Summary
Denne protokollen beskriver preparatet, biotribologisk testing og analyse av osteokondrale sylindere som glir mot metallimplantatmateriale. Utfallstiltak som inngår i denne protokollen er metabolsk aktivitet, genuttrykk og histologi.
Abstract
Osteokondrale defekter hos middelaldrende pasienter kan behandles med fokale metalliske implantater. Først utviklet for defekter i kneleddet, implantater er nå tilgjengelig for skulder, hofte, ankel og den første metatarsalphalangeal ledd. Mens du gir smertereduksjon og klinisk forbedring, observeres progressive degenerative endringer i den motsatte brusk hos mange pasienter. Mekanismene som fører til denne skaden er ikke fullt ut forstått. Denne protokollen beskriver et tribologisk eksperiment for å simulere en metall-på-brusk sammenkobling og omfattende analyse av leddbrusk. Metallimplantatmaterialet testes mot storfe osteokondrale sylindere som modell for human leddbrusk. Ved å bruke forskjellige belastninger og glidende hastigheter, kan fysiologiske lasteforhold etterlignes. For å gi en omfattende analyse av effektene på leddbrusk, er histologi, metabolsk aktivitet og genuttrykksanalyse beskrevet i denne protokollen. Den største fordelen med tribologisk testing er at lasteparametere kan justeres fritt for å simulere in vivo forhold. Videre kan ulike testløsninger brukes til å undersøke påvirkning av smøring eller proinflammatoriske midler. Ved å bruke genuttrykksanalyse for bruskspesifikke gener og katabolske gener, kan tidlige endringer i metabolismen av leddkondrocytter som svar på mekanisk belastning påvises.
Introduction
Behandlingen av osteokondralefekter er krevende og krever kirurgi i mange tilfeller. For fokale osteokondrale lesjoner hos middelaldrende pasienter er fokale metalliske implantater et levedyktig alternativ, spesielt etter svikt i primærbehandling, som benmargsstimulering (BMS) eller autolog chondrocyte implantasjon (ACI)1. Delvise overflateerstatninger kan betraktes som redningsprosedyrer som kan redusere smerte og forbedre bevegelsesområdet2. Disse implantatene består vanligvis av en CoCrMo legering og er tilgjengelige i forskjellige størrelser og offset konfigurasjoner for å matche normal anatomi3. Mens opprinnelig utviklet for defekter på mediale femoral condyle i kneet, slike implantater er nå tilgjengelig og i bruk for hofte, ankel, skulder, og albue4,5,6. For et tilfredsstillende resultat er det avgjørende å vurdere mekanisk fellesjustering og tilstand av den motsatte brusk. Videre har riktig implantasjon uten fremspring av implantatet vist seg å være grunnleggende7.
Kliniske studier viste gode kortsiktige resultater når det gjelder smertereduksjon og forbedring av funksjon hos middelaldrende pasienter for ulikesteder 5,6,8. Sammenlignet med allograft implantasjon, fokal metall implantater tillate tidlig vekt peiling. Men den motsatte leddbrusk viste akselerert slitasje hos et betydelig antall pasienter9,10. Derfor, selv med riktig plassering, i mange tilfeller degenerasjon av den innfødte brusk synes uunngåelig, mens de underliggende mekanismene forblir uklare. Lignende degenerative endringer er observert etter bipolar hemiarthroplasty i hoften11 og økes med aktivitet og lasting12.
