Summary
Protokollen beskriver en hurtig, høj-gennemløb, pålidelig, billig, og upartisk analyse for effektivt at bestemme cellulære levedygtighed. Denne analyse er især nyttig, når cellernes mitokondrier er blevet beskadiget, hvilket forstyrrer andre analyser. Analysen bruger automatiseret optælling af celler farves med to nukleare farvestoffer – Hoechst 33342 og propidium iodid.
Abstract
Mitokondriens bidrag til onkogene omdannelse er genstand for stor interesse og aktiv undersøgelse. Som inden for kræft metabolisme bliver mere kompleks, målet om at målrette mitokondrier ved hjælp af forskellige forbindelser, der påfører mitokondriel skade (såkaldte mitocans) er ved at blive meget populære. Desværre, mange eksisterende cytotoksicitet assays, såsom dem baseret på tetrazolium salte eller resazurin kræver funktionelle mitokondrielle enzymer for deres ydeevne. Den skade, der påføres af forbindelser, der er målrettet mitokondrier ofte kompromitterer nøjagtigheden af disse analyser. Her beskriver vi en modificeret protokol baseret på differentialfarvning med to fluorescerende farvestoffer, hvoraf den ene er celle-permeant (Hoechst 33342) og den anden er ikke (propidium iodid). Forskellen i farvning gør det muligt at diskriminere levende og døde celler. Analysen er modtagelig for automatiseret mikroskopi og billedanalyse, hvilket øger gennemløb og reducerer bias. Dette gør det også muligt analysen, der skal anvendes i høj-throughput mode ved hjælp af 96-brønd plader, hvilket gør det til en farbar vej for drug opdagelse indsats, især når de pågældende lægemidler har en vis grad af mitotoksicitet. Det er vigtigt, at resultater opnået ved Hoechst/PI-farvningsanalyse viser øget konsistens, både med trypanblå eksklusionsresultater og mellem biologiske replikater, når analysen sammenlignes med andre metoder.
Introduction
Det første skridt til at identificere effektive kræftbehandlinger er udvælgelsen af en robust, upartisk cytotoksicitet assay, der kan bruges til at undersøge effekten af behandlingen. Et fælles valg for lav-throughput eksperimenter er udelukkelsen af trypan blå farvestof fra levende celler. Denne metode er begunstiget, fordi det giver en relativt upartisk metode til kvantificering celle overlevelse. trypan blå passivt diffunderer i celler, hvis membraner er kompromitteret, men det er effektivt blokeret fra at komme ind i raske celler1. Kvotienten af de levende celler og de samlede celler repræsenterer den procentvise levedygtighed, hvilket indikerer effekten af behandlingen. Den væsentligste ulempe ved trypan blå analyse er, at det er dårligt egnet til høj-throughput metoder. Det har et relativt lavt signal-støj-forhold og langvarig farvning kan resultere i artefakter på grund af farvning af levedygtige celler. Derfor er trypan blå udelukkelse typisk, men ikke altid2, henvist til manuel optælling. Dette gør det for langsomt og introducerer den stærke mulighed for partiskhed på grund af subjektive dom af forskeren (medmindre blændende eller uafhængige tæller anvendes, hvilket yderligere reducere laboratorie gennemløb). Generelt, gennemløb af denne analyse er utilstrækkelig til moderne stof opdagelse.
Rentabilitetsanalyser, som generelt har en langt højere gennemløb, giver forskerne mulighed for at omgå denne begrænsning, men kommer med betydelige forbehold (se tabel 1). Disse metoder falder generelt i to grupper. En gruppe består af kolojære analyser, der er baseret på funktionen af cellulære redox enzymer. Farveløse eller ikke-fluorescerende substrater omdannes til levende produkter, der kan kvantificeres ved hjælp af et spektrofotometer. Klassiske eksempler omfatter tetrazolium salte (MTT, WST-1, XTT, osv.) og resazurin. Denne kategori omfatter også selvlysende analyser, der udnytter luciferin at evaluere ATP niveau. Analyser af denne type har den underliggende begrænsning, at de måler cellulære stofskifte, som ikke er cellulære levedygtighed i sig selv. Det er ret almindeligt, at celler bliver quiescent under ugunstige forhold, men stadig bevare evnen til atopdele 3,4,5. For eksempel, kræft stamceller er ofte relativt metabolisk quiescent6,7,8,9, og vil sandsynligvis være vanskeligt at analysere ved hjælp af disse teknikker. Effektiviteten af behandlinger, der skader mitokondriel funktion, såsom de fleste mitocans, er også sandsynligt, at være betydeligt overvurderet.
