Summary
Um protocolo para estudar tecido biológico em alta resolução espacial usando microscopia de ressonância magnética de campo ultra-alto (MRM) utilizando microcoils é apresentado. Instruções passo a passo são fornecidas para caracterizar os microcoils. Finalmente, a otimização da imagem é demonstrada nas raízes das plantas.
Abstract
Este protocolo descreve um método de calibração de relação sinal-ruído (SNR) e método de preparação de amostras para microcoils solenoidais combinados com amostras biológicas, projetados para ressonância magnética de alta resolução (RM), também referido como microscopia mr (MRM). Pode ser usado em espectrômetros de ressonância magnética pré-clínicos, demonstrados em amostras de raiz de truncatula medicago . As microcervejarias aumentam a sensibilidade combinando o tamanho do ressonador de RF ao tamanho da amostra de interesse, permitindo assim maiores resoluções de imagem em um determinado tempo de aquisição de dados. Devido ao design relativamente simples, as microcovas solenoidais são simples e baratas de construir e podem ser facilmente adaptadas aos requisitos da amostra. Sistematicamente, explicamos como calibrar microcoils novos ou caseiros, utilizando uma solução de referência. As etapas de calibração incluem: determinação de potência de pulso usando uma curva de porção; estimativa da homogeneidade de campo RF; e calcular uma relação sinal-ruído normalizado de volume (SNR) usando sequências de pulso padrão. São discutidos passos importantes na preparação da amostra para pequenas amostras biológicas, bem como possíveis fatores mitigadores, como diferenças de suscetibilidade magnética. As aplicações de uma bobina solenoide otimizada são demonstradas por imagens 3D de alta resolução (13 x 13 x 13 μm3, 2,2 pL) de uma amostra raiz.
Introduction
A ressonância magnética é uma ferramenta versátil para a imagem não invasiva de uma grande variedade de espécimes biológicos, que vão de humanos a células únicas1,2,3. Enquanto os scanners de ressonância magnética para aplicações de imagem médica normalmente usam ímãs com uma força de campo de 1,5 T a 3 T, as aplicações unicelulares são imagens com pontos fortes de campo muito mais elevados1,3,4. O estudo de espécimes em resoluções abaixo de cem micrômetros é referido como microscopia de ressonância magnética (MRM)5. No entanto, o MRM sofre de uma baixa relação sinal-ruído (SNR) em comparação com outras técnicas disponíveis de microscopia ou imagem (por exemplo, microscopia óptica ou TC). Várias abordagens podem ser perseguidas para otimizar o SNR6. Uma abordagem é usar uma maior força de campo magnético, enquanto uma abordagem complementar é otimizar o detector de sinais para amostras individuais. Para este último, as dimensões do detector devem ser ajustadas para corresponder às dimensões da amostra de interesse. Para pequenas amostras que são ≈0,5-2 mm de diâmetro (por exemplo, tecidos radiculares), microcoils são úteis, pois o SNR é inversamente proporcional ao diâmetro da bobina6,7. Resoluções tão altas quanto 7,8 x 7,8 x 15 μm3 foram alcançadas em células animais usando microcoils dedicados8. Existem uma variedade de tipos de microcoil, com bobinas planares e solenoides mais comumente utilizadas dependendo da aplicação e geometria tecidual9. As bobinas planares têm alta sensibilidade perto de sua superfície, o que é útil para aplicações em fatias finas. Por exemplo, um método projetado especificamente para a imagem de tecido perfumado foi descrito para microcoils planar10. No entanto, as bobinas planares têm uma alta queda de sensibilidade e nenhum poder de pulso de referência bem definido. Bobinas solenoides, sendo cilíndricas, têm uma área mais ampla de aplicação e são mais favorecidas para amostras mais grossas. Aqui, descrevemos as características da bobina solenoide, um protocolo para preparar amostras para ressonância magnética de microacab, bem como a calibração de uma microcoil solenoide(Figura 1A).
A bobina solenoide consiste em um fio condutor enrolado, como um saca-rolhas, em torno de um capilar que segura a amostra(Figura 1B). Os conjuntos de microcarros podem ser construídos utilizando apenas fio de cobre esmaltado, uma variedade de capacitores e uma base adequada para soldar os componentes(Figura 1B). As principais vantagens são a simplicidade e o baixo custo, combinados com boas características de desempenho em termos de SNR por volume unitário e homogeneidade de campo B1. A facilidade de construção permite a iteração rápida de desenhos e geometrias da bobina. Os requisitos específicos de design de microcoil solenoides e caracterização da sonda (ouseja, a teoria da eletrônica, as medições da bancada e as medições de espectrômetros para uma variedade de geometrias de bobinas) foram descritos extensivamente em outros lugares7,11,12,13,14.
Uma bobina solenoide pode ser construída tendo em mente regras de design para as dimensões desejadas de acordo com as diretrizes descritas em outros lugares15,16. Neste caso específico, foi utilizada uma bobina com diâmetro interno de 1,5 mm, feita de fio de cobre esmaltado, de 0,4 mm de diâmetro, em torno de uma capilar de 1,5 mm de diâmetro externo. Este solenoide é mantido em uma placa base na qual um circuito é feito, composto por um capacitor de ajuste (2,5 pF), um capacitor de correspondência variável (1,5-6 pF) bem como fios de conexão de cobre(Figura 1A, 1C). O capacitor de ajuste é escolhido para alcançar a frequência ressonante desejada de 950 MHz, enquanto o capacitor correspondente é escolhido para alcançar a transmissão máxima de sinal a uma impedância de 50 Ohm. O capacitor maior é variável para permitir um ajuste mais fino. Em operação regular, a sintonia e correspondência são realizadas utilizando capacitores na base da sonda. O microcodo montado precisa ser montado em uma sonda para que possa ser inserido no ímã. Um suporte adicional pode ser necessário, dependendo do sistema. Aqui usamos uma combinação de ímã de 22,3 T com um Bruker Console Avance III HD em combinação com um teste Micro5. Neste caso, utilizamos uma inserção de suporte modificada equipada com as conexões necessárias para conectar ao canal 1H da sonda(Figura 1A).