Tribological eksperimenter gir mulighet til å studere slike sammenkoblinger in vitro og simulere ulike lastesituasjoner som oppstår under fysiologiske forhold13. Bruken av osteokondrale pinner tilbyr en enkel geometrimodell for å undersøke tribologien til leddbrusk som glir mot innfødt brusk ellerimplantatmateriale 14 og kan videre brukes i hele leddsimuleringsmodeller15. Metall-på-brusk sammenkoblinger viser akselerert brusk slitasje, ekstracellulær matrise forstyrrelse, og redusert celle levedyktighet i overfladisk sone sammenlignet med en brusk-på-brusk sammenkobling16. Skade på brusk skjedde hovedsakelig i form av delaminering mellom overfladiske og midtre soner17. Mekanismene som fører til bruskdegenerasjon er imidlertid ikke fullt ut forstått. Denne protokollen gir en omfattende analyse av biosyntetisk aktivitet av leddbrusk. Ved bestemmelse av metabolsk aktivitet og genuttrykk nivåer av katabolske gener, tidlige indikasjoner for brusk sammenbrudd kan identifiseres. Fordelen med in vitro tribological eksperimenter er at lasting parametere kan justeres for å etterligne ulike lasteforhold.
Derfor er følgende protokoll egnet til å simulere en metall-på-brusk sammenkobling, som representerer en eksperimentell hemiarthroplasty modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av metallsylindere
- Analyser sylindriske kobolt-krom-molybden (CoCrMo) stenger oppfylle standard spesifikasjoner for kirurgiske implantater for deres kjemiske sammensetning ved hjelp av skanning elektron mikroskopi (SEM) med energidispergering x-ray spektroskopi per produsentens protokoll for å bekrefte gitte verdier.
MERK: Den elementære sammensetningen av CoCrMo-legeringen som brukes til dette eksperimentet er 65% Co, 28% Cr, 5% Mo og 2% andre. - Våt slip prøvene med silisiumkarbid slipepapir starter med en kornstørrelse på 500. Bruk slipepapir i økende rekkefølge opp til en kornstørrelse på 4000.
- Poler sylinderen med 3 μm og 1 μm pasta for å oppnå en overflate grovhet som er innenfor toleransenivået av overflatebehandling krav for metalliske kirurgiske implantater (ISO 5832-12:2019) og totalt og delvis felles erstatning implantater (ISO 21534:2007).
MERK: Gjennomsnittlig overflate grovhet bestemmes ved hjelp av et konfokal mikroskop. - Kapp CoCrMo stenger (Ø på 6 mm) til sylindere med en lengde på 10 mm.
2. Høsting av osteokondralsylindere
- Bruk storfe kvele ledd fra skjelettmodne dyr (i alderen 18-24 måneder på offertid) og holde dem inneholdt og avkjølt til disseksjon innen 24 timer etter offer.
MERK: Ledd kjøpes fra den lokale slakteren. Leddet forblir lukket til disseksjon. - For å høste sylindriske osteokondrale plugger under aseptiske forhold, desinfisere kneet og utføre en arthrotomy og utsette den mediale femoral condyle.
MERK: Disseksjonen må utføres med forsiktighet for ikke å skade leddoverflaten. - Inspiser leddoverflaten for makroskopiske skader.
MERK: Kast prøven hvis brusken mangler sitt hvite, glatte og blanke utseende, eller hvis det er blemmer, sprekker eller større defekter. - Juster skjærerøret vinkelrett på leddflaten av vektbærende området og kjør enheten inn i brusk og subkondral bein ved faste slag med en hammer. Ved 15 mm inntrengningsdybde vrir du enheten med klokken med en plutselig bevegelse.
- Fjern enheten, sett inn den hvite knotten og skru den inn til den nederste enden av osteokondralpluggen er synlig.
- Merk anteroposterior orientering av prøvene med en steril markør for å ordne osteokondral sylinder tilsvarende under testing.
MERK: Det tredimensjonale kollagennettverket og dens komplekse arkitektur forenkler de unike mekaniske egenskapene til leddbrusk og bør vurderes i orienteringen av prøvene. - Skyll prøven med fosfatbufret saltvann (PBS) for å vaske av blod og fettvev.
- Gjenta trinnene nevnt ovenfor for å høste ønsket antall osteokondrale plugger (8 mm diameter, 15 mm lengde).
