保ちながら、RFパルス長を系統的に変化させます。理想的なパルス長はパルス長で、信号強度が最大値に達します。新しいコイルをテストする場合は、最初に非常に低い電力で10 μsパルスを使用し、パルスパワーを徐々に増加させます。
メモ:コイル特性と分光計の組み合わせで電力が予想よりもはるかに高い場合、これはすでに間違った共振モードが選択されていることを示しています。 - 同種B1-フィールドを有するコイルについては、ソレノイドコイルのように、信号強度がゼロ22に減少する180°パルスを求める。
- 勾配符号化がない場合にFID実験を使用して、パルス電力を一定に保ちながら、RFパルス長を系統的に変化させます。理想的なパルス長はパルス長で、信号強度が最大値に達します。新しいコイルをテストする場合は、最初に非常に低い電力で10 μsパルスを使用し、パルスパワーを徐々に増加させます。
- 決定した90°パルスパワーを作成した研究の調整カードにセットします。ParaVisionでは、リファレンスパワー調整カードを使用して、ハードパルス電源を入力できます。
- ローカライザスキャンを使用して、3つの主軸のそれぞれで1つのスライスをスライスし、磁石内のコイルの位置を特定します。これを行うには、分光器のデフォルトライブラリからローカライザースキャンをロードします。オフセットのない大きな視野から始めることをお勧めします。受信機のゲイン調整を自動化して手動で測定を開始します。
注: サンプルがグラデーションシステムの中心にある場合、ローカライザスキャンでサンプルが表示されます。コイルまたはサンプルがイメージスライスの中央に配置されていない場合、ローカライザースキャンを調整する必要があり、その場合、ステップ 4.12 を再度実行する必要があります。 - あるいは、画像評価に基づいて正しい90°パルスを見つけるために相補的な方法を使用します。ヌテネーション曲線を使用してパルスパワーが見つかったら、パルスパワーを徐々に調整して、B1-フィールド均質性の画像を確認します。不等分のB1フィールドを有する一部のコイルでは、90°パルスパワーをヌットカーブで測定すると過大評価され、コイルの所望のスイートスポットでの転倒につながる可能性があります。この場合、参照パルスパワーを下げ、新しい画像を前の画像と照合します(図5)。
- FID信号に基づいて磁界を手動でシムします。初期シミングの推奨順序は Z-Z2-Z-X-Y-Z-Z2-Z-XY-XZ-YZ-Z です。ソレノイドの場合、主な対称軸はXY平面にあります。したがって、異なる方向のシムは、このコイル構成に対する B0 均質性のより強い補正をもたらす可能性がある。高次シムはほとんど効果を持たず、無視される可能性があります。
- ボリューム正規化 SNR を計算して、メーカーのプロトコル18から適合した、異なるシステム間でマイクロコイル特性を比較できるようにします。ここで使用するマイクロコイルでは、視野(FOV)6 mm x 6 mm、繰り返し時間(TR)1000ミリ秒、エコー時間(TE)7 ms、マトリックス256 x 256、スライス厚= 0.5mmのスピンエコーシーケンスを使用しました。受信機のゲインが一元的になるまでスライスの厚さを調整します。次に、スライスが B1-フィールドの同質性の領域を超えて伸びるようにスライスの数を調整します。可能であれば、信号平均なしで画像を記録します。
- 2 つの手順で、ボリュームの正規化された SNR (SNR/mm3)を確認します。まず、ボクセルボリューム(Vボクセル)(Eq. 1)を計算します。
(1)
注: D x、D y、D スライスの単位は mm です。この計算も同様に、一連のスライスに対して実行できます。 - 目的の領域を選択して、サンプルの信号強度(μROI)、サンプル外の領域(すなわち、ノイズ)の信号強度(μノイズ)と標準偏差(σノイズ)を決定します。平均信号は画像の中心から取得され、ノイズ信号はコーナーパッチから計算されます(図6)。分光計制御ソフトウェアまたは汎用画像処理ソフトウェアのいずれかが、これらの計算に使用され得る。可能であれば、単一の繰り返しを使用して、異なるコイル間の比較可能性を維持します。
- 値を使用して、ボリューム正規化 SNR (Eq. 2) を計算します。
(2)
ここで使用するコイルと参照溶液を組み合わせて使用する場合、Eq. 2 を使用すると、次のソリューションが得られます。
(3)
注:異なる磁場強度でコイルのSNRを比較する場合、非常に長い繰り返し時間と非常に短いエコー時間が使用されていない限り、ファントムの緩和特性を23を測定する必要があります。
- 2 つの手順で、ボリュームの正規化された SNR (SNR/mm3)を確認します。まず、ボクセルボリューム(Vボクセル)(Eq. 1)を計算します。
- 磁場の不均一性による感受性の問題をチェックする:荷重を行い、複数の勾配エコー(MGE)シーケンスを実行する(図7)。この場合、エコー時間が長いため、画像内では磁場の不均一性が見られます。このようにして、試料中の不均一性(試料中の空気空間による)、ならびにコイル材料によって導入されるB0 フィールドの不均一性を可視化することができる。使用する分光計とコイルの仕様に応じて調整される次のパラメータを使用してください:TR 200 ms、48エコー付きTE 3.5 msは3.5 ms離れて間隔をあけて、フリップ角度30度。マトリックスサイズ 128 x 128。
