Summary
Представлен протокол изучения биологической ткани с высоким пространственным разрешением с использованием сверхвысокой полевой магнитно-резонансной микроскопии (ММРН) с использованием микрокоилов. Для характеристики микрокоилов предусмотрены пошаговие инструкции. Наконец, оптимизация визуализации демонстрируется на корнях растений.
Abstract
В этом протоколе описывается калибровка соотношения сигнала к шуму (SNR) и метод подготовки образцов для соленоидальных микрокоилов в сочетании с биологическими образцами, предназначенные для магнитно-резонансной томографии высокого разрешения (МРТ), также именуемой МР-микроскопией (МРТ). Он может быть использован в доклинических спектрометрах МРТ, продемонстрирован на образцах корня Medicago truncatula. Микрокоули повышают чувствительность, сопоставляя размер ресонатора RF с размером выборки интересов, тем самым позволяя более высокие разрешения изображений в данный момент времени сбора данных. Благодаря относительно простой конструкции, соленоидальные микрокоулы просты и дешевы в строительстве и могут быть легко адаптированы к требованиям образца. Систематически мы объясняем, как откалибровать новые или самодельные микрокои, используя справочное решение. Шаги калибровки включают: определение мощности импульса с помощью кривой гайки; оценка однородности РФ-поля; и расчет нормализованного объема соотношения сигнала к шуму (SNR) с использованием стандартных последовательностей импульса. Обсуждаются важные шаги в подготовке образцов для небольших биологических образцов, а также возможные смягчающие факторы, такие как различия в магнитной восприимчивости. Применение оптимизированной соленоидной катушки демонстрируется с высоким разрешением (13 x 13 x 13мкм 3, 2,2 рЛ) 3D-изображением корневого образца.
Introduction
Магнитно-резонансная томография является универсальным инструментом для неинвазивного изображения широкого спектра биологических образцов, начиная от человека доодиночных клеток 1,2,3. В то время как МРТ-сканеры для применения медицинской визуализации обычно используют магниты с силой поля от 1,5 Т до 3 Т, одноклеточные приложения изображения на гораздо более высоком полесильные 1,3,4. Изучение образцов при разрешениях ниже ста микрометров называется магнитно-резонансной микроскопией (МРН)5. Тем не менее, MRM страдает от низкого соотношения сигнала к шуму (SNR) по сравнению с другими доступными методами микроскопии или визуализации (например, оптическая микроскопия или КТ). Можно использовать несколько подходов для оптимизации SNR6. Один из подходов заключается в использовании более высокой силы магнитного поля, в то время как дополнительный подход заключается в оптимизации детектора сигнала для отдельных образцов. Для последних размеры детектора должны быть скорректированы в с тем, чтобы соответствовать размерам интересной выборки. Для небольших образцов диаметром ≈0,5-2 мм (например, корневых тканей) микрокои полезны, так как SNR обратно пропорционален диаметрукатушки 6,7. Разрешения выше, чем 7,8 х 7,8 х 15мкм 3 были достигнуты на клетках животных, используя выделенные микрокои8. Различные типы микрокоилов существуют, с планарными и соленоидными катушками, наиболее часто используемыми в зависимости от применения и геометриитканей 9. Планарные катушки имеют высокую чувствительность близко к их поверхности, что полезно для применения на тонких ломтиках. Например, был описан метод, разработанный специально для визуализации пролитой ткани для планарных микрокоилов10. Тем не менее, планарные катушки имеют высокую чувствительность и отсутствие четко определенной мощности эталонного импульса. Соленоидные катушки, будучи цилиндрическими, имеют более широкую область применения и более благоприятствования для более толстых образцов. Здесь мы описываем характеристики соленоидной катушки, протокол для подготовки образцов для мрт микрокоилов, а также калибровку соленоидной микрокоиловой(рисунок 1A).
Соленоидная катушка состоит из проводя провода спиральный, как штопор, вокруг капиллярного проведения образца (Рисунок 1B). Сборки микрокоилов могут быть построены с использованием только эмалированной медной проволоки, ассортимент конденсаторов, а также подходящую базу для припоякомпонентов (рисунок 1B). Основными преимуществами являются простота и низкая стоимость, в сочетании с хорошими характеристиками производительности с точки зрения SNR на единицу объемаи однородности поля B1. Простота конструкции позволяет быстро итерации катушки конструкций и геометрии. Конкретные требования к конструкции соленоидных микрокоилов и характеристика зонда (т.е. теория электроники, измерения рабочей скамьи, и спектрометр измерения для различных геометрий катушки) были описаны широко вдругом месте 7,11,12,13,14.
Соленоид катушки могут быть построены, имея в виду правила проектирования для желаемых размеров в соответствии с руководящими принципами,описанными в другом месте 15,16. В данном конкретном случае использовалась катушка с внутренним диаметром 1,5 мм, изготовленная из эмалированной медной проволоки диаметром 0,4 мм, зацикленные вокруг капилляра диаметром 1,5 мм. Этот соленоид проводится на базовой пластине, на которой делается схема, состоящая из тюнинг-конденсатора (2,5 pF), переменного конденсатора соответствия (1,5-6 pF), а также медных соединительных проводов(рисунок 1A, 1C). Тюнинг-конденсатор выбран для достижения желаемой резонансной частоты 950 МГц, в то время как соответствующий конденсатор выбран для достижения максимальной передачи сигнала при частоте 50 Ом. Чем больше конденсатор является переменной, чтобы обеспечить более тонкую регулировку. При регулярной эксплуатации настройка и сопоставление выполняются с использованием конденсаторов в базе зонда. Собранный микрокоил должен быть установлен на зонд, так что он может быть вставлен в магнит. В зависимости от системы может потребоваться дополнительный держатель. Здесь мы используем комбинацию магнитов 22,3 Т с помощью bruker Console Avance III HD в сочетании с зондом Micro5. В этом случае мы использовали модифицированную вставку поддержки, оснащенную необходимыми соединениями для подключения к каналу 1H зонда(рисунок 1A).
