Summary
يتم تقديم بروتوكول لدراسة الأنسجة البيولوجية بدقة مكانية عالية باستخدام المجهر بالرنين المغناطيسي العالي المجال (MRM) باستخدام ميكروكويل. يتم توفير تعليمات خطوة بخطوة لتميز microcoils. وأخيراً، يتم إظهار الأمثل للتصوير على جذور النبات.
Abstract
يصف هذا البروتوكول معايرة نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) وطريقة إعداد العينات للميكريلات اللولبية الدقيقة مع العينات البيولوجية، المصممة للتصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة (MRI)، ويشار إليها أيضًا باسم المجهر MR (MRM). ويمكن استخدامه في مطياف التصوير بالرنين المغناطيسي قبل السريرية, أظهرت على عينات جذور اقتطاع Medicago . تزيد المغذيات الدقيقة من الحساسية من خلال مطابقة حجم جهاز الرنانة RF مع حجم العينة ذات الفائدة ، مما يتيح دقة صور أعلى في وقت الحصول على بيانات معينة. بسبب تصميم بسيط نسبيا، الكوتيل اللولبي هي واضحة ورخيصة لبناء ويمكن تكييفها بسهولة لمتطلبات العينة. بشكل منهجي، نحن نشرح كيفية معايرة مصغرة جديدة أو منزلية الصنع، وذلك باستخدام حل مرجعي. وتشمل خطوات المعايرة: تحديد طاقة النبض باستخدام منحنى الطعم؛ وطاقة الذبذبة باستخدام منحنى الذبذبات؛ وطاقة الذبذبات؛ والنبضات التي تستخدم في الزُ تقدير التجانس RF-مجال; وحساب نسبة إشارة إلى ضوضاء تم تسويتها بالحجم باستخدام تسلسلات النبض القياسية. وتناقش الخطوات الهامة في إعداد العينات للعينات البيولوجية الصغيرة، وكذلك العوامل المخففة المحتملة مثل الاختلافات في القابلية المغناطيسية. يتم عرض تطبيقات الملف اللولبي الأمثل من خلال التصوير ثلاثي الأبعاد لعينة جذر عالية الدقة (13 × 13 × 13 ميكرومتر3، 2.2 pL).
Introduction
التصوير بالرنين المغناطيسي هو أداة متعددة الاستعمالات لصورة غير باضعة مجموعة واسعة من العينات البيولوجية ، بدءا من البشر إلى خلايا واحدة1،2،3. بينما التصوير بالرنين المغناطيسي-الماسحات الضوئية لتطبيقات التصوير الطبي عادة استخدام المغناطيس مع قوة حقل من 1.5 T إلى 3 T، يتم تصوير تطبيقات خلية واحدة في نقاط القوة مجال أعلى من ذلك بكثير1،3،4. يشار إلى دراسة العينات في القرارات أدناه مائة ميكرومتر كما المجهرية الرنين المغناطيسي (MRM)5. ومع ذلك، يعاني MRM من انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) مقارنة مع تقنيات المجهر أو التصوير الأخرى المتاحة (مثل المجهر البصري أو التصوير المقطعي المحوسب). يمكن اتباع العديد من النهج لتحسين SNR6. ويتمثل أحد النهج في استخدام قوة مجال مغناطيسي أعلى، في حين أن النهج التكميلي هو تحسين جهاز الكشف عن الإشارة بالنسبة للعينات الفردية. بالنسبة لهذه الأخيرة ، يجب تعديل أبعاد الكاشف لتتناسب مع أبعاد عينة الاهتمام. بالنسبة للعينات الصغيرة التي ≈0.5-2 ملم في القطر (على سبيل المثال، أنسجة الجذر)، تكون الميكونات الصغيرة مفيدة لأن SNR يتناسب عكسياً مع قطر اللفائف6،7. وقد تم تحقيق قرارات عالية تصل إلى 7.8 × 7.8 × 15 ميكرومتر3 على الخلايا الحيوانية باستخدام ميكروكويلات مخصصة8. توجد مجموعة متنوعة من أنواع microcoil ، مع لفائف اللولبية واللولبية الأكثر شيوعًا اعتمادًا على التطبيق وهندسة الأنسجة9. لفائف بلانار لديها حساسية عالية قريبة من سطحها، وهو أمر مفيد للتطبيقات على شرائح رقيقة. على سبيل المثال، تم وصف طريقة مصممة خصيصًا للتصوير النسيج المُنسج للميكويلات الدقيقة10. ومع ذلك، لفائف ألواح لها سقوط عالية من الحساسية ولا توجد قوة نبض مرجعية محددة جيدا. لفائف السولينيد، ويجري أسطواني، لديها مجال أوسع من التطبيق وأكثر تفضيلا لعينات أكثر سمكا. هنا، ونحن وصف خصائص لفائف اللولبي، بروتوكول لإعداد العينات للتصوير بالرنين المغناطيسي المجهري، فضلا عن معايرة مجهر اللولبي(الشكل 1A).
لفائف اللولبي يتكون من سلك إجراء ملفوف، مثل المسمار، حول الشعرية عقد العينة(الشكل 1B). يمكن بناء الجمعيات microcoil باستخدام الأسلاك النحاسية فقط المينا، ومجموعة متنوعة من المكثفات، وقاعدة مناسبة لحام المكونات (الشكل 1B). المزايا الرئيسية هي البساطة والتكلفة المنخفضة ، جنبا إلى جنب مع خصائص الأداء الجيد من حيث SNR لكل وحدة حجم و B1 التجانس الميداني. سهولة البناء تمكن من تكرار سريع من التصاميم لفائف والهندسة. وقد وصفت المتطلبات المحددة لتصميم اللولبي المجهري وتوصيف التحقيق (أي، ونظرية الإلكترونيات ، والقياسات منضدة العمل ، وقياسات مطياف لمجموعة متنوعة من هندسات لفائف) على نطاق واسع في أماكن أخرى7،11،12،13،14.
ويمكن بناء لفائف اللولبية من خلال الأخذ في الاعتبار قواعد التصميم للأبعاد المطلوبة وفقا للمبادئ التوجيهية الموصوفة في مكان آخر15,16. في هذه الحالة المحددة، تم استخدام لفائف بقطر داخلي 1.5 ملم، مصنوعة من الأسلاك النحاسية المناَق، قطرها 0.4 مم، تدور حول شعرية قطرها الخارجي 1.5 ملم. هذا اللولبي يقام على لوحة قاعدة التي يتم على الدائرة، وتتألف من مكثف ضبط (2.5 pF)، وهو مكثف مطابقة متغير (1.5-6 pF) وكذلك أسلاك ربط النحاس(الشكل 1A، 1C). يتم اختيار مكثف ضبط لتحقيق التردد الرنانة المطلوب من 950 ميغاهيرتز، في حين يتم اختيار مكثف مطابقة لتحقيق الإرسال إشارة الحد الأقصى في مقاومة 50 أوم. المكثف الأكبر متغير للسماح للتكيف أدق. في العملية العادية، يتم تنفيذ ضبط ومطابقة باستخدام المكثفات في قاعدة التحقيق. يجب تركيب الكِفِر الصغير المُجمَّع على مسبار بحيث يمكن إدخاله في المغناطيس. قد تكون هناك حاجة إلى حامل إضافي، اعتمادا على النظام. هنا نستخدم 22.3 T المغناطيس تركيبة مع بروكر وحدة التحكم Avance الثالث HD في تركيبة مع مسبار Micro5. في هذه الحالة، استخدمنا إدراج دعم معدل مجهزة الاتصالات اللازمة للاتصال إلى قناة 1H من التحقيق (الشكل 1A).