注: 共鳴(ウォブル)カーブで複数の(電位)共鳴モードまたは反射ディップが観測された場合は、各共振モードに対して上記の手順を繰り返して、最も感度の高いモードを決定します。マイクロコイルによっては、マイクロコイルアセンブリの異なる部分が意図しない共鳴モードになりやすい場合があります。
(1)
(2)
(3)5. 高解像度イメージング
- 3D-FLASH 実験を実行するには、TR 70 ms、TE 2.5 ms、128 x 64 x 64 のマトリックス サイズ、FOV 1.6 x 0.8 x 0.8 mm、フリップ角度 30°、およびレシーバ帯域幅 50 kHz を使用します。
- 前に決定した基準パルスパワーからパルスパワーを導出します。これはほとんどのイメージングソフトウェアで自動的に行われます。自動調整を使用して受信機のゲインを決定します。必要に応じて FOV を調整し、オブジェクト全体を両方のフェーズ エンコード方向に覆い、エイリアスを回避します。システムで利用できる場合は、勾配デューティサイクルシミュレーションを実行して、実験のデューティサイクルが勾配コイルの仕様内に収まるかどうかを確認します。
注: これらのパラメータは、デモンストレーションに使用されるコイルに固有のものです。ローカル システムの詳細に最適化することが重要です。
6. さらなる研究や保管のためのサンプルの回収
- マイクロコイルからサンプルキャピラリーを取り除く。
- ピンセットを使用して、実体顕微鏡下でワックスプラグを取り外します。
- 注射器を使用して、選択した溶液で毛細血管からサンプルを洗い流します。あるいは、ガラスプッシャーロッドを使用してサンプルを排出します。
- 試料の脱水を防ぐために、保存に適した培地に保管してください。
Representative Results
コイル特性評価
コイルの調整とマッチングが成功すると、その性能はコイルQファクター、90°基準パルス、およびSNR / mm3によって特徴づけられるかもしれません。ここで示した1.5 mm IDの感受性に一致したソレノイドコイルの場合、測定されたQファクター(アンロード)は244であり、5mmバードケージコイルの場合は561でした。
基準90°パルスは、0.6 Wの電力レベルで12 μsであった。5 mm の鳥かごコイルの場合は 45 W で 5 μs (図 4および図 5)。これは、マイクロコイルに0.53 mT、鳥かごコイル14に対して1.17mTを用いて、rfパルスフィールド強度(B1) 
に相当し、yはジャイロ磁性比であり、タウはパルス持続時間である。パルス電力レベル(P)は異なるため、コイルは送信効率の点で比較され得る 
:0.69 mT/W1/2および0.18 mT/W1/2のマイクロコイルと鳥かごそれぞれ14。90°パルスで比較すると、マイクロコイルは鳥かごコイルよりも4倍敏感≈因子であることが分かります。
感受性マッチングの効果
超高磁場強度では、 図7A,7Bに見られるように、サンプルとコイル感受性が画質の主要な要因となります。流体貯蔵所に感受性が一致しないコイルと比較して、信号は参照サンプル内でより長く均質に保持される。しかし、感受性リザーバに起因して、最大サンプル寸法は、リザーバのないコイルに対して減少する。
高解像度イメージング
メディカゴトランカトゥーラ根試料の13 x 13 x 13 μm3の高解像度を20時間23分で達成した(図8)。根の表面から始めて、根皮質は、根の外側にいくつかの残留水と一緒に見られます。さらに、このxylemは、フロエムを囲む暗いバンドとして観察される。一部のエアポケットは、完全な信号損失を伴う暗いスポットとして観察されます。
M. トランカトゥーラの共生根結節もこのプロトコルを用いて画像化されてもよい (図9)。わずかに大きな比類のないコイル(長さ約3500 μm、内径1500 μm)を使用して、最大16 x 16 x 16 μm3の解像度の画像を33分で得ました。
図1:ソレノイドマイクロコイル。(A)ソレノイドコイルの設計は、通常、毛細血管の周りに巻かれた、ヘリカルにループワイヤーで構成されています。配線の太さ、直径、巻線数、配線間隔などのワイヤのジオメトリは、コイル特性に影響を与えます。(B) 感受性整合液(Fomblin)のための貯蔵所が付いた自家製ソレノイドマイクロコイル。それは0.4 mm厚い塗られた銅ワイヤーの毛管のまわりで6回の毛管の外径および3500 μmのコイル長で構成される。コイルは、シリンジから作られた貯水池に沈む。外径1000μmまでのサンプルキャピラーを挿入できます。2つのコンデンサが使用され、インダクタとのシリーズの1.5 pFコンデンサと2番目の可変1.5-6 pFコンデンサがインダクタに平行に配置されます。すべてのコンポーネントは、グラスファイバーボード(黄色)にはんだ付けされています。それは貯蔵所を支えるために変える商業ホールダー(灰色のポリマー)に取付けられる。 (C)ソレノイドコイル設計部品:1.ソレノイドコイル、2.サンプルキャピラリー、3.1.5 pFチューニングコンデンサ、4.可変マッチングコンデンサ、5.グラスファイバーベースプレート、6.銅線リード。