O desenho compatível com a suscetibilidade da bobina inclui um reservatório com líquido perfluorado para reduzir incompatibilidades de suscetibilidade, decorrentes da bobina de cobre estar próxima da amostra17. Um reservatório foi feito de uma seringa de plástico para fechar a bobina e preenchido com fomblin. Como o líquido perfluorado precisa incluir a bobina, o diâmetro disponível para uma amostra é reduzido a um diâmetro externo de 1 mm. Para facilitar a troca da amostra, a amostra foi preparada em capilar com diâmetro externo de 1 mm e diâmetro interno de 700 μm. As ferramentas necessárias para a preparação da amostra são mostradas na Figura 2A.
Os parâmetros básicos de Ressonância Magnética experimentais são altamente dependentes do hardware do sistema utilizado, incluindo sistema de gradiente, força de campo e console. Vários parâmetros podem ser usados para descrever o desempenho do sistema, dos quais 90° comprimento de pulso e potência, B1-homogeneidade e volume SNR por unidade (SNR/mm3), são os mais praticamente relevantes. O SNR/mm3 é útil para comparar o desempenho de diferentes bobinas no mesmo sistema18. Embora as diferenças de hardware entre os sistemas possam existir, a aplicação uniforme de um protocolo de benchmarking também facilita a comparação do desempenho do sistema.
Este protocolo se concentra na calibração e preparação da amostra. A caracterização stepwise do desempenho de microcoils solenoides é mostrada: calibrando o comprimento ou potência do pulso de 90°; avaliar a homogeneidade de campo RF; e cálculo SNR por unidade de volume (SNR/mm3). Uma medição padronizada de spin-echo usando um fantasma é descrita para facilitar a comparação dos desenhos da bobina, o que permite a otimização de aplicações distintas. São descritas preparações de amostras de amostras fantasmas e biológicas, específicas para microcoils. O protocolo pode ser implementado em qualquer ímã vertical de furo estreito (≤60 mm) adequado equipado com um sistema de microimagem comercialmente disponível. Para outros sistemas, ele pode servir como uma diretriz e pode ser usado com alguns ajustes.
A preparação de amostras biológicas para medições de ressonância magnética geralmente não é muito extensa, uma vez que o espécime é imageado o mais intacto possível. No entanto, espaços aéreos no tecido biológico podem causar artefatos de imagem devido a diferenças na suscetibilidade magnética19. O efeito aumenta com o aumento da força do campo magnético20. Assim, os espaços aéreos devem ser evitados com pontos fortes de campo elevado, e isso pode exigir a imersão da amostra em um fluido para evitar o ar ao redor do tecido e a remoção de espaços de ar dentro das estruturas teciduais. Especificamente, quando os microcoils são empregados, a excisão do tecido amostral desejado pode ser necessária, seguida por submergir-lo em um fluido adequado. Isso é seguido pela inserção da amostra em um capilar pré-cortado, e finalmente selando o capilar com cera capilar. Usar cera como selante em vez de cola, vedação de chamas ou alternativas, significa que a amostra pode ser facilmente extraída. Este procedimento é demonstrado na raiz do Medicago truncatula, uma pequena planta leguminous. Uma vantagem deste protocolo é o potencial para o co-registro subsequente de dados de ressonância magnética com microscopia óptica, uma vez que a amostra não é destruída durante a medição da ressonância magnética.
O protocolo apresentado é adequado para medições de alta resolução espacial in situ, e projetos mais elaborados poderiam permitir amostras de imagens in vivo, onde desafios relacionados aos sistemas de suporte à vida precisariam ser enfrentados.
Protocol
NOTA: Este protocolo descreve procedimentos de uso e avaliação das características da bobina de uma bobina solenoide de diâmetro interno de 1,5 mm (ID)(Figura 1). A bobina usada para demonstrar que o protocolo está alojada em um reservatório compatível com suscetibilidade, mas o protocolo é igualmente aplicável a bobinas incomparáveis. O protocolo pode ser adaptado a outros tamanhos e configurações de espectrômetros diferentes.
1. Preparação da amostra de referência
- Para preparar 100 mL da solução de referência de sensibilidade, dissolva 156,4 mg de CuSO4 ∙ 5 H2O em 80 mL de D2O contido em um frasco GL45 de 100 mL. O sulfato de cobre reduz o tempo de relaxamento T1 e T2, permitindo medições mais rápidas, enquanto o D2O previne efeitos de amortecimento de radiação e saturação. Mexa manualmente até que os sólidos estejam completamente dissolvidos.
- Ajuste o volume para 100 mL utilizando água deionizada para uma concentração final de 1 g/L CuSO4 (anidro, 6,3 mM). Esta concentração é suficiente para encurtar o relaxamento T1 e T2, mas não muito alto para ser afetado pela precipitação. Sele a amostra de referência para evitar alterar a razão de H2O: D2O.
- Opcionalmente, conecte a sonda a um analisador de rede, para testar se a bobina ressoa na frequência de ressonância desejada. Realize um teste de reflectância S11 para medir a faixa de frequência alcançada pela sintonia e para medições de fator Q, conforme descrito em detalhes por Haase et al.14. Conecte o microcoil ao analisador de rede usando um cabo coaxial. Use um cabo adaptador BNC, se necessário.