Конструкция катушки, соответствующая восприимчивости, включает резервуар с перфторированной жидкостью для уменьшения несоответствий восприимчивости, возникающих из-за того, что медная катушка находится в непосредственной близости отобразца 17. Резервуар был сделан из пластикового шприца, чтобы приложить катушки и заполнены вздуть. Поскольку перфторированная жидкость должна приложить катушки, доступный диаметр для образца уменьшается до внешнего диаметра 1 мм. Для простоты изменения образца образец был подготовлен в капилляре с внешним диаметром 1 мм и внутренним диаметром 700 мкм. Необходимые инструменты для подготовки образца показаны на рисунке 2A.
Основные экспериментальные параметры MR сильно зависят от используемого оборудования системы, включая градиентную систему, прочность поля и консоль. Несколько параметров могут быть использованы для описания производительности системы, из которых 90 "длина импульса и мощность, B1-однородность и SNR на единицу громкости (SNR/mm3), являются наиболее практически актуальными. SNR/mm3 полезно сравнить производительность различных катушек по одной и той же системе18. Хотя аппаратные различия между системами могут существовать, единообразное применение протокола бенчмаркинга также облегчает сравнение производительности системы.
Этот протокол фокусируется на калибровке и подготовке образцов. Показано пошаговая характеристика производительности соленоидных микрокоул: калибровка длины импульса или мощности на 90 градусов; оценка однородности РФ-поля; и расчет SNR на единицу объема (SNR/mm3). Стандартизированное измерение спин-эхо с помощью фантома описывается для облегчения сравнения конструкций катушки, что позволяет оптимизацию различных приложений. Описаны препараты образца фантома и биологического образца, специфичные для микрокоилов. Протокол может быть реализован на любом подходящем узком (≤60 мм) вертикальном магните, оснащенном коммерчески доступной системой микровизуаляций. Для других систем, он может служить в качестве ориентира и может быть использован с некоторыми корректировками.
Подготовка биологического образца к измерениям МРТ, как правило, не очень обширна, так как образец изображен как можно более нетронутым. Тем не менее, воздушное пространство в биологической ткани может вызвать изображения артефактов из-за различий в магнитнойвосприимчивости 19. Эффект увеличивается с увеличением силы магнитного поля20. Таким образом, воздушных пространств следует избегать при высоких сильных сторонах поля, и это может потребовать погружения образца в жидкость, чтобы избежать воздуха вокруг ткани и удаления воздушных пространств в структурах тканей. В частности, при использовании микрокоилов может потребоваться иссечение желаемой образцовой ткани с последующим погружением ее в подходящую жидкость. За этим следует вставка образца в предварительно вырезанной капилляр, и, наконец, уплотнение капилляров капиллярного воска. Использование воска в качестве герметика вместо клея, запечатывания пламени или альтернатив, означает, что образец может быть легко извлечен. Эта процедура продемонстрирована на корне Medicago truncatula, небольшого бобового растения. Преимуществом этого протокола является возможность последующей совместной регистрации данных МРТ с помощью оптической микроскопии, так как образец не разрушается во время МРТ-измерения.
Представленный протокол подходит для измерений высокого пространственного разрешения на месте, а более сложные проекты могут позволить проводить изображения в образцах vivo, где необходимо будет решать проблемы, связанные с системами жизнеобеспечения.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает процедуры использования и оценки характеристик катушки внутреннего диаметра 1,5 мм (ID) соленоидной катушки(рисунок 1). Катушка, используемая для демонстрации протокола, размещается в резервуаре с восприимчивостью, но протокол в равной степени применим к непревзойденным катушкам. Протокол может быть адаптирован к другим размерам и различным установкам спектрометра.
1. Подготовка эталонного образца
- Чтобы подготовить 100 мл эталонного раствора чувствительности, растворите 156,4 мг CuSO4 и 5 H2O в 80 мл D2O, содержащихся в колбе 100 мл GL45. Сульфат меди уменьшает время релаксации T1 и T2, что позволяет более быстрые измерения, в то время как D2O предотвращает демпфирование излучения и эффекты насыщения. Вручную перемешивайте до полного растворения твердых веществ.
- Отрегулируйте объем до 100 мл с использованием деионизированной воды для окончательной концентрации 1 г/л CuSO4 (ангидроус, 6,3 мМ). Эта концентрация достаточна для сокращения релаксации T1 и T2, но не слишком высока, чтобы быть затронутыми осадками. Печать эталонного образца, чтобы предотвратить изменение соотношения H2O: D2O.
- Дополнительно подключите зонд к сетевому анализатору, чтобы проверить, резонирует ли катушка на желаемой частоте резонанса. Выполните тест на отражение S11 для измерения частотного диапазона, достигнутого путем настройки и измерения фактора, подробно описанного Haase et al.14. Подключите микрокоил к сетевому анализатору с помощью со-осяного кабеля. При необходимости используйте кабель адаптера BNC.
- Установите центральную частоту на сетевом анализаторе до нужной резонансной частоты, в зависимости от предполагаемой силы магнитного поля, для которой предназначена катушка. Далее установите ширину развертки до 10 МГц. Отрегулируйте переменный конденсатор на сборке микрокойла, если таковые имеются, для тонкой настройки отражения падения до нужной частоты.
- Запись уровня отражения на центральной частоте и частоте f1 и f2 на уровне -7 дБ. Используйте их для расчета коэффициента «К» на уровне -7 дБ в соответствии с Haase et al.14
2. Пример подготовки
- При подготовке эталонного образца для калибровки катушки перенесите 1 мл раствора CuSO4 в часовое стеклянное блюдо под стереомикроскоп.
- При подготовке биологического образца перенесите 1 мл перфторекалина (ПФД) в часовое стекло под стереомикроскопом, который будет использоваться для погружения образца. ПФД используется, поскольку он может заполнить воздушные пространства в образце, не входя биологических клеток. Он также не наблюдается протонной МРТ. Немедленно накройте часы стекло крышкой чашки Петри, чтобы предотвратить испарительные потери, прежде чем PFD необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: PFD является весьма нестабильной и мощным долгосрочным парниковым газом21. Когда его растворяющиеся кислородом свойства и его низкая вязкость не требуются, он может быть заменен Фомблином, перфтортером, который также не дает наблюдаемого сигнала 1H, но который не испаряется так быстро17. - Вырезать капилляры подходящего внешнего диаметра по размеру, чтобы поместиться внутри диаметра держателя микрокойла (18 мм) и позволить для перестановки(рисунок 1C). Используйте керамический резак, чтобы сделать разрез каждые 10-12 мм и тщательно сломать на точку разреза.