ويشمل التصميم المطابق للقابلية لللفائف خزاناً مع سائلاً مفلوراً للحد من عدم التطابق بين الحساسية، الناشئ عن لفائف النحاس التي تقع على مقربة من العينة17. تم صنع خزان من حقنة بلاستيكية لإحاطة الملف ومليئة بالفوبلين. كما يحتاج السائل perfluorinated إلى إحاطة لفائف، يتم تخفيض القطر المتاح لعينة إلى قطر خارجي من 1 ملم. ولسهولة تغيير العينة، تم إعداد العينة في شعر شعري بقطر خارجي قدره 1 مم وقطر داخلي يبلغ 700 ميكرومتر. يتم عرض الأدوات اللازمة لإعداد العينة في الشكل 2A.
تعتمد معلمات MR التجريبية الأساسية بشكل كبير على أجهزة النظام المستخدم، بما في ذلك نظام التدرج وقوة الحقل ووحدة التحكم. يمكن استخدام العديد من المعلمات لوصف أداء النظام، منها 90 درجة طول النبض والطاقة، B1-التجانس و SNR لكل وحدة حجم (SNR / مم3)،هي الأكثر ملاءمة من الناحية العملية. SNR / مم3 مفيد لمقارنة أداء لفائف مختلفة على نفس النظام18. وفي حين أن الاختلافات في الأجهزة عبر النظم قد توجد، فإن التطبيق الموحد لبروتوكول القياس ييسر أيضا مقارنة أداء النظام.
ويركز هذا البروتوكول على المعايرة وإعداد العينات. ويظهر توصيف تدريجي لأداء الميكروفات اللولبية: معايرة طول النبض 90 درجة أو الطاقة؛ تقييم تجانس مجال الترددات الراديوية؛ وحساب SNR لكل وحدة حجم (SNR / مم3). ويرد وصف قياس صدى الدوران موحدة باستخدام وهمية لتسهيل مقارنة التصاميم لفائف، والذي يسمح لتحسين تطبيقات متميزة. يوصف الاستعدادات عينة العينة الوهمية والبيولوجية، محددة للميكونات الصغيرة. ويمكن تنفيذ البروتوكول على أي مغناطيس عمودي مناسب ضيق (≤60 مم) مجهز بنظام مجهري متاح تجارياً. أما بالنسبة للنظم الأخرى، فيمكن أن يكون بمثابة دليل إرشادي ويمكن استخدامه مع بعض التعديلات.
إعداد العينة البيولوجية لقياسات التصوير بالرنين المغناطيسي عادة ليست واسعة جدا منذ يتم تصوير العينة سليمة كما ممكن. ومع ذلك، يمكن أن تسبب مساحات الهواء في الأنسجة البيولوجية التحف الصورة بسبب الاختلافات في قابلية المغناطيسي19. يزيد تأثير مع زيادة قوة المجال المغناطيسي20. وهكذا، ينبغي تجنب المساحات الهوائية في نقاط قوة عالية في الميدان، وهذا قد يتطلب غمر العينة في سائل لتجنب الهواء حول الأنسجة وإزالة مساحات الهواء داخل هياكل الأنسجة. على وجه التحديد، عندما يتم استخدام microcoils، قد تكون هناك حاجة الختان من الأنسجة العينة المطلوبة، تليها غمره في سائل مناسب. ويتبع ذلك إدخال العينة في شعرية قبل القطع ، وأخيراً ختم الشعيرات الدموية بالشمع الشعري. استخدام الشمع كما تسرب بدلا من الغراء، واللهب الختم أو بدائل، يعني أن العينة قد تكون استخراجها بسهولة. هذا الإجراء هو مبين على جذر من طاعونة Medicago، وهو نبات صغير البقوليات. ومن مزايا هذا البروتوكول إمكانية التسجيل المشترك اللاحق لبيانات التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام المجهر البصري، حيث لا يتم تدمير العينة أثناء قياس التصوير بالرنين المغناطيسي.
والبروتوكول المعروض مناسب للقياسات المكانية العالية الدقة في الموقع، ويمكن أن تسمح التصاميم الأكثر تفصيلاً بالتصوير في عينات من الحي، حيث يتعين التصدي للتحديات المتعلقة بأنظمة دعم الحياة.
Protocol
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إجراءات استخدام وتقييم خصائص الملف من 1.5 ملم قطر داخلي (ID) لفائف اللولبية(الشكل 1). يتم وضع الملف المستخدم لإثبات البروتوكول في خزان مطابق للقابلية ، ولكن البروتوكول ينطبق على لفائف لا مثيل لها. ويمكن تكييف البروتوكول مع أحجام أخرى وأجهزة الطيف المختلفة.
1. إعداد عينة مرجعية
- لإعداد 100 مل من حل الحساسية المرجعية، قم بحل 156.4 ملغ من CuSO4 ∙ 5 H2O إلى 80 مل من D2O الواردة في قارورة GL45 100 مل. يقلل كبريتات النحاس من وقت الاسترخاء T1 و T2 ، مما يسمح بإجراء قياسات أسرع ، بينما يمنع D2O آثار التخميد والتشبع الإشعاعي. يُحرّك المزيج يدويًا حتى تذوب المواد الصلبة تمامًا.
- ضبط حجم إلى 100 مل باستخدام المياه ديوند لتركيز النهائي من 1 ز / ل CuSO4 (اللامائية، 6.3 mM). هذا التركيز يكفي لتقصير T1 و T2 الاسترخاء ولكن ليس عالية جداً أن تتأثر بهطول الأمطار. ختم العينة المرجعية لمنع تغيير نسبة H2O: D2O.
- اختياريا، قم بتوصيل المسبار إلى محلل شبكة، لاختبار ما إذا كان صدى الملف في تردد الرنين المطلوب. إجراء اختبار انعكاس S11 لقياس مدى التردد الذي تحقق عن طريق الضبط وقياسات عامل Q- كما هو موضح بالتفصيل من قبل هاس وآخرون14. قم بتوصيل الكِبرة الصغيرة بمحلل الشبكة باستخدام كبل محوري مشترك. استخدم كبل محول BNC إذا لزم الأمر.
- تعيين تردد مركز على محلل الشبكة إلى التردد الرنانة المطلوب، اعتمادا على قوة المجال المغناطيسي المقصود الذي تم تصميم الملف. بعد ذلك، تعيين عرض الاجتياح إلى 10 ميغاهيرتز. ضبط مكثف متغير على تجميع microcoil، إذا كان موجودا، لضبط تراجع انعكاس إلى التردد المطلوب.
- سجل مستوى العاكسة في تردد الوسط وتردد و 1 و و 2 على مستوى -7 ديسيبل. استخدم هذه المستويات لحساب عامل Q في مستوى -7 ديسيبل وفقًا لـ Haase etal. 14
2. إعداد العينة
- إذا كان إعداد عينة مرجعية لمعايرة لفائف، نقل 1 مل من محلول CuSO4 إلى طبق زجاجي ساعة تحت منظار مجسم.
- إذا كان إعداد عينة بيولوجية، نقل 1 مل من البيرفلوروديكالين (PFD) إلى زجاج ساعة تحت منظار مجس، والتي سيتم استخدامها لغمر العينة. ويستخدم PFD كما أنها يمكن أن تملأ الفراغات الهوائية في العينة، دون دخول الخلايا البيولوجية. كما أنه لا يمكن ملاحظته بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي البروتوني. تغطية على الفور زجاج الساعة مع غطاء طبق بيتري لمنع فقدان التبخر، قبل أن تكون هناك حاجة إلى PFD.