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:実体顕微鏡下でのサンプル調製。 (A) マイクロコイルの調製に必要な項目。左から順に:1.CuSO4 リファレンスソリューション、2.パーフルオロデカリン、3.マイクロコイル、4.メス、5.ポジティブテンションピンセット、6。ピンセット、7.毛細血管外径= 1000 μm、8.ワックスペン、9.毛細管ワックス、10。ニトリル手袋、11。実体顕微鏡、12.ペトリ皿カバー付きの時計ガラス、13。成長基質の植物材料。示されていない:ø 0.8 x 40 mmの針および細かいティッシュペーパーが付いている2 mLのシリンジ。(B) ピンセットを使用して毛細血管へのサンプル挿入をクローズアップし、両方とも水没状態に保つ。(C)溶融ワックスを用いた毛細管の密封。(D) マイクロコイルに調製した毛細管の挿入。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マイクロイメージングプローブの成分。(A)マイクロ5プローブベースは、水冷、加熱、温度センサ、勾配電力、RF(可視の同軸コネクタ)およびオプションでプローブ識別(PICS)に必要なすべての接続を含む。プローブベースの下には、可変チューニングとマッチングコンデンサの調整を可能にするノブがあり、プローブを分光器の中に固定するためのネジを保持します。(B) プローブベースの上に設置された自家製マイクロコイル。調律とマッチングが可能なプローブベースに取り付けられた可変コンデンサ(白いセラミック)に注意してください。(C) プローブベースに取り付けられた3軸勾配を水冷レセプタクルと金めっき接点で実装し、勾配を接地します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ヌテネーション曲線ヌテネーション曲線を取得して、基準パルスパワーを決定します。基準パルスパワー(90°パルス)は、Z方向のすべての磁化を横方向に反転するB1フィールドを生成するために必要なパワーとパルス長の組み合わせとして定義されます。一連のパルスは、グラデーション符号化がない場合に記録されます。パルスごとにパルス長またはパルスパワーが増加します。ここではパルスパワーは0.6Wに設定され、パルス長は毎回1μsずつ増加します。最大信号強度は、90°パルスを示し、約12 μsです。180°パルスは、最小強度を用いてこのように決定することもできる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:90°パルスパワーの視覚的な決定。一度、近似基準パルス電力がヌテネーション曲線を用いて検出されると、パルス長を変化させることにより目視で確認してもよい。コイルによっては、B1フィールドが変化に対して多かれ少なかれ敏感である場合があります。(A)11 μsパルス長さ。(B)12 μsパルス長、このコイルに最適。(C)13 μsパルス長さ。(D)20 μsパルス長さ。パルスパワーが高すぎると、オーバーティッピングが発生し、コイルの中央(矢印頭)の画像強度が低下する可能性があります。増加したB1分野はまた、画像の幅で観察することができるように、コイルの範囲を増加させる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 対象地域の配置 ボリューム正規化 SNR 計算の対象地域 (ROI) が表示されます。平均サンプル強度は、参照溶液サンプル内にあるROIから取得されます。平均ノイズと標準偏差は、画像の隅にある1つ以上のROIから計算されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:RF均質性を、勾配エコー画像法で評価する。複数のグラデーション エコー (MGE) シーケンスを使用して、一連のグラデーション エコーを使用して RF (B1 -Field) の同質性を評価します。基本的なパラメータは:繰り返し時間200ms、エコー数48のエコー時間3.5ms、エコー間隔3.5 ms、64平均、取得時間27 m 18 s、フリップ角度30°でした。視野は5 x 5 mm、マトリックス128 x 128、解像度39 x 39 x 200μm(A)の感受性に一致したコイルであった。RFコイルを取り囲む感受性整合液(Fomblin)は、コイルワイヤによる感受性の影響を低減します。小さな気泡はエコー時間が長くなるにつれて信号の損失を引き起こす。(B)同一のコイル径を持つコイル(感受性が一致しない)エコー時間が長い場合、B0フィールドの不均一性によって生じるアーチファクトの増加が観察される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:メディカゴトランカチュラルートセクションの3Dイメージング。(トップ)フラッシュ画像。根部のいくつかの特徴は、表皮(e)、皮質(c)、フロエム(ph)およびキシレム(xy)を含む区別することができる。根本原因のエアポケット(a)は完全な信号損失を引き起こす。基本的なパラメータは以下の通りであった:繰り返し時間70ms、エコー時間2.5ms、256平均、取得時間20時間23m。