MERK: Vanligvis kan 9 til 12 osteokondrale sylindere høstes fra vektlagerområdet på den mediale femoral condyle. - Plasser prøvene i Dulbeccos modifiserte Eagle medium som inneholder 10% føtal storfe serum, supplert med antibiotika (penicillin 200 U / ml; streptomycin 0,2 mg / ml) og amfotericin B 2,5 μg / ml og lagre dem ved 4 ° C til testing for å opprettholde levedyktighet.
- Analyser kontroll osteokondralplugger umiddelbart etter høsting for å etablere baselineverdier (se analyseseksjon).
3. Tribological testing
- Utfør eksperimentene ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig stempeltribometer med en sylinder-på-plate-konfigurasjon. Kravene til enheten er vertikal lasting og justerbar belastning og glidende hastighet. Videre gjør en flytende celle det mulig å utføre testene i en smøreløsning.
- Bestem kontakttrykket i CoCrMo-on-brusksystemet ved hjelp av en trykkmålingsfilm. Plasser trykkmålingsfilmen i grensesnittet og påfør statisk belastning i 30 s for å bestemme innledende kontakttrykk, kontaktstørrelse og form. På grunn av konveksiteten til metallsylinderen og leddbrusk, har det første kontaktområdet en elliptisk form i denne konfigurasjonen.
MERK: Trykkmålingsfilmen reagerer på det påførte trykket som viser rød misfarging av soner der terskeltrykket nås eller overskrides. For 1 N belastning ble kontakttrykket bestemt rundt 2 MPa ved visuell sammenligning med definert kontakttrykk. - Fest osteokondralsylinderne på den nederste prøveholderen med merkingen på linje med glideretningen, og monter CoCrMo-sylinderne på den øvre lastcellen.
- Tilsett testløsningen (PBS med 3 g/l hyaluronsyre) i væskecellen som resulterer i å senke osteokondralsylinderen og dekke metallbrusk glidende grensesnitt.
- Still inn testparametrene (foreskrevet normal kraft, slag og glidehastighet), som deretter påføres og vedlikeholdes gjennom hele testen.
MERK: Slaglengden på stempelbevegelsen må stilles inn i henhold til kontaktområdet for å opprette et migrerende kontaktområde (MCA). For plugger som er 8 mm i diameter, gir et 2 mm slag tilstrekkelig rehydrering av brusken. - Start gjensidig skyve av CoCrMo sylinder mot leddbrusk nedsenket i smøreløsningen med de innstilte lasteparametrene.
- Overvåk friksjonskoeffisienten (COF) under forsøkene.
MERK: COF vurderes automatisk, men kan beregnes ved hjelp av ligningen μ=F/W (μ - friksjonskoeffisient; F - friksjonskraft; W - normal belastning påføres av systemet). - Avslutt eksperimentet etter ønsket testperiode.
- Fjern osteokondralpluggen fra prøveholderen, skyll den med PBS og oppbevar den i medium til ytterligere biologisk analyse (se nedenfor).
- Senk kontrollprøver i testløsningen ved romtemperatur i løpet av testen og analyser sammen med prøver som har vært utsatt for mekanisk belastning.
4. Analyse
MERK: Osteokondral sylinder analyseres for metabolsk aktivitet og genuttrykk for å undersøke biologisk aktivitet; histologi utføres for å studere bruskoverflateintegritet og den underliggende matrisen.
- Histologi
- For histologisk analyse, senk osteokondralpluggene i 4% bufret formaldehydløsning ved romtemperatur til videre behandling.
- Skyll prøvene med PBS og legg dem i et plastfartøy.
- Legg til et overskudd av den brukte dekalkatorløsningen slik at alle prøvene dekkes.
- Påfør konstant agitasjon i 4 uker for fullstendig avkalking.
- Etter avkalking, bygg inn prøvene i vannløselige glykoler og harpikser og oppbevar dem ved −80 °C.
- Få 6 μm seksjoner ved å kryose transversal til kontaktområdet.