- При подготовке эталонного образца используйте пинцет и стереомикроскоп, чтобы привнести предварительно вырезанную капиллярную систему в контакт с поверхностью раствора CuSO4 внутри часового стекла, что позволит капиллярному действию заполнить капилляр.
- При подготовке биологического образца используйте пинцет и стереомикроскоп, чтобы привести предварительно вырезанную капиллярную систему в контакт с поверхностью ПФД внутри часового стекла, что позволит капиллярному действию полностью заполнить капилляр. Отпустите капилляр в часовое стекло так, чтобы оно полностью погрузилось в воду.
- Тщательно извлеките пятинедельную всю корневую систему из ее подложку роста, такую как перлитная замена почвы. Очистите корневой образец тщательно rhizosheath. Удалите крупные частицы почвы с помощью пинцета, и если присутствуют мелкие частицы, удалите их, промыв корневую систему дистиллированной водой. Фотография, если это необходимо для будущей ссылки. Выберите и акциз небольшой раздел волокнистого корня, свободного от rhizosheath с помощью скальпеля.
- Для вакуумной обработки поместите образец в трубку 1,5 мл, содержащую подходящий фиксативный раствор. Оставьте крышку трубки, а затем запечатать трубку с парафильмом, чтобы запечатать отверстие трубки. Затем пробить отверстия в пленке с острым инструментом, чтобы обеспечить вентиляцию трубки.
- Поместите образец трубки в вакуумной камере, печать камеры, и подключить лаборатории мембраны вакуумный насос в камеру. Подверги образец вакуумной обработке на срок до 30 минут, чтобы уменьшить присутствие воздушных карманов в биологических образцах. Остановить вакуумную обработку, когда нет пузырьков воздуха видели побег образца.
- При просмотре стереомикроскопа используйте пинцет для погружения образца в среду проникновения, подготовленную ранее. Вымойте образец потенциального мусора.
- Вставьте образец в капилляр с помощью пинцета, в то время как капилляры и образец полностью погружены, чтобы избежать включения пузырьков воздуха. Используйте меньший капилляр или кончик шприц иглы в качестве толкания стержня(рисунок 2B).
- Возьмите образец капилляра из среднего стекла часы, используя пинцет. В случае ПФД накройте крышкой чашки Петри.
- Форма бумаги в тонкую точку и использовать его для удаления около 1 мм жидкости с обоих концов капилляра.
- Растопить небольшой объем капиллярного воска с помощью восковой ручки. Нанесите воск с обеих сторон. Воск станет непрозрачным, когда он затвердеет. Позаботьтесь, чтобы исключить пузырьки воздуха из капилляров(рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перегрева воска или капилляров, поскольку это может привести к взрывной кипения, а также кавитации карманы, когда готовый образец охлаждается. - После этого соскребать избыток воска с внешней стороны капилляра с помощью скальпеля и протрите чистой тонкой бумагой ткани.
3. Монтаж образца
- Поместите микрокоил под стереомикроскоп и вставьте образец с помощью пинцета, сохраняя при этом микрокоил устойчивым(рисунок 2D).
- Используйте стержень, чтобы центр образца в микрокойле, путем скольжения капилляров внутри соленоидной катушки.
- Дополнительно нанесите клейую ленту, чтобы зафиксировать положение капилляра.
- Осмотрите капилляр, чтобы убедиться, что внутри соленоидной катушки не видны пузырьки воздуха, чтобы избежать разрушения MR-сигнала, вызванного различиями в восприимчивости.
- Прикрепите микрокоил к розетке основания зонда, сохраняя при этом микрокоил в вертикальномположении (рисунок 3A.3B).
- Тщательно сдвиньте трехосные градиентные катушки над микрокойлом, сопоставляя разъемы охлаждения воды градиента с градиентом базы зонда(рисунок 3C). Включите винт поток на базе зонда, чтобы исправить градиент на месте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг применяется только для зонда Micro5. В случае других систем, таких как Micro2.5 или Biospect, градиенты находятся на отдельной розетке, чем катушка.
4. Определение характеристик катушки
- Если катушка тестируется впервые, используйте решение эталонного образца для создания однородного образца, который полезен для калибровки мощности и тестоводнородности B1. Потенциальные проблемы с восприимчивостью из-за проводов катушки могут быть легко протестированы с помощью этого эталонного образца.
- Вставьте зонд в магнит и соедините необходимые кабели: кабель передачи/получения РФ, линии охлаждения воды, термоотесный кабель и линию охлаждения воздуха.
- Установите желаемую температуру охлаждения воды (рекомендуется 298 K) для блока охлаждения воды.
- Установите целевую температуру (298 K) и целевой поток газа (300 л/ч). Поток газа может отличаться для другой конструкции катушки или объема образца. Это относится только к системам с системой контроля температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги необходимы только при тестировании новых (домашних) катушек. - Подключите зонд с помощью 50-Ω коаксиального кабеля к сетевому анализатору с достаточно широкой шириной развертки (400 МГц), в центре которого находится предназначенная резонансная частота.
- Соблюдайте резонансные режимы, регулируя переменные соответствующие и настраивая конденсаторы, которые присутствуют в базе зонда.
- Настройте и соеявь резонансный режим на нужную частоту.
- Опционально определите коэффициент качества катушки (К-фактор) на сетевом анализаторе. Один из методов получения фактора качества заключается в использовании сети связи и делении центральной частоты(fc) по ширине отражения падения на -7 дБ (т.е. q fc /(f1 - f2)14. Установите f c к операционной частоте магнита, в то время как f1 и f2 настроены на точку -7 дБ влево и вправо от fc,соответственно. Некоторые сетевые анализаторы имеют встроенный фактор определения.