En alternativ metode udnytter de kemiske egenskaber af forskellige stoffer, der giver dem mulighed for enten at krydse eller ikke krydse biologiske membraner. Et eksempel er nukleare pletter såsom SYTOX eller propidium iodid (PI). Denne kategori omfatter også analyser, der ligner hinanden i konceptet, men forskellige i funktion, såsom laktatdehydrogenase (LDH)-analysen, som måler frigivelsen af LDH i det ekstracellulære miljø som indikator for cellulær nekrose (Figur 1, Tabel 1). Disse analyser er mere i stand til at skelne mellem metabolisk inaktive og døde celler.
| Analyse/farvestof | Type(er) af celledød opdaget | Nødvendigt udstyr | Vigtige funktioner |
| MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurin) | Apoptose/Nekrose | Spektrofotometer | Billig, hurtig; endepunktsanalyse afhænger af enzymers aktivitet (udelukkende mitokondriel i tilfælde af MTT) og diskriminerer ikke mellem celledødstyper1,10 |
| LDH-udgivelse | Nekrose | Spektrofotometer | Hurtig, uafhængig af mitokondrielle enzymers aktivitet; dyrt for test med høj gennemløb; detekektære celler med compromiseretplasmamembran 11,12 |
| Trypan Blå (TB) | Apoptose/Nekrose | Mikroskop | Celle-impermeant; ikke diskriminerer mellem celledødsformer arbejdsformig og ikke egnet til screening med høj gennemløb vanskeligere at bruge med klæbende celler; tilbøjelige til subjektiv dømmekraft fra brugerens måde, men betragtes som standardmetode til måling af cellernes levedygtighed13 |
| Acridine orange (AO) | Apoptose/Nekrose/ | Fluorescensmikroskop | Et nukleinsyrefarvestof med unikke spektrale egenskaber kan skelne mellem apoptose og nekrose/nekroptose14 |
| Nekrokose | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptose | Fluorescensmikroskop eller flowcytometer | Cellepermeerbar; upassende i sig selv til at overvåge celledød; nyttige til co-farvning; kan anvendes til at vurdere kromatinkondensation og kernefragmentering i tidlig apoptose; kan parres med propidiumidodid for at skelne apoptose fra nekrose15,16 |
| Propidiumidodid (PI) | Sen apoptose/Nekrose | Fluorescensmikroskop eller flowcytometer | Celle-impermeant intercalator; registrerer både sen apoptose og nekrosetilstande for celledød17. Giftig og gennemtrængelig efter lange inkubationstider18 |
Tabel 1. Liste over cytotoksicitetsanalyser. Cytotoksicitetsanalyser, hvoraf nogle blev brugt i denne undersøgelse, opført sammen med den korte beskrivelse af deres vigtigste funktioner.
Nylige undersøgelser har vist, at mitokondriel metabolisme er ændret i nogle kræftformer19,20,21,22,23,24,25. For eksempel har akut myeloid leukæmi (AML) vist sig at upregulate deres mitokondrielle masse, mtDNA indhold, og mitokondrielle åndedræt for at opfylde deres energibehov19,26,27. På den anden side, nogle solide tumorer er karakteriseret ved mitokondriel dysfunktion, eller rettere "metabolisk omprogrammering", såsom downregulation af mitokondrielle proteiner involveret i OXPHOS eller nedsat mtDNA indhold, der har været forbundet med tumor invasiv, metastatisk potentiale og resistens over for apoptose-inducerende lægemidler28,29. Desuden, for nylig, der har været en øget interesse i at bruge mekanistisk forskellige forbindelser, der påvirker mitokondrielle funktion (generelt kaldet mitocans30), som potentielle behandlinger for særlige kræftformer. Disse lægemidler er rettet mod ATP syntese, mitokondrielle DNA, OXPHOS, og ROS produktion, samt pro-apoptotiske og anti-apoptotiske proteiner forbundet med mitokondrier30,31. Flere undersøgelser har vist , at denne fremgangsmåde har et betydeligt løfte19,32,33,34. Men, disse metaboliske afvigelser i kræft cellebiologi eller mitokondrier-målretning behandlinger kan i væsentlig grad påvirke konventionelle levedygtighed assays, der er baseret på mitokondriel funktionalitet.
Her er en optimeret protokol for en differentieret nuklear farvning assay beskrevet. Protokollen giver mulighed for hurtig og præcis bestemmelse af cytotoksicitet af mitocans eller deres kombinationer med andre forbindelser. Hoechst 33342 er et cellepermeant nukleart farvestof, der let krydser cellemembraner for at plette DNA, så det samlede celletal kan opnås. Ved co-farvning med PI, som kun kommer ind i kerner af døde celler, kan andelen af levende (Hoechst kun) og døde (farves med begge) celler præcist bestemmes. Denne protokol forædler den offentliggjorte analyse35 ved at tilføje et trin til optimering af farvestofkoncentrationen (ved krydsrefererende resultater med ortogonal trypan blå metode) og centrifugering af pladen før billeddannelse. Da mange cellelinjer er semi-klæbende eller suspenderet, centrifugering øger andelen af celler, der er afbildet og stærkt forbedrer nøjagtigheden. Analysen har flere fordele, herunder at farvning ikke kræver fjernelse af medier eller vask. Farvestoffet blandingen er også billig, let at forberede, og kompatibel med multichannel / robot pipetting systemer.