- Defina a frequência central no analisador de rede para a frequência ressonante desejada, dependendo da força de campo magnético pretendida para a qual a bobina é projetada. Em seguida, ajuste a largura de varredura para 10 MHz. Ajuste o capacitor variável no conjunto de microacavais, se presente, para ajustar o mergulho de reflectância à frequência desejada.
- Regisso nível de reflectância na frequência central e na frequência f1 e f2 no nível de -7 dB. Use-os para calcular o fator Q no nível de -7 dB de acordo com Haase et al.14
2. Preparação da amostra
- Se preparar uma amostra de referência para calibração da bobina, transfira 1 mL de solução CuSO4 para um prato de vidro de relógio sob um estereótipo.
- Se preparar uma amostra biológica, transfira 1 mL de perfluorodecalina (PFD) em um vidro de relógio sob um estereóscópio, que será usado para submergir a amostra. A PFD é usada, pois pode preencher espaços aéreos no espécime, sem entrar em células biológicas. Também não é observável pela ressonância magnética de prótons. Cubra imediatamente o vidro do relógio com uma tampa de placa de Petri para evitar perdas evaporativas, antes que o PFD seja necessário.
NOTA: O PFD é altamente volátil e um potente gás de efeito estufa de longo prazo21. Quando suas propriedades de dissolução de oxigênio e sua baixa viscosidade não são necessárias, ela pode ser substituída por Fomblin, um perfluoroether que também não dá sinal 1H observável, mas que não evapora tão rapidamente17. - Corte os capilares de diâmetro externo adequado ao tamanho, para caber dentro do diâmetro do suporte de microcerba (18 mm) e permitir o reposicionamento(Figura 1C). Use um cortador de cerâmica para fazer uma incisão a cada 10-12 mm e quebrar cuidadosamente no ponto de incisão.
- Se preparar uma amostra de referência, use pinças e estereotipos para trazer um capilar pré-cortado em contato com a superfície da solução CuSO4 dentro do vidro do relógio, permitindo que a ação capilar preencha o capilar.
- Se preparar uma amostra biológica, use pinças e um estereotipado, para trazer um capilar pré-cortado em contato com a superfície do PFD dentro do vidro do relógio, permitindo que a ação capilar preencha totalmente o capilar. Solte o capilar no vidro do relógio para que ele fique totalmente submerso.
- Extrair cuidadosamente um sistema radicular inteiro de cinco semanas de seu substrato de crescimento, como uma substituição de solo perlite. Limpe a amostra raiz meticulosamente de rizosheath. Remova grandes partículas do solo usando pinças, e se partículas menores estiverem presentes, remova-as lavando o sistema radicular com água destilada. Fotografia, se necessário para referência futura. Selecione e extirpar uma pequena seção de raiz fibrosa livre de rizosheato usando um bisturi.
- Para o tratamento a vácuo, coloque a amostra em um tubo de 1,5 mL contendo uma solução fixativa adequada. Deixe a tampa do tubo desligada e, em seguida, sele o tubo com parafilme para selar a abertura do tubo. Em seguida, faça furos no filme com uma ferramenta afiada para permitir a ventilação do tubo.
- Coloque o tubo de amostra em uma câmara de vácuo, sele a câmara e conecte uma bomba de vácuo de membrana de laboratório à câmara. Submeter a amostra ao tratamento a vácuo por até 30 minutos, para reduzir a presença de bolsas de ar dentro de amostras biológicas. Pare o tratamento de vácuo quando não forem vistas bolhas de ar escapando da amostra.
- Ao olhar através de um estereótipo, use pinças para submergir a amostra no meio de infiltração preparado anteriormente. Lave a amostra de detritos em potencial.
- Insira a amostra no capilar usando pinças, enquanto tanto o capilar quanto a amostra estão totalmente submersos para evitar a inclusão de bolhas de ar. Use uma ponta de agulha capilar ou seringa menor como uma haste de empurrar(Figura 2B).
- Pegue a amostra capilar do vidro médio do relógio, usando pinças. No caso da PFD, cubra a tampa da placa de Petri.
- Modele o papel de tecido em um ponto fino e use-o para remover cerca de 1 mm de líquido de ambas as extremidades do capilar.
- Derreta um pequeno volume de cera capilar usando uma caneta de cera. Aplique cera em ambos os lados. A cera ficará opaca quando se solidificar. Tome cuidado para excluir bolhas de ar do capilar(Figura 2C).
NOTA: Evite o superaquecimento da cera ou capilar, pois isso pode causar fervura explosiva, bem como os bolsos de cavitação quando a amostra terminada esfriar. - Depois, raspe o excesso de cera do exterior do capilar usando um bisturi e limpe com papel de tecido fino.
3. Montagem da amostra
- Coloque um microcoil sob o estereóscópio e insira a amostra usando pinças mantendo a microcoil estável(Figura 2D).
- Use uma haste para centralizar a amostra no microcoil, deslizando o capilar dentro da bobina solenoide.
- Opcionalmente, aplique fita adesiva para fixar a posição do capilar.
- Inspecione o capilar para garantir que nenhuma bolha de ar seja visível dentro da bobina solenoide, para evitar a destruição do sinal de MR causada por diferenças de suscetibilidade.
- Conecte o microcoil ao soquete da base da sonda, mantendo a microcoil ereto(Figura 3A,3B).
- Deslize cuidadosamente as bobinas gradientes de eixo triplo sobre a microcova, ao mesmo tempo em que combina os conectores de resfriamento de água do gradiente com o da base da sonda(Figura 3C). Gire a rosca do parafuso na base da sonda para fixar o gradiente no lugar.
NOTA: Esta etapa se aplica apenas a uma sonda Micro5. No caso de outros sistemas como Micro2.5 ou Biospect, os gradientes estão em um soquete separado do que a bobina.