- Инициировать тест отражения на сканере, обычно называемый кривой колебания, и настроить настройку и соответствие по мере необходимости. Рекомендуется установить любые тюнинговые и соответствующие конденсаторы к середине их диапазона для новых катушек. Поэтому начните с высокой спектральной ширины развертки. В некоторых случаях может быть удобнее настроить и сопоставить катушки за пределами магнита на сетевом анализаторе.
- Выберите файл оболочки для самой большой катушки громкости зонда изображения, если он доступен. Если вы начинаете с катушки, которая использовалась ранее, используйте доступный файл оболочки. Если оба варианта недоступны, начните со всех значений оболочки, установленных на 0.
- Выберите правильную конфигурацию катушки для микрокоиля, если она доступна в программном обеспечении для визуализации (т.е. ParaVision). В противном случае создайте новую конфигурацию катушки, соответствующая спецификациям катушки (например, однонастроенная или двухнастроенная) в соответствии с руководством системы. Оценки безопасных пределов для этого соленоидного микрокоила, используемого в этом исследовании с 1,5 мм внутреннего диаметра в размере 1 мс при пиковой мощности 1 Вт и 1 мВт непрерывной мощности.
ВНИМАНИЕ: Небольшие конденсаторы (обычно размером 1 мм), необходимые для микрокоилов, очень чувствительны и легко повреждаются высоким напряжением. Автоматизированное определение мощности импульса может не функционировать с нестандартными катушками, и слишком высокая мощность может привести к повреждению катушки или других частей спектрометра. Поэтому рекомендуется вручную корректировать. - Запись кривой гайки для новой катушки, чтобы получить указание правильной RF-мощности для катушки (Рисунок 4). В случае, если безопасные пределы для катушки неизвестны, начните с 10 мк при низкой импульсной мощности 0,6 Вт и медленно увеличьте длину импульса на 1 мк в то время, пока сигнал появляется.
- Используя FID-эксперимент при отсутствии градиентного кодирования, систематически меняйте длину RF-пульса, сохраняя при этом постоянную мощность импульса. Идеальной длиной импульса является длина импульса, где интенсивность сигнала достигает максимума. При тестировании новой катушки, использовать 10 импульс с очень низкой мощностью первой и начать увеличивать мощность импульса постепенно.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если мощность намного выше, чем ожидалось для сочетания характеристик катушки и спектрометра, это уже свидетельствует о том, что неправильный резонансный режим был выбран. - Для катушки с однородным полем B1,как селеноидная катушка, определить 180 "пульс, где интенсивность сигнала уменьшается донуля 22.
- Используя FID-эксперимент при отсутствии градиентного кодирования, систематически меняйте длину RF-пульса, сохраняя при этом постоянную мощность импульса. Идеальной длиной импульса является длина импульса, где интенсивность сигнала достигает максимума. При тестировании новой катушки, использовать 10 импульс с очень низкой мощностью первой и начать увеличивать мощность импульса постепенно.
- Установите определяемую мощность импульса на 90 градусов в карту регулировки созданного исследования. В ParaVision, карта регулировки мощности может быть использована для введения жесткого импульса власти.
- Используйте сканирование локализатора с 3 ломтиками, по одному ломтику в каждом из трех основных осей, чтобы найти положение катушки в магните. Для этого загрузите сканирование локализатора из библиотеки спектрометра по умолчанию. Рекомендуется начинать с большого поля зрения без смещения. Выполните автоматическую регулировку усиления приемника и вручную запустите измерение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец находится именно в центре градиентной системы, сканирование локализатора покажет образец. Если катушка или образец не сосредоточены в срезах изображения или отсутствуют, сканирование локализатора необходимо отрегулировать, и в этом случае шаг 4.12 должен быть выполнен снова. - Кроме того, используйте дополнительный способ найти правильный импульс 90 "на основе оценки изображения. После того, как приблизительная мощность импульса найдена с помощью кривой гайки, постепенно отрегулируйте импульсные силы, чтобы проверить изображение на однородность B1-поля. Для некоторых катушек с неоднородным полем B1 импульсная мощность 90 градусов, определяемая с помощью кривой гайки, может быть переоценена, что приводит к опрокидыванию в нужном сладком месте катушки. В этом случае уменьшите мощность эталонного импульса и проверьте новые изображения по отношению к предыдущим изображениям(рисунок 5).
- Вручную оболочка магнитного поля на основе сигнала FID. Рекомендуемый заказ для первоначального shimming являетсяNo 2--Я-X-Y-З-З-2 --XY-X-Я-З. В случае соленоида основная ось симметрии находится в XY-плоскости. Таким образом, оболочки в разных направлениях могут привести к более сильной коррекции однородности B0 для этой конфигурации катушки. Оболочки высшего порядка имеют мало эффекта и могут быть проигнорированы.
- Рассчитайте нормализованный объем SNR, чтобы можно было сравнить характеристики микрокойла по различным системам, адаптированные из протоколапроизводителя 18. Для используемых здесь микрокоиров мы использовали последовательность спин-эхо со следующими параметрами: поле зрения (FOV) 6 мм х 6 мм, время повторения (TR) 1000 мс, эхо времени (TE) 7 мс, Матрица 256 х 256 и толщина ломтика 0,5 мм. Отрегулируйте толщину ломтика до тех пор, пока выигрыш приемника не будет унитарным. Затем отрегулируйте количество ломтиков так, чтобы ломтики вышли за пределы области однородностиB1-поля. Запись изображений без усреднения сигнала, если это возможно.
- Определите объем нормализованного SNR (SNR/mm3)в два этапа. Во-первых, рассчитать объем voxel(Vvoxel)(Eq. 1):
(1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Единицы для Dх, D уи D ломтикв мм. Этот расчет также может быть выполнен для серии срезов. - Выберите области, представляющие интерес дляопределения интенсивности сигнала (μрентабельности)выборки иинтенсивности сигнала (μшум)истандартного отклонения (σшума)для региона за пределами выборки (т.е. шума). Средний сигнал взят из центра изображения, в то время как шумовой сигнал рассчитывается из угловых патчей(рисунок 6). Для этих вычислений может использоваться либо программное обеспечение для управления спектрометром, либо программное обеспечение для обработки изображений общего назначения. Используйте одно повторение, если это возможно, чтобы сохранить сопоставимость между различными катушками.