Efter celler er blevet plettet, er de afbildet med et automatiseret mikroskop. Dette har den ekstra fordel at skabe en permanent registrering af de billeder, der kan re-analyseres senere, og virkningerne af bestemte forbindelser kan revurderes ved visuel inspektion af optagne billeder. Når billederne er opnået, kan celler tælles enten manuelt eller ved hjælp af flere softwarepakker, herunder både gratis (f.eks. ImageJ, CellProfiler osv.) og kommerciel software (f.eks. Automatiseret celletælling er generelt at foretrække, da korrekt udviklede automatiserede celletællingspipelines er mere nøjagtige og mindre forudindtagede end manuelle optællinger. De har også mere effektivt se bort fra cellerester eller uopløselige komplekser. Udviklingen af disse rørledninger er generelt ligetil og forenkles af effektiviteten af de anvendte pletter. Outputtet er kvantitativt, da det faktiske antal døde celler automatisk beregnes i forhold til det samlede celletal, og der kan anvendes forskellige tærskler for at øge eller mindske strengheden af detektion35. For nemheds skyld er optimerede parametre til optælling af celler ved hjælp af Gen5 v. 3.00-softwarekompatibel Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader inkluderet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cytotoksicitetsanalyse: Opsætning
- Der tilberedning af renteforbindelser ved de ønskede koncentrationer i de relevante medier (serumfri eller 1, 2,5 eller 5% FBS RPMI-1640).
- For at måle cytotoksiciteten for en enkelt forbindelse (f.eks. for at bestemme effektive doser) skal der forberedes forbindelser ved 2x endelig koncentration.
- For at måle cytotoksicitet af sammensatte kombinationer, forberede forbindelser på 4x endelig koncentration.
- Betjening af opløsningsmiddelbetjeninger ved at blande den samme mængde opløsningsmiddel med det relevante medium. For eksempel, hvis testforbindelser opløst i DMSO og methanol, gøre opløsningsmiddel-only kontrol for hvert opløsningsmiddel.
- Celler fra kulturskål eller kolbe opsamles i et 15 ml konisk rør.
- 10 μL cellesuspension overføres til et mikrocentrifugerør og en plet med 10 μL 0,4 % trypanblå. Brug et hæmocytometer til at tælle levedygtige og ikke-levedygtige celler for hver cellekilde.
- Pellet celler ved 200 g i 5 min. Aspirat eller dekantering supernatant.
- Resuspend cell pellet i assay-passende medier (serum-fri eller 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) ved en celletæthed på 3 * 105 celler / ml.
NOTE 1: Celletæthed på 3*105 celler/ml giver en såningstæthed på 15.000 celler/brønd. Såningstætheden er en vigtig parameter og bør ideelt set defineres på forhånd forud for forsøget. Såningstæthed bør tage hensyn til 1) cellestørrelse – normalt større celler er seedet på en lavere tæthed; 2) behandlingsvarighed – celler er typisk seedet på en lavere tæthed for eksperimenter, der vil vare længere; og 3) celledelingshastighed – celler med en højere division er seedet med en lavere tæthed. Specifikke eksempler på optimeret såningstæthed: K562 celler, større, 24 timers varighed – 10.000 celler/brønd; MOLM-13 celler, moderat størrelse, 24 timers behandling – 15.000/well; MOLM-13 celler, 48 h behandling – 8.000/well; små sunde perifere blodmonnuklede celler (PBM), 24 timers behandling – 50.000/godt; primære AML-celler, 24 timers behandling – 15.000-20.000/brønd.
NOTE 2: Tilstedeværelsen af FBS i medierne kan påvirke aktiviteten af forbindelserne. Reduktion af koncentrationen af FBS kan gøre analyseresultater enklere at fortolke, men det reducerer også den fysiologiske nøjagtighed. - Frø 50 μL celle suspension fra trin 1,5 i hver brønd af en 96-brønd plade ved hjælp af en multikanal pipette.
- Der tilføjes forbindelser på følgende måde:
- For enkelt sammensatte analyser tilsættes 50 μL 2x sammensat opløsning i hver brønd. For opløsningsmiddelkontrol godtninger tilsættes 50 μL testmedier, der indeholder opløsningsmidlet ved 2x-koncentrationen.
- For kombinationsanalyser tilsættes 25 μL af hver af forbindelsen (4x opløsninger) i hver brønd. For enkeltblandingskontrol godtninger tilsættes 25 μL 4x sammensat opløsning og 25 μL testmedium. For opløsningsmiddelkontrol godtninger tilsættes 50 μL testmedium eller testmedholdning af opløsningsmidlet.
NOTE 1: Den endelige koncentration af DMSO må ikke overstige 0,5 %.
BEMÆRK 2: Det anbefales at tilføje det medie, der indeholder forbindelserne, med pipetten, der rører væggen i hver brønd på grund af lav lydstyrke.
- Bank forsigtigt på pladen for at sikre blanding af indholdet af brøndene.
- Inkuber plader ved 37 °C i befugtet 5% CO2 atmosfære i et passende tidsrum, f.eks.
2. Cytotoksicitetsanalyse: farvning med Hoechst 33342 og propidiumidodid
- Forbered 10x farvningsopløsning. Denne løsning skal tilberedes frisk før hvert eksperiment, kan den ikke opbevares. Slutstofkoncentrationerne bestemmes forud for forsøget.