ملاحظة: PFD متقلبة للغاية وقوية على المدى الطويل غازات الاحتباس الحراري21. عندما لا تكون هناك حاجة لخصائصه الأوكسجين الذائب واللزوجة المنخفضة، فإنه قد يكون بديلا مع Fomblin، وهو البيرفلوروثير الذي يعطي أيضا أي إشارة 1H ملحوظ، ولكن التي لا تتبخر بسرعة17. - قطع الشعيرات الدموية من القطر الخارجي المناسب لحجم، لتناسب داخل قطر حامل microcoil (18 مم) والسماح لإعادة تحديد موضع (الشكل 1C). استخدم قاطع السيراميك لإجراء شق كل 10-12 مم واكسر بعناية على نقطة الشق.
- إذا كان إعداد عينة مرجعية، واستخدام ملاقط ومنظار مجسم لجلب شعرية ما قبل قطع في اتصال مع سطح محلول CuSO4 داخل زجاج الساعة، مما يسمح عمل شعري لملء الشعرية.
- إذا كان إعداد عينة بيولوجية، واستخدام ملاقط ومنظار ستيريو، لجلب شعري ما قبل قطع في اتصال مع سطح PFD داخل زجاج الساعة، مما يسمح عمل شعري لملء شعرية تماما. إطلاق الشعرية في زجاج الساعة بحيث يصبح مغمورة بالكامل.
- استخراج بعناية نظام جذر كامل من العمر خمسة أسابيع من الركيزة نموها، مثل استبدال التربة البيرلايت. تنظيف عينة الجذر بدقة من rhizosheath. إزالة جزيئات التربة الكبيرة باستخدام ملاقط، وإذا كانت جزيئات أصغر موجودة، إزالتها عن طريق غسل نظام الجذر مع الماء المقطر. تصوير فوتوغرافي إذا لزم الأمر للرجوع إليها في المستقبل. حدد واستئصال قسم صغير من الجذر الليفي خالية من rhizosheath باستخدام مشرط.
- لعلاج فراغ، ضع العينة في أنبوب 1.5 مل تحتوي على حل تثبيت مناسبة. اترك غطاء الأنبوب ، ثم أغلق الأنبوب بال parafilm لختم فتحة الأنبوب. ثم، ثقوب لكمة في الفيلم مع أداة حادة للسماح للتهوية من الأنبوب.
- ضع أنبوب العينة في غرفة فراغ، وختم الغرفة، وتوصيل مضخة فراغ غشاء المختبر إلى الغرفة. تخضع العينة لمعالجة الفراغ لمدة تصل إلى 30 دقيقة ، لتقليل وجود جيوب الهواء داخل العينات البيولوجية. وقف العلاج فراغ عندما لا ينظر فقاعات الهواء الهروب من العينة.
- أثناء النظر من خلال منظار مجسم، استخدم ملاقط لغمر العينة في وسط التسلل الذي تم إعداده مسبقًا. اغسل عينة من الحطام المحتمل.
- أدخل العينة في الشعيرات الدموية باستخدام الملاقط، في حين أن كلا من الشعيرات الدموية والعينة مغمورة بالكامل لتجنب إدراج فقاعات الهواء. استخدام أصغر الشعيرات الدموية أو حقنة إبرة تلميح كقضيب دفع (الشكل 2B).
- خذ عينة الشعيرات الدموية من زجاج الساعة المتوسط، باستخدام الملاقط. في حالة PFD، تغطية غطاء طبق بيتري.
- شكل ورقة الأنسجة إلى نقطة غرامة واستخدامها لإزالة حوالي 1 مم من السائل من طرفي الشعيرات الدموية.
- تذوب كمية صغيرة من الشمع الشعري باستخدام قلم الشمع. تطبيق الشمع على كلا الجانبين. الشمع سوف تتحول معتمة عندما يقوي. الحرص على استبعاد فقاعات الهواء من الشعرية (الشكل 2C).
ملاحظة: تجنب ارتفاع درجة حرارة الشمع أو الشعيرات الدموية لأن هذا قد يسبب تغلي المتفجرة، فضلا عن جيوب التجويف عندما يبرد عينة الانتهاء. - بعد ذلك، كشط من الشمع الزائد من الخارج من الشعيرات الدموية باستخدام مشرط ومسح نظيفة مع ورق الأنسجة الجميلة.
3. تركيب العينة
- ضع ميكروكويل تحت المجسم المجسم وأدخل العينة باستخدام ملاقط مع الحفاظ على ثبات microcoil (الشكل 2D).
- استخدام قضيب لمركز العينة في مصغرة، عن طريق انزلاق الشعرية داخل لفائف اللولبية.
- اختياريا، وتطبيق شريط لاصق لإصلاح موقف شعري.
- فحص الشعرية لضمان عدم وجود فقاعات الهواء مرئية داخل لفائف اللولبي، لتجنب تلف إشارة MR الناجمة عن الاختلافات القابلية للحساسية.
- إرفاق microcoil إلى مقبس قاعدة التحقيق، مع الحفاظ على مصغرة تستقيم(الشكل 3A, 3B).
- حرك بعناية لفائف التدرج الثلاثي المحور فوق الميكروفويل أثناء مطابقة موصلات تبريد الماء للتدرج إلى قاعدة المسبار(الشكل 3C). قم بتشغيل مؤشر البراغي على قاعدة المسبار لإصلاح التدرج في مكانه.
ملاحظة: هذه الخطوة تنطبق على مسبار Micro5 فقط. في حالة الأنظمة الأخرى مثل Micro2.5 أو Biospect، التدرجات على مأخذ منفصل من الملف.
4. تحديد خصائص لفائف
- إذا تم اختبار الملف لأول مرة، استخدم حل العينة المرجعية لإنشاء عينة متجانسة، وهو مفيد لمعايرة الطاقة واختبارات تجانس B1. قد يتم اختبار مشاكل التعرض المحتملة بسبب أسلاك لفائف بسهولة مع هذه العينة المرجعية.
- أدخل المسبار في المغناطيس وتوصيل الكابلات اللازمة: RF إرسال / استقبال كابل، خطوط تبريد المياه، كابل ثيرموبل وخط تبريد الهواء.
- تعيين درجة حرارة تبريد الماء المطلوب (298 K الموصى بها) لوحدة تبريد المياه.
- تعيين درجة الحرارة المستهدفة (298 كيلو) وتدفق الغاز المستهدف (300 لتر / ساعة). قد يكون تدفق الغاز مختلفاً عن تصميم ملف مختلف أو حجم العينة. وهذا ينطبق فقط على الأنظمة ذات نظام التحكم في درجة الحرارة.
ملاحظة: الخطوات التالية ضرورية فقط عند اختبار لفائف رواية (منزلية الصنع). - قم بتوصيل المسبار باستخدام كابل محوري مشترك 50 Ω بمحلل شبكة مع عرض اكتساح واسع بشكل مناسب (400 ميجاهرتز)، مركز على تردد الرنين المقصود.
- مراقبة أوضاع الرنين عن طريق ضبط متغير مطابقة وضبط المكثفات الموجودة في قاعدة التحقيق.
- قم بتناغم وتطابق وضع الرنانة مع التردد المطلوب.