- Используйте значения для расчета нормализованного объема SNR (Eq. 2):
(2)
Для катушки, используемой здесь в сочетании со эталоном решения, использование Eq. 2 приводит к следующему решению:
(3)
ПРИМЕЧАНИЕ: При сравнении SNR катушек на различных сильных магнитного поля, релаксационные свойства фантома должны бытьизмерены 23, если очень долгое время повторения и очень короткое время эхо используются.
- Определите объем нормализованного SNR (SNR/mm3)в два этапа. Во-первых, рассчитать объем voxel(Vvoxel)(Eq. 1):
- Проверьте наличие проблем с восприимчивостью из-за неоднородности магнитного поля: загрузите и запустите несколько последовательностей градиент-эхо (MGE)(рисунок 7). Неоднородности магнитного поля из-за различий в восприимчивости видны на изображениях с более длительным временем эха, так как градиентное эхо не переориентируется на спины, которые дефазировать из-за статических неоднородности поля. Таким образом, неоднородности в образце могут быть визуализированы (из-за воздушных пространств в образце), а также B0 полевых неоднородностей, введенных материалом катушки. Используйте следующие параметры, которые будут скорректированы в зависимости от спецификаций используемого спектрометра и катушки: TR 200 мс, TE 3,5 мс с 48 эхом, размещанные на 3,5 мс друг от друга, флип-угол 30 градусов. Размер матрицы 128 x 128.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если в резонансной (шаткой) кривой наблюдались несколько (потенциальных) резонансных режимов или отражений, повторите вышеуказанные шаги для каждого резонансного режима, чтобы определить наиболее чувствительный. В зависимости от микрокоиля, различные части сборки микрокойла могут быть подвержены непреднамеренным резонансным режимам.
(1)
(2)
(3)5. Изображение высокого разрешения
- Запустите эксперимент 3D-FLASH со следующими параметрами: TR 70 мс, TE 2,5 мс, размер матрицы 128 х 64 х 64, FOV 1,6 х 0,8 х 0,8 мм, флип угол 30 ", и пропускная способность приемника 50 кГц.
- Получить импульсные силы от силы эталонного импульса, определяемой ранее; это автоматически в большинстве изображений программного обеспечения. Определите выигрыш приемника с помощью автоматических корректировок. При необходимости отрегулируйте FOV, охватывающий весь объект в обоих направлениях фазового кодирования, чтобы избежать псевдонима. Вы запустите моделирование цикла градиентного цикла, если таковые имеются в системе, чтобы убедиться, что цикл службы эксперимента остается в пределах спецификаций градиентных катушек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры специфичны для катушки, используемой для демонстрации; важно оптимизировать с местной спецификой системы.
6. Восстановление образцов для дальнейшего изучения или хранения
- Удалите образец капилляра из микрокоиля.
- Используя пинцет, удалите восковые пробки под стереомикроскопом.
- Используйте шприц, чтобы вымыть образец из капилляра с решением выбора. Кроме того, используйте стеклянный стержень толкатель для извлечения образца.
- Для предотвращения обезвоживания образца храните в подходящей среде для хранения.
Representative Results
Характеристика катушки
После успешной настройки и сопоставления катушки, его производительность может быть охарактеризована катушки -фактор, 90 "справочный импульс, и SNR / мм3. Для 1,5 мм ID восприимчивости соответствует соленоидной катушки продемонстрировали здесь, измеряется q-фактор (выгруженный) было 244, по сравнению с 561 для 5 мм катушки птичьей клетки.
Эталонный импульс 90 градусов был 12 с уровнем мощности 0,6 Вт; cf. 5 мк при 45 Вт для катушки птичьей клетки диаметром 5 мм(рисунок 4 и рисунок 5). Это приравнивается к прочности поля импульсаРФ (B1), 
используя 0,53 мТ для микрокоиля и 1,17 мТ для катушкиптичьей клетки 14, где y является гиромагнитным соотношением, в то время как тау является продолжительностью импульса. Так как уровни импульсноймощности (P) отличаются, катушки можно сравнить с 
точки зрения эффективности передачи: 0,69мТ/Вт 1/2 и 0,18мТ/Вт 1/2 для микрокоила и птичьейклетки соответственно 14. По сравнению с пульсом на 90 градусов, микрокоил является фактором, ≈ в 4 раза более чувствительным, чем катушка птичьей клетки.
Эффект соответствия восприимчивости
При сверхвысоких сильных сторонах поля восприимчивость образца и катушки становится доминирующим фактором качества изображения, как видно на рисунке 7A,7B. По сравнению с катушкой, не имеющим восприимчивости, соответствующей резервуару жидкости, сигнал сохраняется дольше и однороднее в эталонной выборке. Однако из-за восприимчивости резервуара максимальные размеры выборки уменьшаются по отношению к катушке без резервуара.
Изображение с высоким разрешением
Высокое разрешение 13 х 13 х 13мкм 3 образца корня Medicago truncatula было достигнуто за 20 часов и 23 минуты(рисунок 8). Начиная с поверхности корня, корневой коры видно, наряду с некоторыми остаточной воды на внешней стороне корня. Кроме того, ксилем наблюдается как темная полоса, ограждающая хлом. Некоторые воздушные карманы наблюдаются как темные пятна с полной потерей сигнала.
Симбиотические корневые узелки M. truncatula также могут быть изображены с помощью этого протокола(рисунок 9). Используя немного большую непревзойденную катушку (длина около 3500 мкм, внутренний диаметр 1500 мкм), изображения с разрешением до 16 х 16 х 16мкм 3 были получены за 33 минуты.