4. Determinando características da bobina
- Se a bobina for testada pela primeira vez, use a solução de amostra de referência para criar uma amostra homogênea, que é útil para calibração de energia e testes de homogeneidade B1. Possíveis problemas de suscetibilidade devido aos fios da bobina podem ser testados facilmente com esta amostra de referência.
- Insira a sonda no ímã e conecte os cabos necessários: cabo de transmissão/recebimento de RF, linhas de resfriamento de água, cabo termopar e linha de resfriamento de ar.
- Defina a temperatura desejada de resfriamento de água (recomendada de 298 K) para a unidade de resfriamento de água.
- Defina a temperatura-alvo (298 K) e o fluxo de gás alvo (300 L/h). O fluxo de gás pode ser diferente para um desenho de bobina diferente ou volume amostral. Isso se aplica apenas a sistemas com um sistema de controle de temperatura.
NOTA: Os próximos passos só são necessários ao testar bobinas novas (construídas em casa). - Conecte a sonda usando um cabo coaxial de 50 Ω a um analisador de rede com uma largura de varredura adequadamente ampla (400 MHz), centrada na frequência de ressonância pretendida.
- Observe os modos ressonantes ajustando os capacitores de correspondência e ajuste variável presentes na base da sonda.
- Sintonize e combine o modo ressonante com a frequência desejada.
- Opcionalmente, determine o fator de qualidade da bobina (fator Q) no analisador de rede. Um método para obter o fator de qualidade é usar uma rede de acoplamento e dividir a frequência central (fc)pela largura do mergulho de reflexão em -7 dB (i.e., Q = fc /(f1 - f2)14. Defina fc para a frequência de operação do ímã, enquanto f1 e f2 são definidos para o ponto -7 dB esquerda e direita de f c, respectivamente. Alguns analisadores de rede têm determinação de fator Q incorporada.
- Inicie um teste de reflectância no scanner, geralmente chamado de curva de oscilação, e ajuste a sintonia e correspondência conforme necessário. Recomenda-se definir quaisquer capacitores de ajuste e correspondência ao ponto médio de sua gama para novas bobinas. Portanto, comece com uma largura de varredura espectral alta. Em alguns casos, pode ser mais conveniente sintonizar e combinar a bobina fora do ímã em um analisador de rede.
- Selecione um arquivo shim para a bobina de maior volume da sonda de imagem se estiver disponível. Se começar a partir de uma bobina que foi usada anteriormente, use um arquivo shim disponível. Se ambas as opções não estiverem disponíveis, comece com todos os valores de shim definidos para 0.
- Selecione a configuração correta da bobina para a microcoil se ela estiver disponível no software de imagem (ouseja, , ParaVision). Caso contrário, crie uma nova configuração de bobina que corresponda às especificações da bobina (por exemplo, sintonizada ou duplamente sintonizada) de acordo com o manual do sistema. As estimativas para os limites seguros para este microcoil solenoide utilizado nesta pesquisa com 1,5 mm de diâmetro interno de tamanho é de 1 ms a 1 W de potência máxima e 1 mW de potência contínua.
ATENÇÃO: Os pequenos capacitores (tipicamente de 1 mm de tamanho) necessários para microcoils são altamente sensíveis e facilmente danificados por altas tensões. A determinação automatizada de energia do pulso pode não funcionar com bobinas não padrão, e potências muito altas podem causar danos à bobina ou outras partes do espectrômetro. Portanto, recomenda-se ajustes manuais. - Registo uma curva de nutação para uma nova bobina para obter uma indicação da potência RF correta para a bobina (Figura 4). Caso os limites de segurança para a bobina sejam desconhecidos, comece com 10 μs a uma potência de pulso baixa de 0,6 W e aumente lentamente os comprimentos de pulso em 1 μs de cada vez até que o sinal apareça.
- Usando um experimento fid na ausência de codificação gradiente, varie sistematicamente o comprimento do pulso RF, mantendo a energia de pulso constante. O comprimento ideal do pulso é o comprimento do pulso, onde a intensidade do sinal atinge o máximo. Se testar uma nova bobina, use um pulso de 10 μs com uma potência muito baixa primeiro e comece a aumentar a energia do pulso gradualmente.
NOTA: Caso a potência seja muito maior do que o esperado para a combinação de características da bobina e espectrômetro, isso já é um indício de que o modo ressonante errado foi selecionado. - Para uma bobina com um campo B1homogêneo, como uma bobina solenoide, determine o pulso de 180°, onde a intensidade do sinal diminui para zero22.
- Usando um experimento fid na ausência de codificação gradiente, varie sistematicamente o comprimento do pulso RF, mantendo a energia de pulso constante. O comprimento ideal do pulso é o comprimento do pulso, onde a intensidade do sinal atinge o máximo. Se testar uma nova bobina, use um pulso de 10 μs com uma potência muito baixa primeiro e comece a aumentar a energia do pulso gradualmente.
- Coloque a energia de pulso determinada de 90° na placa de ajuste do estudo criado. No ParaVision, o cartão de ajuste de energia de referência pode ser usado para inserir a potência de pulso rígido.
- Use uma varredura de localizador com 3 fatias, uma fatia em cada um dos três eixos primários, para localizar a posição da bobina dentro do ímã. Para fazer isso, carregue uma varredura de localizador na biblioteca padrão do espectrômetro. A partir de um grande campo de visão sem compensação é recomendado. Realize um ajuste automatizado de ganho do receptor e inicie manualmente a medição.