- For leukæmicellelinjer og primær leukæmiceller indeholder 1 ml 10x farvningsbuffer 10 μL 20 mM Hoechst 33342 og 50 μL på 1 mg/ml propidiumidid i steril PBS (slutkoncentrationer: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).
- For sunde PBM'er indeholder 1 ml 10x farvningsbuffer 10 μL på 20 mM Hoechst 33342 og 10 μL 1 mg/ml propidiumid i sterilt PBS (slutkoncentrationer: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/ml).
BEMÆRK: Den endelige koncentration af propidiumidodid skal bestemmes forud for forsøgene. Cellerne skal testes ved hjælp af en række PI-koncentrationer (1, 2,5, 5 μg/ml), og derefter skal Hoechst/PI-beregnede levedygtighed sammenlignes med levedygtighed målt via trypanblå. De PI-koncentrationer, der er anført ovenfor, blev valgt baseret på målcelleets levedygtighed i mediekontrolbnden (over ~ 90% for leukæmi cellelinjer, over ~ 70% for sunde PBM'er).
FORSIGTIG: Hoechst 33342 og propidiumidid er potentielle kræftfremkaldende stoffer. Bær passende personlige værnemidler, når du håndterer dem.
- Efter inkubation, bruge en multichannel pipette til at tilføje 10 μL af 10x farvning buffer til hver brønd.
BEMÆRK: For at undgå krydskontaminering skal du sørge for, at pipettespidserne ikke rører ved mediet. - Bank forsigtigt på pladen for at blande og klare bobler. Pletten ved 37 °C i 15 min.
- Centrifuge pladen ved 200 g i 4 min for at bringe alle cellerne til bunden af pladen. Tør forsigtigt bunden af pladen af med en fugtig kimwipe for at fjerne fibre og/eller snavs, der vil forstyrre billeddannelse.
BEMÆRK 1: Centrifugering af pladen sikrer de højeste chancer for, at alle cellerne kan optages i billedet. Ofte døde celler vil løsne sig og flyde, giver vildledende værdier af cytotoksicitet. Centrifugering afbøder denne effekt.
BEMÆRK 2: Pladen skal afbildes så hurtigt som muligt efter centrifugering, ideelt set inden for 15 min. Centrifugering kan reducere selektiviteten af PI farvning og kan tillade celler til langsomt at periodisere propidium iodid. Forbedringen i nøjagtighed opnået ved at visualisere de døde celler opvejer den lille stigning i PI farvning. Det anbefales at afslutte billeddannelse inden for 1 time centrifugering.
3. Cytotoksicitetsanalyse: dataindsamling
- Indstil softwaren til det automatiserede mikroskop/pladebillede til at detektere fluorescens for både Hoechst 33342 (excitation maksimum 350 nm, emission maksimum 461 nm) og PI (excitation maksimum 493 nm, emission maksimum 636 nm). Anskaf billeder for hver brønd i begge kanaler.
- Brug af softwaren (såsom CellProfiler, en gratis billedanalyse studie baseret på MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ, eller proprietære software såsom Gen5) tælle cellerne i hver brønd i hver kanal.
BEMÆRK: Da hver celle skal farves med Hoechst 33342, og døde celler skal farves med PI, forholdet mellem døde og alle repræsenterer den brøkdel af celler, der er døde. For eksempel, hvis den automatiserede optælling i ubehandlet prøve viser 467 celler plettet med PI (døde celler) og 2335 celler plettet med Hoechst 33342 (samlede celler), fraktionen døde er 0,2 eller 20%. Denne værdi sammenlignes derefter med en prøve, der håndteres på samme måde, hvor der blev anvendt behandling. - Detaljeret beskrivelse af Hoechst/PI-dataindsamling ved hjælp af Cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader og Gen5 v. 3.00-software:
- Indstil Cytation5 multimode pladelæser / imager til billedceller i flad bund, 96-godt, generiske sorte plastplader.
- Indstil en billedbehandlingsprotokol til at bruge standard-DAPI- og Texas Red-filtersættene. Tag billeder i brønden center ved hjælp af en 4x forstørrelse mål. Brug ingen forskydning (X/Y eller Z). Brug følgende billedindstillinger: DAPI – LED - 10, integrationstid - 99, forstærkning - 0; Texas Red - LED - 8, integration tid - 950, gevinst - 18. Udfør automatisk fokus ved hjælp af DAPI-signalet. der bør ikke være nogen forskydning i fokus mellem kanaler.
- Udfør billedanalyse ved hjælp af Gen5-software v 3.00. I softwareindstillingerne skal du definere celler som figurer mellem 5 og 25 μm i deres størrelse. Udeluk primære kantobjekter, og opdel berøringsobjekter ved at slå den specielle indstilling til "Opdel berøringsobjekter". Beting derefter billedet for at fjerne baggrunden (mørk baggrundsindtraktion), anvende en nuklear maske (tærskelværdi DAPI >= 6000 AU) og tælle objekter. Udfør en analyse af delpopulationen baseret på PI-farvning (tærskelværdi Texas Red >= 5000 AU), og tæl objekter. Celle levedygtighed % defineres som (1 -
.