解像度13 x 13 x 13 μm3マトリックスサイズは128 x 64 x 64で、視野は1.6 x 0.8 x 0.8 mmでした。受信機の帯域幅 50 kHz。(下部)MSME イメージ。基本パラメータは以下の通りであった:繰り返し時間500ms、エコー時間5.2ms、28平均、取得時間15時間55m。解像度13 x 13 x 13 μm3マトリックスサイズは128 x 64 x 64で、視野は1.6 x 0.8 x 0.8 mmでした。受信機の帯域幅 70 kHz。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:メディカゴトランカチュラルート結節の3D画像化。(上) 低解像度の画像。基本的なパラメータは次の通りであった:繰り返し時間60ms、エコー時間2.3ms、4平均、取得時間4m。解像度31 x 31 x 31 μm3.マトリックスサイズは64 x 32 x 32で、視野は2 x 1 x 1 mmでした。受信機の帯域幅 50 kHz。(下部)高解像度のイメージ。基本的なパラメータは次の通りであった:繰り返し時間60ms、エコー時間2.3ms、8平均、取得時間33m。解像度16 x 16 x 16 μm3マトリックスサイズは128 x 64 x 64で、視野2 x 1 x 1 mmであった。受信機の帯域幅 50 kHz。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、多くの材料および地質学的サンプルがT2緩和時間を大幅に短くし、ここで使用される配列では画像化できないため、生物学的サンプルに最も適しています。高サンプルの磁気感受性不均一性を示す一部の生体組織でさえ、その効果が磁場強度24と相関するため、超高磁場での画像化が困難な場合がある。このプロトコルは、新しいコイルに役立つだけでなく、潜在的な問題のトラブルシューティングや診断にも役立ちます。新しいサンプルまたは未知のサンプルをテストする場合、このプロトコルは、実験のセットアップが仕様に従って機能していることを確認するために、参照ソリューションに事前に実行することができます。分光計は、アーティファクトや誤動作の原因として除外できるため、トラブルシューティングに役立ちます。さらに、プローブの調整およびマッチングコンデンサをマイクロコイルに典型的な値に設定します。
最初の実験で信号が記録されていない場合、ローカライザースキャンの視野を拡大して、サンプルが見られるかどうかを確認することができます。次に、コイルが正しく調整されているかどうかを再確認し、別のローカライザースキャンを試みます。コイルは、意図しない共振モードを追加する可能性があり、その場合、正しいものを決定する必要があります。まだ画像が得られない場合は、マイクロコイルアセンブリ内の位置を確認するためにサンプルを取り外し、サンプルが無傷であることを確認します(すなわち、シール内の気泡や漏れは存在しません)。最後に、試料はPFDの代わりに水で調製することができる。ローカライザースキャンでサンプルが検出可能な信号をほとんど与えなかった場合、キャピラリー内の周囲の水はまだ検出することができます。
マイクロコイルはサンプルに近いのが理想的なため、 図7Bに示すように、空気とワイヤの磁気感受性の差により、さらなる信号損失が生じる可能性があります。潜在的なアーティファクトには、空間的な誤マッピングや異常な信号強度の変動が含まれます。特に、グラディエントエコー型パルスシーケンスは、この不均一な信号損失の影響を受けます。このため、フッ素液(FomblinまたはFC-43)にワイヤを沈め、感受性に一致したコイルを提示した。このプロトコルに含まれる B1 推定法は 、B1 感受性の違いがコイルアセンブリの設計に感受性マッチング戦略を含めることを保証するかどうかを判断するのに役立ちます。感受性一致コイルを構築するための別のアプローチは、感受性一致電線25を使用することです。さらに、コイルによる感受性の問題だけがこのアプローチで対処されます。サンプル内の感受性の不一致(例えば、空気空間による)は依然として困難である。
エアポケットまたは気泡は、空気と流体または試料19 の界面での感受性の違いによって引き起こされる広範な信号損失を引き起こす実験的課題を提起する(図5A)。サンプル調製に成功する上で重要な点は、サンプルと毛細血管の両方の沈み込みである。ただし、小さな気泡でも、特にグラデーションエコータイプのシーケンスでは信号損失を引き起こす可能性があります。移動式気泡は、サンプルに接触するまで毛細血管を通って移動することができます。これらの効果のいくつかは、一方の端が他方よりも高くなるように毛細管をわずかに傾けることによって緩和することができます。傾斜により、サンプルを邪魔することなく、潜在的な気泡が上端に保持されます。脱水は大きな気泡を形成する可能性がありますので、毛細血管ワックスが良好なシールを形成することを確認することも重要です。
サンプル内部の空気空間については、PFDを用い、細胞膜26を貫通しない一方で細胞間空気空間を満杯にした。しかし、このアプローチでも、すべての空域を取り外す方法はできませんでした。さらに、このアプローチは、可能な限り非侵襲的にシステムを研究したいという願望のために通常好ましくない追加の薬剤が必要であることを意味します。