NOTA: Se a amostra estiver exatamente no centro do sistema de gradiente, a varredura do localizador mostrará a amostra. Se a bobina ou amostra não estiver centrada nas fatias de imagem ou ausentes, a varredura do localizador precisa ser ajustada, nesse caso, a etapa 4.12 precisa ser realizada novamente. - Alternativamente, use uma maneira complementar para encontrar o pulso correto de 90° com base na avaliação da imagem. Uma vez que uma potência de pulso aproximada seja encontrada usando a curva de nutação, ajuste os poderes de pulso gradualmente para verificar a imagem para a homogeneidade de campo B1. Para algumas bobinas com um campo B1 inhomogêneo, a potência de pulso de 90° determinada usando a curva de nozes pode ser superestimada, o que leva à sobre-queda no ponto doce desejado da bobina. Neste caso, reduza a potência de pulso de referência e verifique as novas imagens em relação às imagens anteriores(Figura 5).
- Shim manualmente o campo magnético com base no sinal FID. Uma ordem recomendada para shimming inicial é Z-Z2-Z-X-Y-Z-Z-Z2-Z-XY-XZ-YZ-Z. No caso de um solenoide, o eixo de simetria principal está no plano XY. Portanto, calços em diferentes direções podem resultar em uma correção mais forte da homogeneidade B0 para esta configuração da bobina. Calços de ordem superior têm pouco efeito e podem ser ignorados.
- Calcule um SNR de tamanho de volume para permitir a comparação das características das microcervejas em diferentes sistemas, adaptados do protocolo18do fabricante . Para os microcoils utilizados aqui, utilizamos uma sequência de spin-echo com os seguintes parâmetros: campo de visão (FOV) 6 mm x 6 mm, tempo de repetição (TR) 1000 ms, tempo de eco (TE) 7 ms, Matrix 256 x 256 e espessura da fatia = 0,5 mm. Ajuste a espessura da fatia até que o ganho do receptor seja unitário. Em seguida, ajuste o número de fatias para que as fatias se estendam além da região de homogeneidade de campo B1. Registo as imagens sem a média do sinal, se possível.
- Determine o volume normalizado SNR (SNR/mm3) em duas etapas. Primeiro, calcule o volume voxel(Vvoxel)(Eq. 1):
(1)
NOTA: As unidades para a fatia Dx, Dy e D estão em mm. Este cálculo também pode ser realizado para uma série de fatias. - Selecione as regiões de interesse para determinar a intensidade do sinal(μROI) da amostra, e a intensidade do sinal(ruídoμ) e desvio padrão(ruídoσ)para uma região fora da amostra (ouseja, o ruído). O sinal médio é retirado do centro da imagem, enquanto o sinal de ruído é calculado a partir das manchas de canto(Figura 6). O software de controle de espectrômetros ou o software de processamento de imagens de uso geral podem ser usados para esses cálculos. Use uma única repetição, se possível, para manter a comparabilidade entre bobinas diferentes.
- Use os valores para calcular um SNR normalizado de volume (Eq. 2):
(2)
Para a bobina utilizada aqui em combinação com a solução de referência, o uso do Eq. 2 resulta na seguinte solução:
(3)
NOTA: Ao comparar o SNR de bobinas em diferentes pontos de força do campo magnético, as propriedades de relaxamento do fantasma precisam ser medidas23, a menos que um tempo de repetição muito longo e muito pouco tempo de eco sejam usados.
- Determine o volume normalizado SNR (SNR/mm3) em duas etapas. Primeiro, calcule o volume voxel(Vvoxel)(Eq. 1):
- Verifique se há problemas de suscetibilidade devido a inhomogenidades de campo magnético: carregue e execute uma sequência de gradiente-eco múltiplo (MGE)(Figura 7). As inhomogenidades do campo magnético devido às diferenças de suscetibilidade são visíveis nas imagens com tempos de eco mais longos, pois o eco gradiente não refoca os giros, que defálticos devido às inhomogenidades estáticas do campo. Dessa forma, podem ser visualizadas inhomogeneidades na amostra (devido aos espaços aéreos da amostra), bem como inhomogeneidades de campo B0 introduzidas pelo material da bobina. Use os seguintes parâmetros, a serem ajustados dependendo das especificações do espectrômetro e da bobina utilizadas: TR 200 ms, TE 3,5 ms com 48 ecos espaçados 3,5 ms de distância, ângulo flip 30 graus. Matriz tamanho 128 x 128.
NOTA: Se vários modos ressonantes (potenciais) ou mergulhos de reflexão forem observados na curva de ressonância (oscilação), repita os passos acima para cada modo ressonante para determinar o mais sensível. Dependendo da microcoil, diferentes partes do conjunto de microcodo podem ser propensas a modos de ressonância não intencional.
(1)
(2)
(3)5. Imagem de alta resolução
- Execute um experimento 3D-FLASH com os seguintes parâmetros: TR 70 ms, TE 2.5 ms, tamanho da matriz de 128 x 64 x 64, FOV 1.6 x 0,8 x 0,8 mm, ângulo de lançamento 30°, e largura de banda receptora de 50 kHz.
- Derivar os poderes de pulso do poder de pulso de referência determinado anteriormente; isso é automático na maioria dos softwares de imagem. Determine o ganho do receptor usando ajustes automáticos. Ajuste o FOV se necessário, cobrindo todo o objeto em ambas as direções de codificação de fases para evitar o aliasing. Execute uma simulação de ciclo de trabalho de gradiente, se disponível no sistema, para verificar se o ciclo de trabalho do experimento permanece dentro das especificações das bobinas gradientes.
NOTA: Estes parâmetros são específicos da bobina usada para demonstração; é importante otimizar para as especificidades do sistema local.
6. Recuperando amostras para estudo ou armazenamento posterior
- Remova a amostra capilar do microcoil.
- Usando pinças, remova os plugues de cera sob um estereóscópio.
- Use uma seringa para lavar a amostra do capilar com uma solução de escolha. Alternativamente, use uma haste de empurrador de vidro para ejetar a amostra.
- Para evitar a desidratação da amostra, armazene em um meio adequado para armazenamento.