- اختياريا، تحديد عامل الجودة لفائف (عامل Q) على محلل الشبكة. طريقة واحدة للحصول على عامل الجودة هو استخدام شبكة اقتران وتقسيم تردد مركز (وج) من خلال عرض تراجع انعكاس في -7 ديسيبل (أي ، س = وج / (و1 -- و2 )14. تعيين وج إلى تردد التشغيل من المغناطيس، في حين يتم تعيين و1 و و 2 إلى نقطة -7 ديسيبل اليسار واليمين من وج،على التوالي. بعض أجهزة تحليل الشبكة لديها Q-factor تحديد المضمنة.
- بدء اختبار انعكاس على الماسح الضوئي، وعادة ما يسمى منحنى تمايل، وضبط ضبط ومطابقة حسب الضرورة. من المستحسن تعيين أي ضبط ومطابقة المكثفات إلى نقطة الوسط من نطاقها للفائف جديدة. لذلك، تبدأ مع عرض اكتساح طيفي عالية. في بعض الحالات، قد يكون أكثر ملاءمة لضبط وتطابق لفائف خارج المغناطيس على محلل شبكة.
- حدد ملف الرقائق لأكبر ملف حجم من مسبار التصوير إذا كان متوفراً. إذا بدء تشغيل من ملف تم استخدامه مسبقاً، استخدم ملف الرقائق المتوفرة. إذا لم يتوفر كلا الخيارين، ابدأ بتعيين كافة قيم الرقائق إلى 0.
- حدد تكوين الملف الصحيح للميكروفويل إذا كان متوفراً في برنامج التصوير (أيParaVision). خلاف ذلك، إنشاء تكوين لفائف جديدة مطابقة لمواصفات لفائف (على سبيل المثال، ضبطها واحدة أو ضبطها مرتين) وفقا لدليل النظام. تقديرات للحدود الآمنة لهذا الكولوت اللولبي المستخدمة في هذا البحث مع 1.5 ملم القطر الداخلي في الحجم هو 1 مللي ثانية في 1 واط ذروة الطاقة و 1 ميغاواط الطاقة المستمرة.
تنبيه: المكثفات الصغيرة (عادة 1 مم في الحجم) اللازمة للميكروفين حساسة للغاية وتتلف بسهولة من قبل الفولتية العالية. قد لا يعمل تحديد طاقة النبض الآلي مع لفائف غير قياسية، ويمكن أن تسبب القوى العالية أيضًا تلفًا لللفائف أو أجزاء أخرى من المطياف. ولذلك، يوصى بإجراء تعديلات يدوية. - سجل منحنى nutation للفائف جديدة للحصول على إشارة إلى قوة الترددات الراديوية الصحيحة لللفائف (الشكل 4). في حالة الحدود الآمنة لللفائف غير معروفة، تبدأ مع 10 ميكروغرام في قوة نبض منخفضة من 0.6 واط وزيادة ببطء أطوال النبض بمقدار 1 ميكروغرام في وقت إلى أن تظهر الإشارة.
- باستخدام تجربة FID في غياب الترميز التدرجي، تختلف طول RF-نبض بشكل منهجي مع الحفاظ على قوة النبض ثابتة. طول النبض المثالي هو طول النبض، حيث تصل شدة الإشارة إلى الحد الأقصى. إذا اختبار لفائف جديدة، استخدم نبضة 10 ميكروغرام مع قوة منخفضة جدا أولا والبدء في زيادة قوة النبض تدريجيا.
ملاحظة: في حالة الطاقة أعلى بكثير مما كان متوقعا لمزيج من خصائص لفائف والمطياف، وهذا هو بالفعل إشارة إلى أن وضع رنانة خاطئ قد تم اختيارها. - بالنسبة للفائف مع B1متجانسة -field، مثل لفائف اللولبية، حدد نبضة 180 درجة حيث تنخفض كثافة الإشارة إلى صفر22.
- باستخدام تجربة FID في غياب الترميز التدرجي، تختلف طول RF-نبض بشكل منهجي مع الحفاظ على قوة النبض ثابتة. طول النبض المثالي هو طول النبض، حيث تصل شدة الإشارة إلى الحد الأقصى. إذا اختبار لفائف جديدة، استخدم نبضة 10 ميكروغرام مع قوة منخفضة جدا أولا والبدء في زيادة قوة النبض تدريجيا.
- تعيين 90 درجة من النبضة المحددة في بطاقة التكيف من الدراسة التي تم إنشاؤها. في ParaVision، يمكن استخدام بطاقة ضبط الطاقة المرجعية لإدخال طاقة النبض الثابت.
- استخدام المسح الضوئي مع 3 شرائح المحلية، شريحة واحدة في كل من المحاور الأساسية الثلاثة، لتحديد موقع الملف داخل المغناطيس. للقيام بذلك، قم بتحميل مسح محلي من المكتبة الافتراضية من مطياف. بدءاً من حقل كبير من-عرض مع أي إزاحة من المستحسن. إجراء ضبط كسب المتلقي الآلي وبدء القياس يدويًا.
ملاحظة: إذا كان العينة في مركز نظام التدرج بالضبط، فسيظهر المسح الضوئي للمحايّة العينة. إذا كان الملف أو العينة غير مركزة في شرائح الصورة أو مفقود، يجب أن يتم ضبط المسح الضوئي للمحايّة، وفي هذه الحالة الخطوة 4.12 يحتاج إلى أن يتم تنفيذها مرة أخرى. - بدلاً من ذلك، استخدم طريقة تكميلية للعثور على نبضة 90 درجة الصحيحة استنادًا إلى تقييم الصورة. بمجرد العثور على طاقة نبض تقريبية باستخدام منحنى الطعم ، قم بضبط القوى النبضية تدريجياً للتحقق من الصورة لتجانس الحقل B1. بالنسبة لبعض لفائف مع حقل B1 غير متجانسة، قد يتم المبالغة في تقدير قوة النبض 90 درجة التي تم تحديدها باستخدام منحنى الطعم، مما يؤدي إلى المبالغة في البقعة الحلوة المطلوبة من الملف. في هذه الحالة، تقليل قوة النبض المرجعي والتحقق من الصور الجديدة مقابل الصور السابقة (الشكل 5).
- يدوياً اِشِد الحقل المغناطيسي استناداً إلى إشارة FID. وهناك أمر الموصى به ل shimming الأولي هو Z-Z2-Z-X-Y-Z-Z-Z-Z-XZ-YZ-Z. في حالة اللولبي، يكون محور التماثل الرئيسي في المستوى XY. لذلك، قد يؤدي shims في اتجاهات مختلفة في تصحيح أقوى من التجانس B0 لهذا التكوين لفائف. أعلى مرتبة الهمم لها تأثير يذكر ويمكن تجاهلها.
- حساب وحدة تخزين التي تم تسويتها للسماح بالمقارنة بين خصائص microcoil عبر أنظمة مختلفة، مقتبسة من بروتوكول الشركة المصنعة18. بالنسبة للميكرويات المستخدمة هنا ، استخدمنا تسلسلًا لـ spin-echo مع المعلمات التالية: حقل الرؤية (FOV) 6 مم × 6 مم ، وقت التكرار (TR) 1000 مللي ثانية ، وقت الصدى (TE) 7 ms ، Matrix 256 × 256 وسمك الشريحة = 0.5 مم. ضبط سمك الشريحة حتى كسب المتلقي هو وحدوي. بعد ذلك، قم بضبط عدد الشرائح بحيث تمتد الشرائح إلى ما وراء منطقة تجانس الحقل B1. تسجيل الصور دون متوسط إشارة، إذا كان ذلك ممكنا.