- Deretter forberede prøvene for Safranin O farging og Fastgreen counterstaining ved hjelp av en produsentprotokoll.
- Fang histologiske bilder ved hjelp av et mikroskop og prosess ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare.
- Metabolsk aktivitet
MERK: Den metabolske aktiviteten til kondrocytter i leddbrusk undersøkes med en XTT-basert ex vivo toksikologianalyse.- Skyll osteokondralpluggen ved hjelp av PBS og legg prøven i en petriskål.
- Plasser en 24-brønns plate på en skala og null vekten.
- Klipp av brusk fra osteokondraltransplantaten med en skalpell i ett stykke.
- Bisect brusk i to like stykker slik at kontaktområdet er like fordelt på både brusk stykker og hakke en halv til 1 mm³ stykker. Andre halvdel brukes til genuttrykksanalyse.
- Overfør hakket brusk til en brønn av den tilberedte 24-brønnsplaten og bestem vevsvekten.
- Gjenta trinnene nevnt ovenfor for hver prøve og tilsett 1 ml vekstmedium til hver brønn av platen.
- Tilsett XTT-oppløsningen (490 μL XTT-merkereagens og 10 μL aktiveringsreagens) i henhold til produsentens instruksjoner og blanding.
- Inkuber platen ved 37 °C og 5 % CO2 i 4 timer.
- Etter inkubasjon, fjern supernatanten og overfør den til et 5 ml rør.
- Trekk ut tetrazoliumproduktet ved å tilsette 0,5 ml dimetylsulfoksid (DMSO) til bruskvevet i 24-brønnplaten og påfør kontinuerlig omrøring i 1 time ved romtemperatur.
- Fjern DMSO-løsningen og legg den sammen med den tidligere innsamlede XTT-løsningen.
- Overfør 100 μL av prøven i triplikater i en 96-brønns plate på en plateleser og mål absorbansen ved en bølgelengde på 492 nm og en referansebølgelengde på 690 nm.
- Normaliser de resulterende absorbansverdiene til den våte vekten av hver prøve og utfør analyse ved hjelp av programvare.
- Analyse av genuttrykk
- RNA isolasjon
MERK: RNA-isolasjon utføres ved hjelp av et kommersielt sett (Materials tabell) i henhold til instruksjonene fra produsenten med små endringer.- Hakke den andre halvdelen av bruskvevet hentet fra osteokondralpluggen i små biter.
- Overfør dem til et rør som inneholder keramiske perler og 300 μL lysisbuffer (som inneholder 1% β-mercaptoetanol).
MERK: Prøvene kan fryses i flytende nitrogen til videre behandling. - Tin prøvene i 2 min og bruk det kommersielle lyseret for homogenisering av vevet. Påfør 6500 o/min for 20 s (homogeniseringstrinn) fire ganger med en 2 min kjølefase etter hver kjøring (ved 4 °C ved hjelp av den kommersielle lyserkjøleenheten) for å forstyrre vevet fullt ut.
- Tilsett 20 μL proteinsykke og 580 μL RNasefritt vann til hvert rør og inkuber dem ved 55 °C i 30 min.
- Sentrifuger prøvene i 3 min ved 10 000 x g og overfør supernatanten til et 1,5 ml rør.
- Tilsett 0,5 volumer av 90% etanol til hvert rør og bland.
- Overfør 700 μL av prøven til en RNA-bindingskolonne plassert i et 2 ml oppsamlingsrør og sentrifuge ved 8000 x g for 15 s.
- Kast gjennomstrømningen og gjenta sentrifugeringstrinnet for hele lysatet.
- Legg til 350 μL buffer RW1 i kolonnen, sentrifuge på 8000 x g for 15 s, og kast gjennomstrømningen.
- Bland 10 μL DNase lageroppløsning og 70 μL buffer-RDD. Tilsett løsningen til RNA rensemembranen og inkuber den ved romtemperatur i 15 min.