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovennævnte protokol er udviklet ved hjælp af OCI-AML2 celler, som blev taget som en repræsentativ akut myeloid leukæmi cellelinje. AML er karakteriseret ved unormal spredning af udifferentierede og ikke-funktionelle hæmatopoietiske celler i knoglemarven26. På trods af den seneste udvikling inden for målrettet behandlingsstandarden har været uændret i flere årtier og består af induktionsbehandling (typisk bestående af tre dages antracyklin, f.eks. daunorubicin, idarubicin eller antraetion mitoxanthrone, og 7 dages cytaabin) efterfulgt af konsolidering (typisk bestod af runder med behandling af cytarabin efterfulgt af restitutionsperioder)36.
Efter den protokol, der er beskrevet i figur 1A,blev OCI-AML2-cellerne sået i 96-brøndsplader og behandlet med mitokondriel uncoupler carbonylcyanid m-chlorophenylhydraton (CCCP) eller glykolytisk hæmmer 2-deoxy-D-glucose (2-GD) ved en række koncentrationer. Cellerne blev behandlet i 24 timer ved 37 °C i serumfrie RPMI-1640-medier, og derefter blev levedygtigheden vurderet ved hjælp af prøvepandeblå (TB) udelukkelse eller en af fire levedygtighedsanalyser (Hoechst/PI differentiale nuklear farvning, LDH-frigivelsesanalyse, MTT eller alamarBlue). Repræsentative billeder af celler, der er bejdset med Hoechst/PI, er vist i figur 2A. Flere vigtige bemærkninger kan fremsættes med det samme. For det første er det samlede antal celler (Hoechst-farvning) rimeligt højt og er markant større end antallet af døde celler (PI-farvning). Dette tyder på, at medieforholdene ikke udløser høje celledødsfald. For det andet, da kun celler, der mærkes med både Hoechst og PI tælles som døde (lilla celler i det fusionerede billede), sandsynligheden for at tælle snavs er meget lav. Dette billede viser et godt eksempel på korrekt farvede celler.
Figur 1. Eksperimentel tidslinje og sammenligning af eksisterende cytotoksicitetsanalyser. a) Rutediagram med en sammenfatning af tidsfristerne for forsøgsproceduren, f.eks. (B) Sammenligning af cytotoksicitetsanalyser, hvoraf nogle blev anvendt i denne undersøgelse. Dye udelukkelse analyser indebærer impermeant nukleare farvestoffer, der pletter døde celler med kompromitteret plasma membran: TB – trypan blå, PI – propidium iodid, EtBr – ethidium bromid, og SYTOX. Anden gruppe af analyser afhænger af cellulære stofskifte, for eksempel, tetrazolium salte MTT, XTT, og CKK-8 (WST-8), resazurin-baserede reagens alamarBlue, etc. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Sammenligning af et panel af cytotoksicitetsanalyser med trypanblå udelukkelse. a) Repræsentative billeder af total (Hoechst 33342) og døde (propidium iodid, PI) OCI-AML2 celler via Hoechst/PI farvning. b)Vurdering af OCI-AML2-cellers levedygtighed ved hjælp af forskellige metoder efter behandling med en gradient af CCCP -eller2-GD(bund). OCI-AML2 blev behandlet med CCCP eller 2-DG i serumfri RPMI-1640 i 24 timer før bestemmelse af cellernes levedygtighed. Vist er middelværdi, fejlbarer repræsenterer SEM. C. Forskellen i cellernes levedygtighed mellem cytotoksicitetsanalyser i (B) vs. trypan blå farvning (se supplerende tabel S1-2 for de nøjagtige tal og medianforskel). Stjerner angiver betydelig forskel vs. trypan blå farvning. ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns – ikke-signifikant. Gruppesammenligning blev udført via t-testmed korrektion for flere hypotese test. Tre uafhængige biologiske replikater blev udført. Klik her for at se en større version af dette tal.
Som vi for nyligrapporteret 19, leukæmi er meget følsomme over for mitotoksiske behandlinger, hvilket indikerer, at cellerne allerede har underliggende mitokondriel skade. På dette grundlag forudsagde vi, at MTT og alamarBlue-analyser, som er baseret på mitokondriel enzymaktivitet, ville unøjagtigt måle cellulær levedygtighed. Som forventet viste disse analyser (især alamarBlue) betydeligt lavere levedygtighed sammenlignet med prøvepandeblå udelukkelse, se figur 2B,C, supplerende tabel S1-S2). Dette er i overensstemmelse med det faktum, at doser af disse forbindelser, der kræves for at fremkalde apoptose eller nekrose er højere end dem, der er nødvendige for at kompromittere mitokondrielle funktion.