- تحديد وحدة التخزين التي تم تسويتها SNR (SNR/mm3)في خطوتين. أولاً، احسب حجم voxel(Vvoxel)(Eq. 1):
(1)
ملاحظة: وحدات Dxو Dy و Dشريحة في mm. ويمكن أيضا أن يتم إجراء هذا الحساب لسلسلة من شرائح. - حدد المناطق ذات الأهمية لتحديد شدة الإشارة (μROI) للعينة ، وكثافة الإشارة (μالضوضاء)والانحراف المعياري (σالضوضاء) لمنطقة خارج العينة (أي الضوضاء). يتم أخذ الإشارة الوسط من وسط الصورة، بينما يتم حساب إشارة الضوضاء من بقع الزاوية (الشكل 6). ويمكن استخدام برنامج التحكم في المطياف أو برنامج معالجة الصور للأغراض العامة لهذه الحسابات. استخدام التكرار واحد إذا كان ذلك ممكنا، للحفاظ على قابلية المقارنة بين لفائف مختلفة.
- استخدم القيم لحساب وحدة تخزين تم تسويتها SNR (Eq. 2):
(2)
لللفائف المستخدمة هنا في تركيبة مع الحل المرجعي، وذلك باستخدام Eq. 2 النتائج في الحل التالي:
(3)
ملاحظة: عند مقارنة SNR من لفائف في مختلف نقاط القوة المجال المغناطيسي، خصائص الاسترخاء من الوهمية تحتاج إلى قياس23،ما لم يتم استخدام وقت تكرار طويل جدا ووقت صدى قصيرة جدا.
- تحديد وحدة التخزين التي تم تسويتها SNR (SNR/mm3)في خطوتين. أولاً، احسب حجم voxel(Vvoxel)(Eq. 1):
- التحقق من وجود مشاكل التعرض بسبب عدم فهم المجال المغناطيسي: تحميل وتشغيل تسلسل متعدد الانحدار صدى (MGE)(الشكل 7). اسبرها في مجال المغناطيسي inhomogeneities بسبب الاختلافات القابلية للحساسية في الصور مع أوقات صدى أطول، كما لا يعيد تركيز دورانات، التي dephase بسبب inhomogenities مجال ثابت. وبهذه الطريقة، يمكن تصور التشوهات في العينة (بسبب مساحات الهواء في العينة)، وكذلك اhomogeneities الحقل B0 التي أدخلتها المواد لفائف. استخدام المعلمات التالية، ليتم تعديلها تبعا لمواصفات الطيف ولفائف المستخدمة: TR 200 مللي ثانية، TE 3.5 مللي ثانية مع 48 أصداء متباعدة 3.5 مللي ثانية، زاوية الوجه 30 درجة. حجم المصفوفة 128 × 128.
ملاحظة: إذا تم ملاحظة عدة أوضاع رنانة (محتملة) أو تراجعات انعكاسية في منحنى الرنين (تمايل)، كرر الخطوات المذكورة أعلاه لكل وضع رنان لتحديد الأكثر حساسية. اعتمادا على microcoil، قد تكون أجزاء مختلفة من تجميع microcoil عرضة لأوضاع الرنين غير مقصودة.
(1)
(2)
(3)5. التصوير عالية الدقة
- تشغيل تجربة 3D-FLASH مع المعلمات التالية: TR 70 مللي ثانية، TE 2.5 مللي ثانية، حجم مصفوفة 128 × 64 × 64، FOV 1.6 × 0.8 × 0.8 مم، زاوية الوجه 30 درجة، وعرض النطاق الترددي المتلقي 50 كيلوهرتز.
- اشتقاق القوى النبض من قوة النبض المرجعية التي تم تحديدها في وقت سابق؛ هذا هو التلقائي في معظم برامج التصوير. تحديد كسب المتلقي باستخدام التعديلات التلقائية. ضبط FOV إذا لزم الأمر، تغطي الكائن كله في كلا الاتجاهين المرحلة الترميز لتجنب aliasing. تشغيل محاكاة دورة العمل التدرج، إذا كان متوفرا على النظام، للتحقق من أن دورة واجب التجربة يبقى ضمن مواصفات لفائف التدرج.
ملاحظة: هذه المعلمات محددة إلى الملف المستخدم في العرض التوضيحي; من المهم تحسين تفاصيل النظام المحلي.
6. استعادة العينات لمزيد من الدراسة أو التخزين
- إزالة عينة الشعيرات الدموية من مصغرة.
- باستخدام ملاقط، إزالة المقابس الشمع تحت منظار مجسم.
- استخدام حقنة لغسل العينة من الشعرية مع حل من خيار. بدلاً من ذلك، استخدم قضيب pusher الزجاج لإخراج العينة.
- لمنع جفاف العينة، قم بتخزينها في وسط مناسب للتخزين.
Representative Results
توصيف الملف
عند ضبط ناجحة ومطابقة لللفائف، قد تتميز أدائها من قبل لفائف عامل Q-عامل، 90 درجة نبضة مرجعية، و SNR/ مم3. ل1.5 ملم معرف قابلية الحساسية اللولبية لفائف أظهرت هنا، قياس Q-factor (تفريغ) كان 244، مقارنة مع 561 للفائف قفص الطيور 5 مم.
وكان المرجع 90 درجة نبض 12 μs في مستوى الطاقة من 0.6 W; cf. 5 μs في 45 W ل 5 ملم لفائف قفص الطيور(الشكل 4 والشكل 5). وهذا يعادل قوة حقل نبض RF(B1)،باستخدام 
0.53 mT للميكريل و 1.17 mT للفائف قفص الطيور14 حيث y هو نسبة الدوران، في حين أن تاو هو مدة النبض. منذ مستويات النبض الطاقة(ف)تختلف، يمكن مقارنة لفائف من حيث كفاءة 
الإرسال: 0.69 mT/W1/2 و 0.18 mT/W1/2 لصغري والطيور على التوالي14. مقارنة بنبض 90 درجة، تم العثور على ميكروكويل أن يكون عاملا ≈ 4 مرات أكثر حساسية من لفائف قفص الطيور.
تأثير مطابقة القابلية للحساسية
في قوة حقل عالية جدا، عينة و ملف الحساسية تصبح عاملا مهيمنا لجودة الصورة، كما رأينا في الشكل 7A، 7B. بالمقارنة مع لفائف تفتقر إلى خزان السوائل مطابقة القابلية للحساسية، يتم الاحتفاظ إشارة أطول وأكثر تجانسا في عينة مرجعية. ومع ذلك، نظراً لخزان القابلية للقابلية، فإن الحد الأقصى لأبعاد العينة يقل فيما يتعلق باللولب بدون الخزان.
التصوير عالي الدقة
تم تحقيق دقة عالية من 13 × 13 × 13 μm3 من عينة جذر طاعونة Medicago في 20 ساعة و 23 دقيقة (الشكل 8). بدءا من سطح الجذر ، وينظر إلى قشرة الجذر ، جنبا إلى جنب مع بعض المياه المتبقية على السطح الخارجي للجذر. وعلاوة على ذلك، لوحظ xylem كق الشريط المظلمة التي تحيط بالفلوم. ويلاحظ بعض جيوب الهواء والبقع الداكنة مع فقدان إشارة كاملة.
ويمكن أيضاً تصوير العقيدات الجذرية التكافلية من M. truncatula باستخدام هذا البروتوكول (الشكل 9). وباستخدام لفائف أكبر قليلاً لا مثيل لها (طول حوالي 3500 ميكرومتر، قطر داخلي 1500 ميكرومتر)، تم الحصول على صور بدقة تصل إلى 16 × 16 × 16 ميكرومتر3 في 33 دقيقة.