- Tilsett 350 μL buffer RW1 i kolonnen og sentrifuge ved 8000 x g for 15 s. Kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 500 μL buffer RPE og sentrifuge ved 8000 x g for 15 s. Kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 500 μL buffer RPE i RNA-rensekolonnen og sentrifuge ved 8000 x g i 2 min.
- Plasser kolonnen i et 1,5 ml oppsamlingsrør og tilsett 30 μL RNase-fritt vann. Sentrifuge ved 8000 x g i 1 min.
- Oppbevar den isolerte RNA ved -80 °C til cDNA-syntese.
- cDNA syntese
MERK: For å syntetisere komplementært DNA (cDNA) fra messenger RNA (mRNA) ble det brukt et kommersielt sett (Materials tabell). RNA fra bakteriofag MS2 ble lagt til for å stabilisere isolert RNA under cDNA syntese.- Tin og bland reagensene. Sammensetningen for en enkelt reaksjon er vist i tabell 1.
- Tilsett 16 μL RNA-prøve i volumet for én enkelt reaksjon (14 μL).
- Utfør cDNA-syntese i en termisk cycler ved hjelp av følgende parametere: 10 min ved 25 °C (primer annealing), 60 min ved 50 °C (DNA-syntese), 5 min ved 85 °C (denning) og 5 min ved 20 °C (kjølefase).
- Oppbevar cDNA ved -20 °C til kvantitativ polymerasekjedereaksjon i sanntid (RT-qPCR).
- RT-qPCR
MERK: For RT-qPCR av storfeprøver ble primere og prober utformet ved hjelp av kommersiell qPCR-programvare i sanntid (f.eks. IDT) for genene GAPDH (Glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase), COL2A1 (Kollagen type 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Kollagen type 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) og MMP-13 (Matrix Metalloproteinase-13). Storfe primere og doble slukkede sonder ble levert av IDT. Reagensene som brukes til en enkelt reaksjon for å evaluere effektiviteten og genuttrykket, vises i tabell 2.- Dispenser hovedblandingen av en enkelt reaksjon (9 μL) til hver brønn på en 96-brønns PCR-plate og tilsett 1 μL cDNA til hver reaksjon. Utfør tester for hver prøve i triplicates.
- Lukk PCR-platen med tetningsolje og sentrifuge ved 877 x g i 10 min ved 4 °C.
- Utfør RT-qPCR ved hjelp av en presisjons termisk cycler med følgende protokoll: 95 °C i 10 min, 45 sykluser forsterkning (95 °C i 10 s, glødende i 30 s, cDNA syntese) og 37 °C for 30 s.
MERK: Spesifikke glødetemperaturer kreves for hver primer. - Bruk GAPDH sammen med målgenene for å bekrefte effektiviteten.
- Bruk den medfølgende programvaren til å beregne effektiviteten til hvert gen.
- Normaliser syklusterskelverdiene (CT) til uttrykket for referansegenet GAPDH og bruk ΔΔCT-metoden for kvantifisering.
- RNA isolasjon
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontaktområdet og kontakttrykket må bekreftes ved hjelp av en trykkmålingsfilm (figur 1). Fysiologisk lastetilstand kan bekreftes ved å sammenligne med referanseavtrykk for definert kontakttrykk. Under testing overvåkes friksjonskoeffisienten hele tiden. Med et migrerende kontaktområde kan en lav friksjonskoeffisient opprettholdes i minst 1 time (figur 2). Ved hjelp av Safranin O farging den ekstracellulære matrisesammensetning og struktur kan bestemmes (Figur 3). Intensiteten av Safranin O farging er proporsjonal med proteoglykaninnholdet. Fast Green motvirker ikke-kollagen områder og gir en klar kontrast til Safranin O farging. Proteoglykaninnholdet varierer over leddoverflaten, men bør være ensartet gjennom vevsdelen i baselineprøver (figur 3A). Kontrollprøver nedsenket i testløsningen viser utvinning av GAGs, som kan motvirkes ved mekanisk lasting (figur 3B, 3C). Metabolsk aktivitet av storfe leddkondrocytter er uavhengig av høsting området, men viser en økning med mekanisk lasting sammenlignet med losset kontroller (Figur 4). Genuttrykksnivåene av bruskspesifikke gener (COL2A1, ACAN) øker med fysiologiske lasteforhold, mens katabolske gener (COL1A1 og MMP13) er oppregulert med stasjonært kontaktområde (figur 5).