Рисунок 1: Соленоидный микрокоил. (A)Конструкция соленоидной катушки состоит из проволоки, зацикленные helically, как правило, обернутые вокруг капилляра. Геометрия провода, такая как его толщина, диаметр, количество обмоток и интервал проводов, влияют на характеристики катушки. (B)Самодельный соленоидный микрокоил с резервуаром для восприимчивости, соответствующий жидкости (Фомблин). Он состоит из 0,4 мм толщиной покрытием медной проволоки раны шесть раз вокруг капилляров с внешним диаметром 1500 мкм и катушки длиной 3500 мкм. Катушка погружена в резервуар, который сделан из шприца. Образцы капилляров до внешнего диаметра 1000 мкм могут быть вставлены. Используются два конденсатора: конденсатор 1,5 pF в серии с индуктором и второй переменный конденсатор 1,5-6 pF помещается параллельно индуктору. Все компоненты припой на стекловолокно борту (желтый). Он устанавливается на коммерческом держателе (серый полимер), который модифицируется для поддержки водохранилища. (C)Компоненты конструкции solenoid катушки: 1. solenoid катушка, 2. капилляр образца, 3. 1.5 pF настраивая конденсатор, 4. переменный сопрягая конденсатор, 5. плита основания стекловолокна, 6. медные провода водит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Пример подготовки под стереомикроскопом. (A)Элементы, необходимые для подготовки микрокоилов. Слева направо: 1. CuSO4 справочное решение, 2. Перфторекалин, 3. микрокоил, 4. Скальпель, 5. пинцет положительного напряжения, 6. пинцет, 7. капилляры внешнего диаметра 1000 мкм, 8. восковая ручка, 9. капиллярный воск, 10. нитриле перчатки, 11. стереомикроскоп, 12. смотреть стекло с крышкой чашки Петри, 13. растительный материал в субстрате роста. Не показано: 2 мл шприца с иглой 0,8 х 40 мм и тонкой бумагой. (B)Крупным планом вставки образца в капилляр с помощью пинцета, в то время как оба хранятся под водой. (C)Уплотнение капилляров с использованием расплавленного воска. (D)Вставка подготовленного капилляра в микрокоил. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Компонент микро-изображения зонда. (A) Micro5 зонд базы, содержащие все необходимые соединения для охлаждения воды, отопления, датчики температуры, градиентной мощности, РФ (коаксиальный разъем видны) и дополнительно идентификации зонда (PICS). Под базой зонда находятся ручки, которые позволяют регулировать переменную настройку и соответствующие конденсаторы, а также удерживать винты для удержания зонда на месте внутри спектрометра. (B)Доморощенный микрокоил, монтируется на вершине зонда-базы. Обратите внимание на переменные конденсаторы (белая керамика), установленные на базе зонда, которые позволяют настраивать и сопоставлять. (C) Интегрированный 3-аксиальный градиент, установленный на базе зонда с сосудами для охлаждения воды и позолоченными контактами для заземления градиента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Кривая ореха. Кривая гайки приобретается для определения мощности эталонного импульса. Сила эталонного импульса (импульс 90 градусов) определяется как сочетание мощности и длины импульса, необходимых для генерации поля B1, которое переворачивает всю доступную намагничение в направлении z к поперечной плоскости. Серия импульсов регистрируется при отсутствии градиентного кодирования. С каждым импульсом, либо длина пульса или импульсной мощности приращена. Здесь мощность импульса установлена до 0,6 Вт, в то время как длина импульса приращена на 1 к каждому времени. Максимальная интенсивность сигнала указывает на пульс 90 градусов, около 12. Импульс 180 градусов также может быть определен таким образом, используя минимальную интенсивность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Визуальное определение импульсной мощности на 90 градусов. После того, как приблизительная сила эталонного импульса была найдена с помощью кривой гайки, она может быть проверена визуально, изменяя длину импульса. В зависимости от катушки поле B1 может быть более или менее чувствительным к изменениям. (A)длина импульса 11. (B) длина импульса 12, оптимальная для этой катушки. (C) длина импульса 13. (D)длина импульса 20. Если мощность импульса установлена слишком высоко, может произойти чрезмерное опрокидывание, тем самым снижая интенсивность изображения в центре катушки (наконечник стрелы). Увеличенное поле B1 также увеличивает диапазон катушки, как это можно наблюдать в ширине изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Регион размещения интересов. Регионы интереса (ROI) для расчета нормализованного SNR можно увидеть. Средняя интенсивность выборки взята из рентабельности инвестиций, которая попадает в выборку эталонного решения. Средний шум и стандартное отклонение рассчитываются из одной или нескольких рентабельности инвестиций, расположенных в углах изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: однородность РФ, оцениваемая с помощью градиентной эхо-изображения. Для оценки однородности RF (B1-Field) используется многофиентное эхо(MGE)с использованием ряда градиентных эхов. Основными параметрами были: время повторения 200 мс, эхо времени 3,5 мс с числом эхо 48, эхо интервал 3,5 мс, 64 средних, время приобретения 27 м 18 с, флип угол 30 ". Поле зрения было 5 х 5 мм, матрица 128 х 128, разрешение 39 х 39 х 200 мкм.() Восприимчивость соответствует катушки. Восприимчивость соответствия жидкости (Фомблин), окружающих катушки РФ снижает восприимчивость эффекты из-за катушки провода. Небольшие пузырьки воздуха приводят к потере сигнала по мере увеличения времени эха. (B) катушка (не восприимчивость соответствует) с равным диаметром катушки. В более длительное время эха наблюдаются увеличиваемые артефакты, вызванные неоднородностью поля B0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: 3D-изображение корневой секции Medicago truncatula. (Вверху)FLASH изображение. Можно выделить несколько особенностей корневой секции, включая эпидермис (e), кору (c), фром (ph) и ксилем (xy). Воздушные карманы (a) в первопричине полной потери сигнала. Основные параметры были следующими: время повторения 70 мс, время эха 2,5 мс, 256 средних, время приобретения 20 ч 23 м. Разрешение 13 x 13 x 13 мкм3. Размер матрицы составил 128 x 64 x 64, а поле зрения 1,6 x 0,8 x 0,8 мм. Пропускная способность приемника 50 кГц. (Внизу) MSME изображение. Основные параметры были следующими: время повторения 500 мс, эхо времени 5,2 мс, 28 средних, время приобретения 15 ч 55 м. Разрешение 13 x 13 x 13 мкм3. Размер матрицы составил 128 x 64 x 64, а поле зрения 1,6 x 0,8 x 0,8 мм. Пропускная способность приемника 70 кГц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: 3D-изображение корневой узелки Medicago truncatula. (Вверху)Изображение с низким разрешением. Основные параметры были следующими: время повторения 60 мс, эхо-время 2,3 мс, 4 средних, время приобретения 4 м. Разрешение 31 x 31 x 31 мкм3. Размер матрицы был 64 x 32 x 32 и поле зрения 2 x 1 x 1 мм. Пропускная способность приемника 50 кГц. (Внизу) Изображение высокого разрешения. Основные параметры были следующими: время повторения 60 мс, эхо-время 2,3 мс, 8 средних, время приобретения 33 м. Разрешение 16 x 16 x 16мкм 3. Размер матрицы составил 128 x 64 x 64, а поле зрения 2 x 1 x 1 мм. Пропускная способность приемника 50 кГц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Этот протокол лучше всего подходит для биологических образцов, так как многие материалы и геологические образцы имеют значительно короче T2 времени релаксации, которые не могут быть изображены последовательности, используемые здесь. Даже некоторые биологические ткани, которые демонстрируют высокую восприимчивость образца магнитной восприимчивости, может быть трудно изображения на сверхвысоком поле, как эффекты коррелируют ссилой поля 24. Протокол не только полезен для новых катушек, но и может помочь в устранении неполадок и диагностике потенциальных проблем. При тестировании новых или неизвестных образцов этот протокол может быть выполнен заранее на справочном решении, чтобы убедиться, что экспериментальная установка функционирует в соответствии со спецификациями. Это помогает в устранении неполадок, так как спектрометр может быть исключен в качестве источника артефактов и неисправностей. Кроме того, это устанавливает настройки и сопоставления конденсаторов на зонде значения, типичные для микрокойла.