الشكل 1: ميكروكول اللولبي. (أ)يتكون تصميم الملف اللولبي من سلك حلقي حلقي، عادة ما يلف حول الشعيرات الدموية. هندسة السلك، مثل سمكه، القطر، عدد اللفات، وتباعد الأسلاك، تؤثر على خصائص لفائف. (ب) ميكروكول اللولبي منزلي الصنع مع خزان لسائل مطابقة القابلية للحساسية (Fomblin). وهو يتألف من 0.4 مم سميكة المغلفة النحاسية الجرح الأسلاك ست مرات حول الشعرية مع القطر الخارجي من 1500 ميكرومتر وطول لفائف من 3500 μm. غمّرت اللولب في خزان أيّ يكون مصنوعة من حقنة. يمكن إدخال الشعيرات الدموية العينة تصل إلى قطر خارجي من 1000 μm. يتم استخدام اثنين من المكثفات، ومكثف 1.5 pF في سلسلة مع المحث والثاني متغير 1.5-6 pF المكثف وضعت بالتوازي مع المحث. يتم لحام جميع المكونات إلى لوحة الألياف الزجاجية (أصفر). يتم تركيبه على حامل تجاري (بوليمر رمادي) يتم تعديله لدعم الخزان. (C)مكونات تصميم لفائف اللولبية: 1. لفائف اللولبية، 2. عينة شعرية، 3. 1.5 pF ضبط مكثف، 4. متغير مطابقة مكثف، 5. لوحة قاعدة الألياف الزجاجية، 6. خيوط الأسلاك النحاسية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد العينة تحت منظار مجسم. (أ)العناصر اللازمة لإعداد مصغرة. من اليسار إلى اليمين: 1. CuSO4 الحل المرجعي، 2. البيرفلوروديكالين، 3. ميكروكويل، 4. مشرط، 5. التوتر الإيجابي ملاقط، 6. ملاقط، 7. الشعيرات الدموية القطر الخارجي = 1000 ميكرومتر، 8. قلم الشمع، 9. شمع الشعيرات الدموية، 10. قفازات نيتريل، 11. منظار مجسم، 12. مشاهدة الزجاج مع غطاء طبق بيتري، 13. المواد النباتية في الركيزة النمو. غير مبين: 2 مل حقنة مع ø 0.8 × 40 ملم إبرة ورق الأنسجة الدقيقة. (ب) عن قرب من الإدراج عينة في شعري باستخدام ملاقط، في حين يتم الاحتفاظ على حد سواء مغمورة. (C) ختم الشعيرات الدموية باستخدام الشمع المنصهر. (D) إدراج الشعيرات الدموية المعدة في مصغرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مكون مسبار التصوير الجزئي. (A)قاعدة مسبار Micro5، تحتوي على جميع الاتصالات اللازمة لتبريد المياه، والتدفئة، وأجهزة استشعار درجة الحرارة، وقوة التدرج، RF (موصل مشترك محوري مرئية) وتحديد التحقيق اختياريا (PICS). تحت قاعدة التحقيق هي المقابض التي تسمح لضبط ضبط ضبط ومكثفات مطابقة متغير، فضلا عن الاحتفاظ مسامير لعقد التحقيق في مكان داخل مطياف. (ب) وصغرى بنيت المنزل تصاعد فوق قاعدة التحقيق. لاحظ المكثفات المتغيرة (السيراميك الأبيض) التي شنت على قاعدة التحقيق التي تسمح لضبط ومطابقة. (C) التدرج ثلاثي المحور المتكامل المثبت على قاعدة المسبار مع أوعية تبريد الماء والاتصالات المطلية بالذهب لـ الاستناد إلى التدرج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: منحنى الطعم. يتم الحصول على منحنى الطعم لتحديد قوة النبض المرجعية. تُعرَّف طاقة النبض المرجعية (90 نبضة) بأنها مزيج من الطاقة وطول النبض اللازم لتوليد حقل B1 الذي يقلب كل المغنطة المتاحة في اتجاه z إلى المستوى المُنَحَر. يتم تسجيل سلسلة من النبض في غياب الترميز التدرجي. مع كل نبضة، إما طول النبض أو طاقة النبضة تُزدّد. هنا يتم تعيين طاقة النبض إلى 0.6 واط، في حين أن طول النبض يتزايد بمقدار 1 ميكروغرام في كل مرة. تشير شدة الإشارة القصوى إلى النبضة 90 درجة، أي حوالي 12 ميكروغرام. ويمكن أيضا أن يتم تحديد 180 درجة نبض بهذه الطريقة باستخدام الحد الأدنى من كثافة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحديد بصري لسلطة النبض 90 درجة. مرة واحدة وقد تم العثور على قوة النبض المرجعية التقريبية باستخدام منحنى nutation، فإنه يمكن التحقق بصريا من خلال تغيير طول النبض. اعتماداً على الملف، قد يكون الحقل B1 أكثر أو أقل حساسية للتغييرات. (A) 11 ميكرومتر طول النبض. (B) 12 ميكرومتر طول النبض، الأمثل لهذا الملف. (C) 13 ميكرومتر طول النبض. (D) 20 ميكرومتر طول النبض. إذا تم تعيين طاقة النبض عالية جداً، قد يحدث الإفراط في البقشيش، وبالتالي تقليل كثافة الصورة في وسط الملف (رأس السهم). يزيد الحقل B1 المتزايد أيضًا من نطاق الملف ، كما يمكن ملاحظته في عرض الصورة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: منطقة التنسيب في مجال الاهتمامات. يمكن رؤية المناطق ذات الاهتمام (ROI) لحساب وحدة التخزين التي تم تسويتها. يتم أخذ متوسط كثافة العينة من عائد الاستثمار الذي يقع ضمن نموذج الحل المرجعي. يتم حساب متوسط الضوضاء والانحراف المعياري من عائد استثمار واحد أو أكثر يقع في زوايا الصورة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تجانس الترددات الراديوية (RF) الذي تم تقييمه بواسطة تصوير الصدى التدرجي. يتم استخدام تسلسل ارتدادي متدرج متعدد (MGE) لتقييم تجانس التردد اللاسلكي(B1 -Field) باستخدام سلسلة من الأصداء المتدرجة. وكانت المعلمات الأساسية: تكرار الوقت 200 مللي ثانية، صدى الوقت 3.5 مللي ثانية مع عدد من أصداء 48، صدى تباعد 3.5 مللي ثانية، 64 متوسطات، وقت الاستحواذ 27 م 18 s، زاوية الوجه 30°. وكان مجال الرؤية 5 × 5 ملم، مصفوفة 128 × 128، القرار 39 × 39 × 200 ميكرومتر. (أ) قابله قابله اللولب. السائل القابلية للحساسية مطابقة (فومبيلين) المحيطة لفائف الترددات اللاسلكية يقلل من آثار القابلية للحساسية بسبب سلك لفائف. تسبب فقاعات الهواء الصغيرة فقدان الإشارة مع زيادة وقت الصدى. (B) لفائف (لا مطابقة الحساسية) مع قطر لفائف متساوية. في أوقات صدى أطول، لوحظ زيادة التحف الناجمة عن B0 عدم فهم الحقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: التصوير ثلاثي الأبعاد لقسم جذر مُلَكَمِيَةِ مُلَكَمِيَة. (أعلى) صورة فلاش. يمكن تمييز العديد من ميزات