Blandt de analyser, der blev testet, havde dobbelt farvning med Hoechst 33342 og PI den bedste kombination af robusthed, følsomhed og konsistens med TB-farvning med den mindste medianafvigelse fra TB-udelukkelsesmetoden efter BEHANDLING med CCCP eller 2DD (Supplerende tabeller S1-2). Det er interessant, at levedygtigheden ved højere doser af CCCP (50 og 100 μM), der anslås med Hoechst/PI eller TB, blev øget sammenlignet med lavere doser (figur 2B, top). Dette skyldes sandsynligvis udfældningen af CCCP ved højere doser på grund af dets hydrofobiske, hvilket reducerer dens effektive koncentration og indvirkning på cellerne. Forøgelse af dosis af CCCP reducerede hoechst/PI-estimeret gennemsnitlig levedygtighed for OCI-AML2-celler, dog: 74 % ved 150 μM, 62 % ved 200 μM, 6 % ved 300 μM (ikke viste data).
Hoechst/PI-analysen var også effektiv til at bestemme cellulær levedygtighed efter behandling med andre mitokondrier-målmolekyler. Disse omfattede rotenon, en gift, der kompromitterer Complex I af mitokondrielle elektron transport kæde37, og 3-bromopyruvat, en glykolytisk hæmmer og alkylerende middel, der svækker mitokondrielle åndedræt og mitokondriemetabolisme38 (Figur 3A-D, supplerende tabeller S3-4).
Figur 3. Validering af Hoechst/PI cytotoksicitetsanalyse i leukæmiceller. (A,B)OCI-AML2 (AML) celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af rotenon (A) eller 3-bromopyruvat, 3-BP (B) i serumfri RPMI-1640 medier i 24 timer, derefter levedygtighed blev bestemt. Vist er middelværdi med SEM. (C,D) Sammenligning af levedygtighedsforskel mellem Hoechst/PI-analyse vs. trypanblå farvning (for cellerne i A-B, se supplerende tabel S3-4 for kvantation). Stjerner angiver statistisk signifikans i forhold til trypanblå farvning. ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns – ikke-signifikant. Gruppesammenligning blev udført via t-testmed korrektion for flere hypotese test. E. MOLM-13 (AML), primære AML-celler isoleret fra en patient, MOLT-4 (ALL) og K562 (CML) celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af rotenon i serumfri RPMI-1640 medier i 24 timer, før levedygtighedbestemmelse ved hjælp af Hoechst/PI farvning. Vist er betyde med SEM. Tre uafhængige biologiske replikater blev udført. Klik her for at se en større version af dette tal.
Hoechst/PI cytotoksicitetsanalyse blev yderligere valideret ved hjælp af et panel af leukæmicellelinjer, der repræsenterer flere typer leukæmi, samt primære celler. De omfattede MOLM-13 (en AML cellelinje), primære AML celler stammer fra en repræsentativ patient prøve, MOLT-4 (en akut lymfoblastær leukæmi cellelinje, ALL), og K562 (en kronisk myelogen leukæmi cellelinje, CML) (Figur 3E, Supplerende Figur S1). Resultaterne af Hoechst/PI-analysen viste, at disse celler havde store forskelle i rotenonfølsomhed, lige fra meget følsomme (MOLT-4) til resistente (K562) celler.
For at påvise analysens robusthed blev OCI-AML2-celler behandlet med en koncentrationsgradient på 3-bromopyruvat som beskrevet i ovenstående protokol. Celletællinger blev indsamlet for 6 brønde ved hver koncentration og er vist (Figur 4A,B). Disse optællinger blev anvendt til at beregne rentabiliteten og viste, at så få som 4 brønde var tilstrækkelige til præcist at opfange analyseresultatet (figur 4C). Den resulterende dosis-respons kurve er vist (Figur 4D).
Figur 4. Reproducerbarhed af Hoechst/PI-farvning. Levedygtigheden af OCI-AML2-celler efter 24 timers behandling med forskellige koncentrationer af 3-bromopyruvat (3-BP). a) Samlet antal celler, der tælles via Hoechst 33342 farvning, B )Antaldøde celler, der tælles via propidiumdodidfaring. c) Rentabilitet (%) beregnet ved hjælp af (A-B). d) Repræsentativ graf for dosisrespons. Vist er betyde med SEM. Tre uafhængige biologiske replikater blev udført. Klik her for at se en større version af dette tal.
Selv om analysen er relativt robust, skal der stadig tages hensyn. Forkert udførelse af analysen kan kompromittere dens nøjagtighed. Flere kompromitterede resultater vises med henblik på fejlfinding (figur 5). Det første sæt billeder viser konsekvenserne af overfarvning med PI, som kan opstå fra følgende kilder: brug af farvestoffet ved for høj koncentration, farvning for længe, eller ved hjælp af for høj LED intensitet / integration tid i den røde kanal (Figur 5A). Disse fejl vil generere kunstigt oppustede antal døde celler. Det andet spørgsmål opstår ved at negligere centrifugeringstrinnet. Ofte, døde celler begynder at miste deres vedhæftet fil fra overfladen af skålen. De vil derfor blive underrepræsenteret under erhvervelsen af billeder, som generelt forekommer nær bunden af brønden (Figur 5B). Endelig overeksponering i Hoechst-kanalen kunstigt udvider størrelsen af cellerne, hvilket reducerer det samlede antal pr brønd og begrænser analysen magt (Figur 5C).