| Volum (μl) | |
| Transkripsjon RT Reaksjoner Buffer 5x conc. | 6 |
| Protector RNase Hemmer 40U/μl | 0.75 |
| Deoksynukleotid Mix 10 mM hver | 3 |
| Tilfeldig Hexamer Primer 600 μM | 3 |
| Transkripsjon omvendt transkripsjon 20 U / μl | 0.75 |
| MS2 RNA (0,8 μg/μl) | 0.375 |
| Kjernefri destillert vann | 0.125 |
| Totalt volum | 14 |
Tabell 1: Reagenser for en enkelt reaksjon for cDNA-syntese.
| Volum (μl) | |
| FastStart Probe Master 2X | 5 |
| Hydrolyse probe 2,5 μM | 1 |
| Venstre PrimerGAPDH 5 μM | |
| Høyre Primer GAPDH 5 μM | |
| Kjernefri destillert vann | 3 |
| Total Master Mix | 9 |
Tabell 2: Reagenser for Master Mix for en enkelt PCR.
Figur 1: Pressur måling av det første kontaktområdet på metall-brusk grensesnitt før testing. På grunn av konveksiteten til metallsylinderen og leddflaten og dens elastiske egenskaper, er det første kontaktområdet elliptisk. Under glidende beveger dette første kontaktområdet seg med et slag på 2 mm, noe som resulterer i et større område som er utsatt for mekanisk belastning; skala bar = 2 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tidsforsvled friksjonskoeffisient (varighet 1 time) for syv prøver testet ved 8 mm/s glidehastighet og 1 N-belastning (2 MPa-kontakttrykk). Hver fargede linje representerer COF av en osteokondral sylinder. Den observerte variasjonen er innenfor grensene for biologiske prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Histologiske tverrsnitt av storfe osteokondrale prøver farget med Safranin-O og Fast Green. (A) Baseline prøver viser høyt GAG innhold i hele leddbrusk. (B) Kontrollprøve nedsenket i testløsning uten mekanisk lasting viser mindre Safranin-O farging i midtsonen, noe som tyder på en ekstraksjon av proteoglykaner. (C) Testede prøver viser høyere GAG-innhold sammenlignet med kontroller, noe som indikerer mekanisk stimulering; skala bar = 250 μm Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Metabolsk aktivitet av storfe leddkondrocytter etter tribologisk testing med forskjellige lastevariasjoner og kontroller. Den vannrette stiplede linjen representerer grunnlinjenivåer. Den ikke-parametriske Kruskal-Wallis testen ble utført for sammenligning mellom testgrupper etterfulgt av Dunns post hoc test i tilfelle betydning. *p < 0,05. Dette tallet er endret fra Stotter et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Genuttrykk av bruskspesifikke gener etter tribologisk testing med forskjellige lasteforhold og kontroller. COL2A1=kollagen type 2; ACAN = aggrekansk; COL1A1= kollagen type 1; MMP13= matrise metalloproteinase 13. Uttrykksnivåene ble normalisert til rengjøringsgenet GAPDH (glyseraldehyd 3-fosfatdehydrogenase). De vannrette stiplede linjene representerer nivåene for opprinneligelinjeuttrykk. Den ikke-parametriske Kruskal-Wallis testen ble utført for sammenligning mellom testgrupper etterfulgt av Dunns post hoc test i tilfelle betydning. *p < 0,05. Dette tallet er endret fra Stotter et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fokale metalliske implantater representerer en bergingsprosedyre for osteokondrale defekter, spesielt hos middelaldrende pasienter og etter mislykket primærbehandling. Selv om kliniske studier viste lovende kortsiktige resultater, er en observert komplikasjon skade på den motsatte, innfødte brusk10. Kadaver- og biomekaniske studier viser klare bevis for at riktig implantasjon med flat eller litt innfelt posisjonering opprettholder naturlig kontakttrykk19. Tribological eksperimenter gir en mulighet til å teste ulike brusk sammenkoblinger in vitro. Ved slike lasteforhold kan belastningsforhold, smøring, materialpar og varighet justeres etter ønske.