При записи сигнала при первом эксперименте поле зрения сканирования локализатора может быть увеличено, чтобы проверить, виден ли образец. Затем перепроверьте, правильно ли настроена катушка, и попытайтесь просмотреть другой локафикатор. Не исключено, что катушка обладает дополнительными непреднамеренными резонансными режимами, и в этом случае необходимо определить правильный режим. Если изображение все еще не может быть получено, удалите образец, чтобы проверить его положение в сборке микрокойла и убедитесь, что образец не поврежден (т.е. никаких пузырьков воздуха или утечек в уплотнениях нет). Наконец, образец может быть подготовлен с водой вместо PFD. В случае, если образец дает мало обнаруживаемого сигнала в локаляизатор сканирования, окружающая вода в капилляре все еще может быть обнаружена.
Поскольку микрокоила идеально подходят очень близко к образцу, различия в магнитной восприимчивости между воздухом и проводом могут привести к дополнительной потере сигнала, как видно на рисунке 7B. Потенциальные артефакты включают пространственное неправильное смекалка и аномальное изменение интенсивности сигнала. Особенно градиент-эхо типа импульсных последовательностей страдают от этой не однородной потери сигнала. По этой причине мы представили катушки с восприимчивостью, погрузив проволоку в фторнертную жидкость (Фомблин или ФК-43). Метод оценки B1, включенный в этот протокол, может помочь определить, требуютли различия в восприимчивости B1 включения стратегий сопоставления восприимчивости в конструкцию сборки катушки. Альтернативный подход для построения восприимчивости соответствует катушки заключается в использовании восприимчивости соответствует провода25. Кроме того, только вопросы восприимчивости из-за катушки рассматриваются с этим подходом. Несоответствия восприимчивости внутри образца (например, из-за воздушного пространства) остаются сложными.
Воздушные карманы или пузырьки представляют собой экспериментальную проблему, которая вызывает обширную потерю сигнала, вызванную различиями в восприимчивости к интерфейсу воздуха ижидкости или образца 19 (рисунок 5A). Важнейшим аспектом успешной подготовки образца является погружение как образца, так и капилляра. Тем не менее, даже небольшие пузырьки могут вызвать потери сигнала, особенно для последовательностей типа градиентного эхо. Мобильные пузырьки воздуха могут мигрировать через капилляр, пока они не находятся в контакте с образцом. Некоторые из этих эффектов могут быть смягчены путем слегка наклона капилляров, так что один конец выше, чем другой. Наклон обеспечивает потенциальные пузырьки воздуха, удерживаемые на месте на более высоком конце, не нарушая образец. Важно также, чтобы проверить, что капиллярный воск образует хорошее уплотнение, как обезвоживание может привести к большим пузырькам воздуха в форме.
Для воздушных пространств внутри образца, PFD был использован для заполнения межклеточных воздушных пространств, не проникая в клеточные мембраны26. Однако, даже при этом подходе, мы не смогли удалить все воздушные пространства. Кроме того, этот подход означает, что нам нужен дополнительный агент, который, как правило, не предпочтительнее из-за желания изучать систему как можно более неинвазивно.
Цилиндрическая форма капилляров означает, что установки перфузии должны быть жизнеспособными, особенно для тканей, уязвимых к распаду, таких как биопсия или изучение процессов в живом корневом материале. Два шага могут реализовать установку перфузии. Во-первых, подключение средней трубки корма, а также дренажной трубки по обе стороны капилляра было бы достаточно, чтобы создать хемостат. Во-вторых, добавление отступа в капилляре образца может удерживать образец на месте против направления потока. Это аналогично протоколу, опубликованному для планарных микрокоиров10.
Неинвазивный характер МРТ-изображений в сочетании с инертной жидкостью, используемой в этом протоколе (PFD или Fomblin), означает, что после завершения экспериментов образцы могут быть удалены из их капилляров для дальнейшего изучения. Комбинации включают оптическую или электронную микроскопию и другие методы разрушительной визуализации. Недавно мы продемонстрировали сочетание с оптической микроскопией на корневых узелках Medicago truncatula 27.