Figur 5. Sammenligning af optimale og suboptimale analyseparametre. Sammenligning af resultater opnået via optimerede parametre (venstre) eller suboptimale parametre (højre). a)Sunde PBM'er blev farves med propidiumidodid ved 1 μg/ml (venstre) eller 5 μg/ml (højre) i 15 minutter før billeddannelse. b) Billeder af OCI-AML2-celler taget med (venstre) eller uden (højre) pladecentrifugering. c)Billeder af OCI-AML2-celler, der er anskaffet med optimal (venstre) eller overdreven (højre) integrationstid for Hoechst-kanalen. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Forskel med trypanblå metode, % | ||||
| CCCP, μM | Hoechst/PI | LDH-analyse | Mtt | Alamar Blå |
| 3.1 | -1.19 | 33.00 | -31.05 | -59.04 |
| 6.3 | 6.99 | 41.90 | -11.03 | -59.34 |
| 12.5 | 0.71 | 41.60 | 4.31 | -52.52 |
| 25 | 30.73 | 66.33 | -3.68 | -51.85 |
| 50 | 47.38 | 50.71 | -17.71 | -60.27 |
| 100 | 13.81 | 17.12 | -45.31 | -67.25 |
| Median | 10.40 | 41.75 | -14.37 | -59.19 |
Supplerende tabel S1. Levedygtighedsforskelle for et panel af analyser i OCI-AML2-celler efter CCCP-behandling. Der blev foretaget en vurdering af rentabiliteten efter 24 timers behandling med forskellige koncentrationer af CCCP. Median levedygtighed forskelle mellem testede analyser (Hoechst / PI, LDH, MTT, eller alamarBlue) og trypan blå farvning med automatiseret optælling blev beregnet på grundlag af levedygtighed forskelle ved hver lægemiddelkoncentration.
| Forskel med trypanblå metode, % | ||||
| 2-GD, mM | Hoechst/PI | LDH-analyse | Mtt | Alamar Blå |
| 3.1 | 16.16 | 20.77 | 5.82 | -20.27 |
| 6.3 | 22.93 | 31.96 | -11.13 | -31.11 |
| 12.5 | 30.85 | 45.07 | -34.27 | -36.29 |
| 25 | 13.81 | 42.39 | -55.79 | -52.29 |
| 50 | 16.96 | 81.12 | -29.38 | -47.68 |
| 100 | 7.79 | 149.16 | -19.37 | -28.67 |
| Median | 16.56 | 43.73 | -24.38 | -33.70 |
supplerende tabel S2. Levedygtighedsforskelle for et panel af analyser i OCI-AML2-celler efter behandling med 2 GD. Der blev foretaget en vurdering af rentabiliteten efter 24 timers behandling med forskellige koncentrationer af 2-GD. Median levedygtighed forskelle mellem testede analyser (Hoechst / PI, LDH, MTT, eller alamarBlue) og trypan blå farvning med automatiseret optælling blev beregnet på grundlag af levedygtighed forskelle ved hver lægemiddelkoncentration.
| Rotenon, μM | Levedygtighedsforskel, % (Hoechst/PI-trypan blå) |
| 10 | 4.45 |
| 25 | 7.61 |
| 50 | 17.70 |
| 100 | 7.74 |
| 150 | 56.38 |
| 200 | 16.57 |
| Median | 12.15 |
Supplerende tabel S3. Levedygtighedsforskel mellem Hoechst/PI og TB-udelukkelsesmetoden i OCI-AML2-celler efter behandling med rotenon. Der blev foretaget en vurdering af levedygtigheden efter 24 timers behandling med forskellige koncentrationer af rotenon. Median levedygtighedsforskellen mellem Hoechst/PI og trypanblå farvning med automatisk optælling blev beregnet på grundlag af rentabilitetsforskelle ved hver lægemiddelkoncentration.
| 3-BP, μM | Levedygtighedsforskel, % (Hoechst/PI-trypan blue) |
| 5 | 5.73 |
| 10 | 9.00 |
| 25 | 7.72 |
| 50 | -1.90 |
| 100 | -28.23 |
| 200 | -20.77 |
| Median | 1.91 |
Supplerende tabel S4. Levedygtighedsforskel mellem Hoechst/PI og TB-udelukkelsesmetoden i OCI-AML2-celler efter behandling med 3 bromopyruvat (3-BP). Der blev foretaget en vurdering af rentabiliteten efter 24 timers behandling med forskellige koncentrationer af 3-BP. Median levedygtighedsforskel mellem Hoechst/PI og trypanblå farvning med automatisk optælling blev beregnet på grundlag af rentabilitetsforskelle ved hver lægemiddelkoncentration.
supplerende figur S1. Repræsentative billeder af celler, der er besyvet med Hoechst/PI, med eller uden behandling med rotenon ved indiceret koncentrationer i serumfrie RPMI-1640-medier i 24 timer: A-B. AML: MOLM-13 cellelinje (A) og primære AML-celler (B) afledt af en repræsentativ patientprøve. C. ALL: MOLT-4 celle linje. D. CML: K562 celle linje. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om protokollen for Hoechst/PI cytotoksicitetsanalyse er robust og kræver forholdsvis lidt praktisk tid, er der flere eksperimentelle detaljer, der er meget vigtige for at sikre nøjagtige resultater. For det første er det vigtigt at sikre, at koncentrationen af DMSO forbliver under 0,5 % (v/v). Der er almindelig enighed om , at eksponering for selv lave doser af DMSO i væsentlig grad kan ændre morfologien og fastgørelsen af celler og i væsentlig grad forsinke cellecyklusprogressionen39,40.