Representative Results
Caracterização da bobina
Após o ajuste bem sucedido e a correspondência de uma bobina, seu desempenho pode ser caracterizado pelo fator Q da bobina, pulso de referência de 90° e SNR/mm3. Para a bobina solenoide de 1,5 mm de ID compatível com a tótonia demonstrada aqui, o fator Q medido (descarregado) foi de 244, em comparação com 561 para uma bobina de 5 mm de gaiola.
O pulso de referência de 90° foi de 12 μs a um nível de potência de 0,6 W; cf. 5 μs a 45 W para uma bobina de gaiola de 5 mm(Figura 4 e Figura 5). Isso equivale a uma força de campo de pulso RF(B1),utilizando 
0,53 mT para o microcoil e 1,17 mT para a bobina de gaiola14 onde y é a razão gyrommagnética, enquanto tau é a duração do pulso. Uma vez que os níveis de potência de pulso (P) diferem, as bobinas podem ser comparadas em termos de eficiência de transmissão 
: 0,69 mT/W1/2 e 0,18 mT/W1/2 para a microcoil e gaiola,respectivamente 14. Comparando-se por um pulso de 90°, o microcodo é encontrado como um fator ≈ 4 vezes mais sensível do que a bobina da gaiola.
Efeito da correspondência de suscetibilidade
Em forças de campo ultra-altas, a suscetibilidade de amostra e bobina tornam-se um fator dominante para a qualidade da imagem, como visto na Figura 7A,7B. Comparado com uma bobina sem um reservatório fluido compatível com suscetibilidade, o sinal é retido por mais tempo e mais homogêneo em uma amostra de referência. No entanto, devido ao reservatório de suscetibilidade, as dimensões máximas da amostra diminuem em relação à bobina sem o reservatório.
Imagem de alta resolução
Uma alta resolução de 13 x 13 x 13 μm3 de um espécime raiz de truncatula medicago foi atingida em 20 horas e 23 minutos(Figura 8). A partir da superfície da raiz, o córtex raiz é visto, juntamente com um pouco de água residual na parte externa da raiz. Além disso, o xilema é observado como uma faixa escura que envolve o phloem. Alguns bolsões de ar são observados como manchas escuras com perda completa de sinal.
Nódulos de raiz simbiótica de M. truncatula também podem ser imagens usando este protocolo (Figura 9). Utilizando uma bobina ligeiramente maior e incomparável (comprimento de cerca de 3500 μm, diâmetro interno de 1500 μm), foram obtidas imagens com resolução de até 16 x 16 x 16 μm3 em 33 minutos.
Figura 1: Um microcoil solenoide. (A) O design da bobina solenoide consiste em fios enrolados helicoicamente, tipicamente enrolados em torno de um capilar. A geometria do fio, como sua espessura, diâmetro, número de enrolamentos e espaçamento de fios, influenciam as características da bobina. (B) Uma microcova solenoide construída em casa com um reservatório para fluido de correspondência de suscetibilidade (Fomblin). Consiste em uma ferida de fio de cobre revestido de 0,4 mm de espessura seis vezes ao redor capilar com um diâmetro externo de 1500 μm e um comprimento de bobina de 3500 μm. A bobina está submersa em um reservatório que é feito de uma seringa. Podem ser inseridos capilares de amostra até um diâmetro externo de 1000 μm. São utilizados dois capacitores, um capacitor de 1,5 pF em série com o indutor e uma segunda variável de 1,5-6 pF capacitor é colocado em paralelo ao indutor. Todos os componentes são soldados em uma placa de fibra de vidro (amarelo). É montado em um suporte comercial (polímero cinza) que é modificado para suportar o reservatório. (C) Componentes de desenho da bobina solenoide: 1. bobina solenoide, 2. capilar de amostra, 3. 1,5 pF capacitor de ajuste, 4. capacitor de correspondência variável, 5. placa base de fibra de vidro, 6. fio de cobre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação da amostra sob um estereótipo. (A) Itens necessários para a preparação de microcoils. Da esquerda para a direita: 1. Solução de referência CuSO4, 2. perfluorodecalina, 3. microcoil, 4. bisturi, 5. pinças de tensão positiva, 6. pinças, 7. capilares de diâmetro externo = 1000 μm, 8. caneta de cera, 9. cera capilar, 10. luvas de nitrilho, 11. estereómico, 12. vidro de relógio com tampa de placa petri, 13. material vegetal em substrato de crescimento. Não mostrado: seringa de 2 mL com agulha ø 0,8 x 40 mm e papel de tecido fino. (B) Feche a inserção da amostra em um capilar usando pinças, enquanto ambos são mantidos submersos. (C) Vedação do capilar usando cera derretida. (D) Inserção do capilar preparado no microcoil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O componente de uma sonda de microdeserção. (A) Base da sonda Micro5, contendo todas as conexões necessárias para resfriamento de água, aquecimento, sensores de temperatura, potência gradiente, RF (conector coaxial visível) e identificação opcional da sonda (PICS). Por baixo da base da sonda estão botões que permitem ajustar os capacitores de ajuste variável e correspondência, bem como reter parafusos para manter a sonda no lugar dentro do espectrômetro. (B) A montagem de microcoil construída em casa no topo da base da sonda. Observe os capacitores variáveis (cerâmica branca) montados na base da sonda que permitem a sintonia e correspondência. (C) Gradiente integrado de 3 axial montado na base da sonda com recipientes de resfriamento de água e contatos banhados a ouro para aterrar o gradiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Curva de nutação. Uma curva de noz é adquirida para determinar a potência de pulso de referência. A potência de pulso de referência (pulso de 90°) é