القسم الجذر، بما في ذلك البشرة (ه)، القشرة (ج)، الفلوم (ph) و xylem (xy). جيوب الهواء (أ) في السبب الجذري فقدان إشارة كاملة. وكانت المعايير الأساسية على النحو التالي: تكرار الوقت 70 مللي ثانية، صدى الوقت 2.5 مللي ثانية، 256 متوسطات، وقت الاكتساب 20 ساعة 23 م. القرار 13 × 13 × 13 ميكرومتر3. وكان حجم المصفوفة 128 × 64 × 64 ومجال الرؤية 1.6 × 0.8 × 0.8 مم. عرض النطاق الترددي لجهاز الاستقبال 50 كيلو هرتز. (أسفل) MSME الصورة. وكانت المعايير الأساسية على النحو التالي: تكرار الوقت 500 مللي ثانية، صدى الوقت 5.2 مللي ثانية، 28 متوسطات، وقت الاكتساب 15 ساعة 55 م. القرار 13 × 13 × 13 ميكرومتر3. وكان حجم المصفوفة 128 × 64 × 64 ومجال الرؤية 1.6 × 0.8 × 0.8 مم. عرض النطاق الترددي لجهاز الاستقبال 70 كيلو هرتز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: التصوير ثلاثي الأبعاد للعقيدات الجذرية لـ Medicago. (أعلى) صورة منخفضة الدقة. وكانت البارامترات الأساسية على النحو التالي: زمن التكرار 60 مللي ثانية، زمن الصدى 2.3 مللي ثانية، 4 متوسطات، وقت الاكتساب 4 م. القرار 31 × 31 × 31 ميكرومتر3. وكان حجم المصفوفة 64 × 32 × 32 ومجال الرؤية 2 × 1 × 1 مم. عرض النطاق الترددي لجهاز الاستقبال 50 كيلو هرتز. (أسفل) صورة عالية الدقة. وكانت البارامترات الأساسية على النحو التالي: تكرار الوقت 60 مللي ثانية، صدى الوقت 2.3 مللي ثانية، 8 متوسطات، وقت الاكتساب 33 م. القرار 16 × 16 × 16 ميكرومتر3. وكان حجم المصفوفة 128 × 64 × 64 ومجال الرؤية 2 × 1 × 1 ملم. عرض النطاق الترددي لجهاز الاستقبال 50 كيلو هرتز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هذا البروتوكول هو الأنسب للعينات البيولوجية، والعديد من المواد والعينات الجيولوجية لديها أقصر بكثير T2 أوقات الاسترخاء، والتي لا يمكن أن تكون صورة من قبل التسلسلات المستخدمة هنا. حتى بعض الأنسجة البيولوجية، التي تظهر ارتفاع عينة المغناطيسي عدم القابلية للخواص، يمكن أن يكون من الصعب صورة في مجال فائقة عالية كما ترتبط الآثار لقوة الحقل24. البروتوكول ليس فقط مفيدة للفائف جديدة ولكن قد تساعد أيضا في استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتشخيص المشاكل المحتملة. عند اختبار عينات جديدة أو غير معروفة، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول مسبقاً على الحل المرجعي للتحقق من أن الإعداد التجريبي يعمل وفقاً للمواصفات. يساعد هذا في استكشاف الأخطاء وإصلاحها منذ أن يمكن استبعاد مطياف كمصدر من القطع الأثرية والأعطال. بالإضافة إلى ذلك، هذا يعين المكثفات التوليف ومطابقة على التحقيق إلى القيم النموذجية للميكويل.
عندما يتم تسجيل أي إشارة على التجربة الأولى، يمكن توسيع مجال عرض المسح localizer للتحقق من ما إذا كان ينظر إلى العينة. بعد ذلك، إعادة التحقق إذا تم ضبط الملف بشكل صحيح وحاول آخر المسح الضوئي المحلي. فمن الممكن أن لفائف يسلك وسائط رنانة غير مقصودة إضافية، وفي هذه الحالة الصحيح واحد يحتاج إلى تحديد. إذا لم يكن بالإمكان الحصول على أي صورة حتى الآن، قم بإزالة العينة للتحقق من موقعها داخل مجموعة الميكرويوتر والتحقق من أن العينة سليمة (أي لا توجد فقاعات هواء أو تسربات في الأختام). وأخيراً، يمكن إعداد عينة بالماء بدلاً من PFD. في حالة إعطاء العينة إشارة يمكن اكتشافها قليلا في المسح localizer، لا يزال يمكن الكشف عن المياه المحيطة بها في الشعرية.
كما microcoils هي من الناحية المثالية قريبة جدا من العينة، يمكن أن الاختلافات القابلية للحساسية المغناطيسية بين الهواء والأسلاك يسبب خسارة إشارة إضافية، كما رأينا في الشكل 7B. وتشمل القطع الأثرية المحتملة سوء تحديد المكانية واختلاف كثافة الإشارة الشاذ. وتتأثر بشكل خاص تسلسلات نبض نوع الارتدادات من خلال فقدان الإشارة غير الموحد. لهذا السبب، قدمنا لفائف قابلة للحساسية مطابقة، عن طريق غمر السلك في سائل الفلورينرت (فومبيلين أو FC-43). ويمكن لطريقة التقدير B1 المدرجة في هذا البروتوكول أن تساعد في تحديد ما إذا كانت الاختلافات في قابلية الحساسية من B1 تبرر إدراج استراتيجيات مطابقة القابلية للحساسية في تصميم تجميع الملف. نهج بديل لبناء لفائف قابله للقابلية هو استخدام الأسلاك قابله للمطابقة25. وعلاوة على ذلك، يتم معالجة المسائل القابلية للتأثر فقط بسبب الملف مع هذا النهج. ولا تزال حالات عدم التطابق داخل العينة (على سبيل المثال بسبب المساحات الجوية) صعبة.
تشكل جيوب الهواء أو الفقاعات تحديًا تجريبيًا يسبب فقدانًا واسعًا للإشارة ، بسبب الاختلافات القابلية للحساسية عند واجهة الهواء والسوائل أو العينة19 (الشكل 5A). جانب حاسم من إعداد العينة الناجحة هو غمر كل من العينة والشعيري. ومع ذلك، يمكن أن تتسبب حتى الفقاعات الصغيرة في خسائر الإشارة، خاصة بالنسبة لمتواليات نوع الصدى التدرجي. يمكن أن تهاجر فقاعات الهواء المحمول عبر الشعيرات الدموية حتى تكون على اتصال بالعينة. بعض هذه الآثار يمكن تخفيفها عن طريق إمالة قليلا الشعرية بحيث نهاية واحدة أعلى من الأخرى. يضمن الإمالة عقد فقاعات الهواء المحتملة في مكان في نهاية أعلى، دون إزعاج العينة. من المهم أيضا التحقق من أن الشمع الشعري يشكل ختم جيد، كما يمكن أن يسبب الجفاف فقاعات الهواء الكبيرة لتشكيل.
للمساحات الهوائية داخل العينة، تم استخدام PFD لملء مساحات الهواء بين الخلايا في حين لا تخترق أغشية الخلايا26. ومع ذلك، حتى مع هذا النهج، لم نتمكن من إزالة جميع المساحات الجوية. بالإضافة إلى ذلك، هذا النهج يعني أننا بحاجة إلى وكيل إضافي، والذي عادة ما لا يفضل بسبب الرغبة في دراسة نظام كما nonininsively ممكن.