For det andet skal farvning udføres så hurtigt som muligt efter behandlingen. Da der ikke er nogen vasketrin, forbliver forbindelsen i brøndene og kan fortsætte med at påføre skade på cellerne. I forhold til den tidligere protokol35blev cellerne kun plettet i 15 minutter. Dette begrænser muligheden for, at levedygtige celler uforvarende kan farves med propidium iodid. Af denne grund foreslår vi svimlende behandlinger og farvning, hvis mere end to plader vil blive behandlet. Dette giver mulighed for billeddannelse tid mellem plader og forbedrer reproducerbarhed.
For det tredje er passende farvestofkoncentration afhængig af celletype. Det er vigtigt at empirisk bestemme den optimerede propidium iodid koncentration, begyndende med ubehandlede celler, ved hjælp af trypan blå farvning som en ortogonal reference.
Endelig centrifugering skridt umiddelbart før visualisering er også kritisk. Baseret på denne protokol registreres der et interval på 500-4.000 celler (afhængigt af såningstætheden). Dette er en bemærkelsesværdig forbedring i forhold til de 100-400 celler pr godt brugt tidligere35. I betragtning af variationen i populationen af kræftceller (især primære celler), der flere celler til analyse er vigtigt, og kan tillade mere robust dataanalyse.
På grund af metodens relative enkelhed kan der nemt udføres en lang række ændringer. For eksempel er mange andre celle-impermeant farvestoffer tilgængelige fra en række leverandører og kan erstattes af propidium iodid. Mens denne substitution har relativt lidt værdi i sig selv, betyder den øgede palet af farver, at der kan udføres mere komplekse eksperimenter. For eksempel vil tilføjelsen af en tredje farve gøre det muligt differentieret overlevelse, der skal vurderes mellem delpopulationer af celler, som det almindeligvis udføres med flow cytometri.
En mere omfattende ændring af protokollen er ovenstående cellevisualisering og bruger i stedet et spektrofotometer. Denne fremgangsmåde har den fordel at udnytte en næsten allestedsnærværende stykke udstyr (en standard spektrofotometer med en mikroplade læser) og er den hurtigste metode til at erhverve data. Men denne metode er langt mindre præcis. Fluorescensintensiteten er repræsentativ for cellefarvning, men stokastiske variationer i farvningsintensiteten, kombineret med det relativt mindre prøveområde, medfører en betydelig variation. Mens yderligere optimering (såsom inddragelse af en fiksativ, yderligere vask trin, eller et større antal prøver) kan løse disse problemer, fluorescens mikroskopi er generelt en overlegen tilgang.
Afslutningsvis er den modificerede Hoechst / PI protokol en hurtig, præcis, billig, høj-throughput cytotoksicitet assay, der er uafhængig af mitokondriel funktion. Denne analyse har betydelige nytte for effektivt screening forbindelser eller sammensatte kombinationer, der er målrettet mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
NVK, en CPRIT forsker i Cancer Research, takker Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) for deres generøse støtte, CPRIT tilskud RR150044. Dette arbejde blev også støttet af Welch Foundation Research Grant C-1930, og af National Institutes of Health R35 GM129294 tildelt NVK. Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiet design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
References
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry. Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).
- Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells. Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).
- Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Castro-Vega, L. J., et al. The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells. Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).
- Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell. Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).
- Osisami, M., Keller, E. T. Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy. Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).
- Zhang, S., et al. Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells. Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).
- Mittal, K., et al. Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer. British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).
- McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines. British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).
- Kaja, S., et al. An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).
- Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay. Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).
- Plemel, J. R., et al. Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis. Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12.18 (2004).
- Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy. Scientific Reports. 4, 4698 (2014).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).
- Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs. Cell Death & Disease. 10 (8), 617 (2019).
- Caro, P., et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Senft, D., Ronai, Z. A. Regulators of mitochondrial dynamics in cancer. Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).
- Vazquez, F., et al. PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).
- Caino, M. C., Altieri, D. C. Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion. Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).
- Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).
- Kreitz, J., et al. Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia. Cells. 8 (8), (2019).
- Sriskanthadevan, S., et al. AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress. Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).
- Guerra, F., et al. Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).
- Ubah, O. C., Wallace, H. M. Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles. Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).
- Yamaguchi, R., et al. Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy. PLoS One. 6 (9), 24102 (2011).
- Hahn, T., et al. Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).
- Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy. Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).
- Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds. Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).
- Döhner, H., et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 115 (3), 453-474 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7, 45465 (2017).
- Fan, T., et al. Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment. Cancers (Basel). 11 (3), (2019).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells. Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).
- Tunçer, S., et al. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Scientific Reports. 8 (1), 14828 (2018).