definida como a combinação de energia e comprimento de pulso necessário para gerar um campo B1 que vira toda a magnetização disponível na direção z para o plano transversal. Uma série de pulsos é registrada na ausência de codificação gradiente. A cada pulso, o comprimento do pulso ou a energia do pulso são incrementados. Aqui a potência de pulso é definida para 0,6 W, enquanto o comprimento do pulso é incrementado em 1 μs cada vez. A intensidade máxima do sinal indica o pulso de 90°, em torno de 12 μs. O pulso de 180° também pode ser determinado desta forma usando a intensidade mínima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Determinação visual de 90° potência de pulso. Uma vez que uma potência aproximada de pulso de referência tenha sido encontrada usando uma curva de nutação, ela pode ser verificada visualmente variando o comprimento do pulso. Dependendo da bobina, o campo B1 pode ser mais ou menos sensível às alterações. (A) 11 μs de comprimento de pulso. (B) 12 μs de comprimento do pulso, ideal para esta bobina. (C) 13 μs de comprimento de pulso. (D) 20 μs de comprimento de pulso. Se a potência do pulso estiver muito alta, pode ocorrer sobre-tombamento, reduzindo assim a intensidade da imagem no centro da bobina (ponta de flecha). O campo B1 aumentado também aumenta o alcance da bobina, como pode ser observado na largura da imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Colocação da Região de Interesse. As regiões de interesse (ROI) para o cálculo de SNR normalizado de volume podem ser vistas. A intensidade média da amostra é retirada de um ROI que se enquadra na amostra de solução de referência. O ruído médio e o desvio padrão são calculados a partir de um ou mais ROI localizado nos cantos da imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Homogeneidade rf avaliada por imagem de eco gradiente. Uma sequência de eco de gradiente múltiplo (MGE) é usada para avaliar a homogeneidade RF(B1 -Field) usando uma série de ecos gradientes. Os parâmetros básicos foram: tempo de repetição de 200 ms, tempo de eco 3,5 ms com o número de ecos 48, espaçamento de ecos de 3,5 ms, 64 médias, tempo de aquisição 27 m 18 s, ângulo de lançamento 30°. Campo de visão foi 5 x 5 mm, matriz 128 x 128, resolução 39 x 39 x 200 μm. (A) Bobina compatível com suscetibilidade. O fluido de correspondência de suscetibilidade (Fomblin) ao redor da bobina RF reduz os efeitos de suscetibilidade devido ao fio da bobina. Pequenas bolhas de ar causam perda de sinal à medida que o tempo de eco aumenta. (B) Uma bobina (não suscetibilidade combinada) com diâmetro igual da bobina. Em tempos de eco mais longos, são observados artefatos crescentes causados pela inhomogeneidade de campo B0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Imagem 3D de uma seção raiz de truncatula medicago. (Topo) imagem FLASH. Várias características da seção radicular podem ser distinguidas, incluindo epiderme (e), córtex (córtex ( c), phloem (ph) e xilema (xim). Bolsões de ar (a) na raiz causam perda total de sinal. Os parâmetros básicos foram os seguintes: Tempo de repetição de 70 ms, tempo de eco 2,5 ms, 256 médias, tempo de aquisição 20 h 23 m. Resolução 13 x 13 x 13 μm3. O tamanho da matriz foi de 128 x 64 x 64 e campo de visão 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Largura de banda do receptor de 50 kHz. (Inferior) Imagem MSME. Os parâmetros básicos foram os seguintes: Tempo de repetição de 500 ms, tempo de eco 5,2 ms, 28 médias, tempo de aquisição 15 h 55 m. Resolução 13 x 13 x 13 μm3. O tamanho da matriz foi de 128 x 64 x 64 e campo de visão 1,6 x 0,8 x 0,8 mm. Largura de banda do receptor de 70 kHz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Imagem 3D de um nódulo raiz de truncatula medicago. (Topo) Imagem de baixa resolução. Os parâmetros básicos foram os seguintes: Tempo de repetição de 60 ms, tempo de eco 2,3 ms, 4 médias, tempo de aquisição 4 m. Resolução 31 x 31 x 31 μm3. O tamanho da matriz foi 64 x 32 x 32 e campo de visão 2 x 1 x 1 mm. Largura de banda do receptor de 50 kHz. (Inferior) Imagem de alta resolução. Os parâmetros básicos foram os seguintes: Tempo de repetição de 60 ms, tempo de eco 2,3 ms, 8 médias, tempo de aquisição de 33 m. Resolução 16 x 16 x 16 μm3. O tamanho da matriz foi 128 x 64 x 64 e campo de visão 2 x 1 x 1 mm. Largura de banda do receptor de 50 kHz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este protocolo é mais adequado para amostras biológicas, pois muitos materiais e amostras geológicas têm tempos de relaxamento T2 significativamente mais curtos, que não podem ser imagens pelas sequências aqui utilizadas. Mesmo alguns tecidos biológicos, que apresentam alta suscetibilidade magnética de amostra heterogeneidade, podem ser difíceis de imaginar em campo ultra-alto, pois os efeitos estão correlacionados com a força de campo24. O protocolo não só é útil para novas bobinas, mas também pode auxiliar na solução de problemas e diagnóstico de possíveis problemas. Ao testar amostras novas ou desconhecidas, este protocolo pode ser realizado de antemão na solução de referência para verificar se a configuração experimental está funcionando de acordo com as especificações. Isso ajuda na solução de problemas, uma vez que o espectrômetro pode ser excluído como fonte de artefatos e defeitos. Além disso, isso define os capacitores de sintonia e correspondência na sonda a valores típicos do microcoil.