毛細血管の円筒形は、特に生検や生きている根材料の研究プロセスなど、腐敗に対して脆弱な組織に対して、灌流のセットアップが実行可能であるべきであることを意味します。2つのステップは、灌流のセットアップを実現することができます。まず、毛細管の両側に媒体供給管とドレインチューブを接続するだけで、チェモスタットを作り出すのに十分であろう。第二に、サンプル毛細血管へのインデントの付加は、流れの方向に対してサンプルを所定の位置に保持することができる。これは、平面マイクロコイル10に対して公開されたプロトコルに似ています。
MRイメージングの非侵襲的性質と、本プロトコルで使用される不活性液体(PFDまたはFomblin)と組み合わせることは、実験終了後、さらなる研究のためにそれらの毛細血管からサンプルを除去してもよい。組み合わせには、光学顕微鏡または電子顕微鏡およびその他の破壊的なイメージング技術が含まれます。我々は最近、 メディカゴトルンカチュラ 根結節27の光学顕微鏡との組み合わせを実証した。
超高磁場NMR分光計で専用マイクロコイルを用いた植物材料のイメージング方法を実証しました。比較的大きなサンプル量は、良好なRF均質性を有する高解像度で研究することができる。さらに、分光イメージングは、それ以外の場合よりも高い解像度で行うことができる。マイクロコイル設計をサンプルに適合させることは、コイル性能特性を決定する効率的な方法によって促進される。ソレノイドコイルアプローチは、動物組織を含む植物以外の他のサンプルにも容易に適用され得る。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
950 MHzの機器での実験は、オランダのNWO出資の国家ロードマップ大規模施設であるuNMR-NL(プロジェクト184.032.207)によって支えられました。R.S.はバイオソーラーセルズコンソーシアムプロジェクトU2.3によってサポートされました。J.R.K.はオランダ磁気共鳴研究学校(NMARRS)大学院[022.005.029]の支援を受けた。デフェン・シェンとトン・ビッセリングが メディカゴ・トランカトゥーラ のサンプルを提供してくれたことに感謝します。さらに、クラルチェ・フーベン、マリー・ルノー、ヨハン・ファン・デル・ズワンのuNMR-NL施設での技術サポートに感謝します。また、フォルカー・レーマン、ヘニー・ヤンセン、ピーター・デ・ワールドの技術支援に感謝します。フランク・ヴェルゲット、ジョン・フィリッピ、カルシック・B・サイ・サンカル・グプタの助言に感謝します。最後に、ビデオにナレーションを提供してくれたジェシカ・デ・ルイターに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference solution preparation | |||
| CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
| D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
| Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
| Sample preparation | |||
| Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
| Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
| Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
| Syringe | Generic | - | Used to apply PFD and manipulate the sample |
| Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
| Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
| Imaging Hardware | |||
| 22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
| Air cooler | Bruker GmbH | - | Used to regulate probe temperature |
| Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
| Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
| Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
| RF microcoil | Home-built | - | contains Fomblin |
| Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
| Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |
References
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