الشكل الأسطواني من الشعيرات الدموية يعني أن الاجهزة في الفير يجب أن تكون قابلة للحياة، وخاصة بالنسبة للأنسجة المعرضة للاضمحلال، مثل الخزعات أو دراسة العمليات في المواد الجذرية الحية. يمكن أن تحقق خطوتين إعداد perfusion. أولاً، ربط أنبوب تغذية متوسطة بالإضافة إلى أنبوب استنزاف على جانبي الشعيرات الدموية سيكون كافياً لإنشاء chemostat. ثانياً، يمكن أن يؤدي إضافة مسافة بادئة في عينة الشعيرية إلى الاحتفاظ بالعينة في مكانها مقابل اتجاه التدفق. وهذا يماثل بروتوكول نشر للميكروفات الدقيقة10.
الطبيعة غير الباضعة للتصوير MR، جنبا إلى جنب مع السائل الخامل المستخدمة في هذا البروتوكول (PFD أو فومبيلين) يعني بعد الانتهاء من التجارب، قد تتم إزالة العينات من الشعيرات الدموية لمزيد من الدراسة. وتشمل التركيبات المجهر البصري أو الإلكتروني وتقنيات التصوير الهدامة الأخرى. لقد أظهرنا مؤخرا تركيبة مع المجهر البصري على ميديكاغو truncatula العقيدات الجذر27.
لقد أظهرنا طريقة لتصوير المواد النباتية باستخدام ميكروكويلات مخصصة على مطياف NMR الميدانية العالية للغاية. ويمكن دراسة كميات كبيرة نسبيا عينة في دقة عالية مع التجانس RF جيدة. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء التصوير الطيفي بدقة أعلى مما هو ممكن. يتم تسهيل تكييف تصميم microcoil للعينات بواسطة طريقة فعالة لتحديد خصائص أداء الملف. كما يمكن تطبيق نهج اللولبية اللولبية بسهولة على عينات أخرى غير النباتات، بما في ذلك الأنسجة الحيوانية.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم التجارب في جهاز MHz 950 من قبل UNMR-NL، وهو مرفق خارطة طريق وطني واسع النطاق ممول من NWO في هولندا (المشروع 184.032.207). وقد دعم مشروع اتحاد الخلايا البيولوجية الشمسية (BioSolarCells U2.3) R.S. وقد تم دعم J.R.K. من قبل مدرسة هولندا لبحوث الرنين المغناطيسي (NMARRS) كلية الدراسات العليا [022.005.029]. نشكر ديفنغ شين وتون بيسلينغ لتقديم عينات من "ميديكيغو" ." كما نشكر كلاارتي هوبن وماري رينو ويوهان فان دير زوان على الدعم التقني في منشأة UNMR-NL. ونود أيضا أن نشكر فولكر ليمان، وهيني يانسن، وبيتر دي وابارد على المساعدة التقنية. ونعرب عن امتناننا لفرانك فيرلد، وجون فيليب، وكارتيك ب. ساي سانكار غوبتا على نصائحهم. وأخيراً، نشكر جيسيكا دي رويتر على تقديمها الصوت إلى الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference solution preparation | |||
| CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
| D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
| Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
| Sample preparation | |||
| Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
| Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
| Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
| Syringe | Generic | - | Used to apply PFD and manipulate the sample |
| Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
| Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
| Imaging Hardware | |||
| 22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
| Air cooler | Bruker GmbH | - | Used to regulate probe temperature |
| Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
| Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
| Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
| RF microcoil | Home-built | - | contains Fomblin |
| Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
| Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |
References
- Ciobanu, L., Pennington, C. H. 3D micron-scale MRI of single biological cells. Solid State Nuclear Magnetic Resonance. 25 (1-3), 138-141 (2004).
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Radecki, G., Nargeot, R., Jelescu, I. O., Le Bihan, D., Ciobanu, L. Functional magnetic resonance microscopy at single-cell resolution in Aplysia californica. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8667-8672 (2014).
- Lee, C. H., et al. Magnetic Resonance Microscopy (MRM) of Single Mammalian Myofibers and Myonuclei. Scientific Reports. 7 (1), 39496 (2017).
- Callaghan, P. T. Principles of nuclear magnetic resonance microscopy. , Oxford University Press. Oxford. (1994).
- Glover, P., Mansfield, S. P. Limits to magnetic resonance microscopy. Reports on Progress in Physics. 65 (10), 1489-1511 (2002).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and analysis of microcoils for NMR microscopy. Journal of Magnetic Resonance. Series B. 108, 114-124 (1995).
- Lee, C. H., Flint, J. J., Hansen, B., Blackband, S. J. Investigation of the subcellular architecture of L7 neurons of Aplysia californica using magnetic resonance microscopy (MRM) at 7.8 microns. Scientific Reports. 5, 11147 (2015).
- Fratila, R. M., Velders, A. H. Small-Volume Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Annual Review of Analytical Chemistry. 4 (1), 227-249 (2011).
- Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition. Journal of Visualized Experiments. (128), 1-10 (2017).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design. Part I: Optimizing RF homogeneity and coil dimensions. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (2), 128-142 (2001).
- Vegh, V., Gläser, P., Maillet, D., Cowin, G. J., Reutens, D. C. High-field magnetic resonance imaging using solenoid radiofrequency coils. Magnetic Resonance Imaging. 30 (8), 1177-1185 (2012).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design Part II: Optimizing winding parameters for maximum signal-to-noise performance. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (3), 190-210 (2001).
- Haase, A., et al. NMR probeheads for in vivo applications. Concepts in Magnetic Resonance. 12, 361-388 (2000).
- Webb, A. G. Radiofrequency microcoils for magnetic resonance imaging and spectroscopy. Journal of Magnetic Resonance. 229, 55-66 (2013).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and Analysis of Microcoils for NMR Microscopy. Journal of Magnetic Resonance, Series B. 108 (2), 114-124 (1995).
- Olson, D. L., Peck, T. L., Webb, A. G., Magin, R. L., Sweedler, J. V High-Resolution Microcoil 1H-NMR for Mass-Limited, Nanoliter-Volume Samples. Science. 270 (5244), (1995).
- Oerther, T. Micro Imaging Manual for AV3 Systems. , Bruker Biospin GmbH. Rheinstetten, Germany. (2012).
- Callaghan, P. T. Susceptibility and Diffusion Effects in NMR Microscopy. Encyclopedia of Magnetic Resonance. , (2007).
- Donker, H. C. W., Van As, H., Snijder, H. J., Edzes, H. T. Quantitative 1H-NMR imaging of water in white button mushrooms (Agaricus bisporus). Magnetic Resonance Imaging. 15 (1), 113-121 (1997).
- Tsai, W. T. Environmental property modelling of perfluorodecalin and its implications for environmental fate and hazards. Aerosol and Air Quality Research. 11 (7), 903-907 (2011).
- Keifer, P. A. 90° pulse width calibrations: How to read a pulse width array. Concepts in Magnetic Resonance. 11 (3), 165-180 (1999).
- Vlaardingerbroek, M. T., den Boer, J. A. Magnetic Resonance Imaging: Theory and Practice. , Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg. 05252-05255 (2003).
- Schenck, J. F. The role of magnetic susceptibility in magnetic resonance imaging: MRI magnetic compatibility of the first and second kinds. Medical Physics. 23 (6), 815-850 (1996).
- Kc, R., Henry, I. D., Park, G. H. J., Aghdasi, A., Raftery, D. New solenoidal microcoil NMR probe using zero-susceptibility wire. Concepts in Magnetic Resonance Part B: Magnetic Resonance Engineering. 37 (1), 13-19 (2010).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).
- van Schadewijk, R., et al. Magnetic Resonance Microscopy at Cellular Resolution and Localised Spectroscopy of Medicago truncatula at 22.3 Tesla. Scientific Reports. 10 (1), 971 (2020).