Quando nenhum sinal é registrado no primeiro experimento, o campo de visão da varredura do localizador pode ser ampliado para verificar se a amostra é vista. Em seguida, verifique novamente se a bobina está sintonizada corretamente e tente outra varredura de localizador. É possível que a bobina exaja modos ressonantes não intencionais adicionais, nesse caso o correto precisa ser determinado. Se ainda não houver uma imagem, remova a amostra para verificar sua posição dentro do conjunto de microacades e verifique se a amostra está intacta (ou seja, não há bolhas de ar ou vazamentos nos selos). Por fim, uma amostra pode ser preparada com água em vez de PFD. Caso a amostra dê pouco sinal detectável no escaneamento do localizador, a água circundante no capilar ainda pode ser detectada.
Como os microcoils são idealmente muito próximos da amostra, as diferenças de suscetibilidade magnética entre o ar e o fio podem causar perda adicional de sinal, como visto na Figura 7B. Os artefatos potenciais incluem erros espaciais e variação anômada da intensidade do sinal. Especialmente sequências de pulso tipo gradiente-eco são afetadas por esta perda de sinal não uniforme. Por essa razão, apresentamos uma bobina compatível com suscetibilidade, submergindo o fio em líquido fluorinert (Fomblin ou FC-43). O método de estimativa B1 incluído neste protocolo pode ajudar a determinar se as diferenças de suscetibilidade B1 justificam a inclusão de estratégias de correspondência de suscetibilidade no desenho do conjunto da bobina. Uma abordagem alternativa para a construção de uma bobina compatível com suscetibilidade é usar o fio25compatível com suscetibilidade . Além disso, apenas questões de suscetibilidade devido à bobina são abordadas com essa abordagem. Incompatibilidades de suscetibilidade dentro da amostra (por exemplo, devido aos espaços aéreos) permanecem desafiadoras.
Bolsões de ar ou bolhas representam um desafio experimental que causa uma grande perda de sinal, causada por diferenças de suscetibilidade na interface do ar e do fluido ou espécime19 (Figura 5A). Um aspecto crítico da preparação bem sucedida da amostra é a submersão da amostra e capilar. No entanto, mesmo pequenas bolhas podem causar perdas de sinal, especialmente para sequências de tipo de eco gradiente. Bolhas de ar móveis podem migrar através do capilar até que estejam em contato com a amostra. Alguns desses efeitos podem ser aliviados inclinando ligeiramente o capilar para que uma extremidade seja maior que a outra. A inclinação garante que as bolhas de ar potenciais sejam mantidas no lugar na extremidade superior, sem perturbar a amostra. Também é importante verificar se a cera capilar forma uma boa vedação, pois a desidratação pode causar grandes bolhas de ar.
Para os espaços de ar dentro da amostra, a PFD foi usada para preencher os espaços de ar intercelulares enquanto não penetrava nas membranas celulares26. No entanto, mesmo com essa abordagem, não conseguimos remover todos os espaços aéreos. Além disso, essa abordagem significa que precisamos de um agente adicional, que geralmente não é preferido devido ao desejo de estudar um sistema o mais invasivamente possível.
A forma cilíndrica dos capilares significa que as configurações de perfusão devem ser viáveis, especialmente para tecidos vulneráveis à decomposição, como biópsias ou processos de estudo em material raiz vivo. Dois passos podem realizar uma configuração de perfusão. Primeiro, conectar um tubo de alimentação média, bem como um tubo de drenagem em ambos os lados do capilar seria suficiente para criar uma quimiostat. Em segundo lugar, a adição de um recuo na amostra capilar poderia manter a amostra no lugar contra a direção do fluxo. Isso é análogo a um protocolo publicado para microcoils planar10.
A natureza não invasiva da imagem de MR, combinada com o líquido inerte usado neste protocolo (PFD ou Fomblin) significa que após a conclusão dos experimentos, as amostras podem ser removidas de seus capilares para estudos posteriores. As combinações incluem microscopia óptica ou eletrônica e outras técnicas de imagem destrutivas. Recentemente demonstramos uma combinação com microscopia óptica nos nódulos radiculares medicago truncatula 27.
Demonstramos um método para o material vegetal de imagem usando microcoils dedicados em um espectrômetro NMR de campo ultra-alto. Volumes amostrais relativamente grandes podem ser estudados em alta resolução com boa homogeneidade rf. Além disso, imagens espectroscópicas podem ser realizadas em resoluções mais altas do que de outra forma viável. A adaptação do design de microcoil às amostras é facilitada por um método eficiente para determinar as características de desempenho da bobina. A abordagem da bobina solenoide também pode ser prontamente aplicada a outras amostras além de plantas, incluindo tecido animal.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os experimentos no instrumento de 950 MHz foram suportados pelo uNMR-NL, um Roadmap National Roadmap Large-Scale Facility of the Netherlands (projeto 184.032.207) financiado pela NWO). R.S. foi apoiado pelo projeto do consórcio BioSolarCells U2.3. J.R.K. foi apoiado pela Escola de Pesquisa de Ressonância Magnética dos Países Baixos (NMARRS) na pós-graduação [022.005.029]. Agradecemos a Defeng Shen e Ton Bisseling por fornecerem as amostras de truncatula medicago. Agradecemos ainda a Klaartje Houben, Marie Renault e Johan van der Zwan pelo apoio técnico nas instalações da UNMR-NL. Também gostaríamos de agradecer a Volker Lehmann, Henny Janssen e Pieter de Waard por ajuda técnica. Expressamos nossa gratidão a Frank Vergeldt, John Philippi e Karthick B. Sai Sankar Gupta por seus conselhos. Por fim, agradecemos a Jessica de Ruiter por fornecer a narração do vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference solution preparation | |||
| CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
| D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
| Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
| Sample preparation | |||
| Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
| Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
| Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
| Syringe | Generic | - | Used to apply PFD and manipulate the sample |
| Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
| Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
| Imaging Hardware | |||
| 22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
| Air cooler | Bruker GmbH | - | Used to regulate probe temperature |
| Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
| Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
| Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
| RF microcoil | Home-built | - | contains Fomblin |
| Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
| Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |
References
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