Мы продемонстрировали метод визуализации растительного материала с помощью выделенных микрокоилов на сверхвысоком полевом спектрометре ЯМР. Относительно большие объемы выборки могут быть изучены с высоким разрешением с хорошей однородностью РФ. Кроме того, спектроскопическая визуализация может быть выполнена с более высоким разрешением, чем это возможно в противном случае. Адаптация микрокоиловой конструкции к образцам облегчается эффективным методом определения характеристик производительности катушки. Подход к соленоидной катушке также может быть легко применен к другим образцам, чем растения, включая ткани животных.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эксперименты на приборе 950 МГц были поддержаны UNMR-NL, финансируемым НВО Национальным дорожным фондом Нидерландов (проект 184.032.207). R.S. был поддержан консорциумом BioSolarCells проектом U2.3. J.R.K. была поддержана Нидерландской научно-исследовательской школой магнитного резонанса (NMARRS) (022.005.029). Мы благодарим Дефэн Шен и Тон Бисселин за предоставление образцов Medicago truncatula. Мы также благодарим Клаарте Хубена, Мари Рено и Иоганна ван дер Цвана за техническую поддержку на объекте uNMR-NL. Мы также хотели бы поблагодарить Фолькера Леманна, Хенни Янссена и Питера де Ваарда за техническую помощь. Мы выражаем благодарность Фрэнку Вергельдту, Джону Филиппи и Картику Б. Сай Санкару Гупте за их советы. Наконец, мы благодарим Джессику де Рейтер за предоставление закадровый голос на видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reference solution preparation | |||
| CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
| D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
| Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
| Sample preparation | |||
| Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
| Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
| Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
| Syringe | Generic | - | Used to apply PFD and manipulate the sample |
| Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
| Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
| Imaging Hardware | |||
| 22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
| Air cooler | Bruker GmbH | - | Used to regulate probe temperature |
| Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
| Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
| Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
| RF microcoil | Home-built | - | contains Fomblin |
| Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
| Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |
References
- Ciobanu, L., Pennington, C. H. 3D micron-scale MRI of single biological cells. Solid State Nuclear Magnetic Resonance. 25 (1-3), 138-141 (2004).
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Radecki, G., Nargeot, R., Jelescu, I. O., Le Bihan, D., Ciobanu, L. Functional magnetic resonance microscopy at single-cell resolution in Aplysia californica. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8667-8672 (2014).
- Lee, C. H., et al. Magnetic Resonance Microscopy (MRM) of Single Mammalian Myofibers and Myonuclei. Scientific Reports. 7 (1), 39496 (2017).
- Callaghan, P. T. Principles of nuclear magnetic resonance microscopy. , Oxford University Press. Oxford. (1994).
- Glover, P., Mansfield, S. P. Limits to magnetic resonance microscopy. Reports on Progress in Physics. 65 (10), 1489-1511 (2002).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and analysis of microcoils for NMR microscopy. Journal of Magnetic Resonance. Series B. 108, 114-124 (1995).
- Lee, C. H., Flint, J. J., Hansen, B., Blackband, S. J. Investigation of the subcellular architecture of L7 neurons of Aplysia californica using magnetic resonance microscopy (MRM) at 7.8 microns. Scientific Reports. 5, 11147 (2015).
- Fratila, R. M., Velders, A. H. Small-Volume Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Annual Review of Analytical Chemistry. 4 (1), 227-249 (2011).
- Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition. Journal of Visualized Experiments. (128), 1-10 (2017).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design. Part I: Optimizing RF homogeneity and coil dimensions. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (2), 128-142 (2001).
- Vegh, V., Gläser, P., Maillet, D., Cowin, G. J., Reutens, D. C. High-field magnetic resonance imaging using solenoid radiofrequency coils. Magnetic Resonance Imaging. 30 (8), 1177-1185 (2012).
- Minard, K. R., Wind, R. A. Solenoidal microcoil design Part II: Optimizing winding parameters for maximum signal-to-noise performance. Concepts in Magnetic Resonance. 13 (3), 190-210 (2001).
- Haase, A., et al. NMR probeheads for in vivo applications. Concepts in Magnetic Resonance. 12, 361-388 (2000).
- Webb, A. G. Radiofrequency microcoils for magnetic resonance imaging and spectroscopy. Journal of Magnetic Resonance. 229, 55-66 (2013).
- Peck, T. L., Magin, R. L., Lauterbur, P. C. Design and Analysis of Microcoils for NMR Microscopy. Journal of Magnetic Resonance, Series B. 108 (2), 114-124 (1995).
- Olson, D. L., Peck, T. L., Webb, A. G., Magin, R. L., Sweedler, J. V High-Resolution Microcoil 1H-NMR for Mass-Limited, Nanoliter-Volume Samples. Science. 270 (5244), (1995).
- Oerther, T. Micro Imaging Manual for AV3 Systems. , Bruker Biospin GmbH. Rheinstetten, Germany. (2012).
- Callaghan, P. T. Susceptibility and Diffusion Effects in NMR Microscopy. Encyclopedia of Magnetic Resonance. , (2007).
- Donker, H. C. W., Van As, H., Snijder, H. J., Edzes, H. T. Quantitative 1H-NMR imaging of water in white button mushrooms (Agaricus bisporus). Magnetic Resonance Imaging. 15 (1), 113-121 (1997).
- Tsai, W. T. Environmental property modelling of perfluorodecalin and its implications for environmental fate and hazards. Aerosol and Air Quality Research. 11 (7), 903-907 (2011).
- Keifer, P. A. 90° pulse width calibrations: How to read a pulse width array. Concepts in Magnetic Resonance. 11 (3), 165-180 (1999).
- Vlaardingerbroek, M. T., den Boer, J. A. Magnetic Resonance Imaging: Theory and Practice. , Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg. 05252-05255 (2003).
- Schenck, J. F. The role of magnetic susceptibility in magnetic resonance imaging: MRI magnetic compatibility of the first and second kinds. Medical Physics. 23 (6), 815-850 (1996).
- Kc, R., Henry, I. D., Park, G. H. J., Aghdasi, A., Raftery, D. New solenoidal microcoil NMR probe using zero-susceptibility wire. Concepts in Magnetic Resonance Part B: Magnetic Resonance Engineering. 37 (1), 13-19 (2010).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).
- van Schadewijk, R., et al. Magnetic Resonance Microscopy at Cellular Resolution and Localised Spectroscopy of Medicago truncatula at 22.3 Tesla. Scientific Reports. 10 (1), 971 (2020).