Storfebrusk er tilgjengelig i stor mengde på det lokale slakteriet. Cellulæriteten og sonestrukturen er svært lik de menneskelige lårbenskondylene20. Proteoglykaninnholdet er imidlertid stedsspesifikt, mens genuttrykksnivåene har vist seg å være ensartede over leddoverflaten. I denne protokollen ble osteokondrale plugger høstet fra vektlagerområdet. Brusktykkelse, kollagenarkitektur og resulterende tribological egenskaper viser regionale forskjeller over leddflaten16. Begrensningen ved å bruke osteokondralplugger i et uinnfinert lasteoppsett med et forstyrret kollagennettverk og endret væsketrykk sammenlignet med hele fellesmodeller må vurderes.
I de fleste triblogiske studier brukes PBS alene som testløsning for å generere mer robuste data. PBS er en bufferløsning med isotonisk osmolaritet og bidrar til å opprettholde en konstant pH under biologiske eksperimenter. Bruk av PBS med hyaluronsyre gir grensesmøring og redusert friksjon21. Sammenlignet med saltvann reduserer friksjonskoeffisienten og forbedrer væsketrykk sammenlignet med saltvann22. Friksjonskoeffisienten avhenger av ulike systemegenskaper, demonstrert av den klassiske Stribeck Curve. Stribeck-kurven relaterer friksjonskoeffisienten og viskositeten, hastigheten og belastningen og presenterer de grunnleggende smøreregimene: grense, blandet og hydrodynamisk smøring. Grensesmøring kan oppnås med PBS alene som smørevæske, men lasteparametre må justeres tilsvarende. COF levert fra testene er gjennomsnittlige verdier over slaget. Dermed kan det antas at forskjellige smøreforhold oppstår i løpet av syklusen. Under stillstand ved reverseringsposisjon kan grenseforholdene være rådende, mens blandet smøring kan være dominerende under glidende. Basert på absolutt varighet i glidesyklusen, ville sistnevnte ha hatt mer innflytelse på den gjennomsnittlige COF-verdien.
For å undersøke fysiologiske forhold som oppstår i leddene under daglige aktiviteter, kan lasteforhold justeres tilsvarende i tribometerprogramvaren. Trykkfølsomme målinger bør brukes til å bekrefte ønsket kontakttrykk. Rapporterte femorotibial kontakttrykk varierer mellom 1 MPa under stående og opp til 10 MPa under utforkjøring23. Med en fokal resurfacing, implantattrykk er bare litt forhøyet sammenlignet med friske ledd24. Rapporterte relative glidehastigheter i gangartsyklusen rapporteres opptil 100 mm/s med store variasjoner i de ulike fasene. Dette betyr at relative fellesbevegelser overskrider hastighetene som kan brukes i dette tribological oppsettet. For å etterligne naturlige kinematiske forhold og kontakttrykk i friske kneledd varierer belastningsforholdene fra 1 til 10 MPa kontakttrykk og 5 til 100 mm/s glidehastighet. Men mens høye belastninger kan brukes i dette eksperimentelle oppsettet, er utvalget av glidehastigheter begrenset. Patologiske lasteforhold, både overbelastning og utilstrekkelige belastninger, kan også simuleres. Lave glidehastigheter eller statisk lasting tilsvarer immobilisering, mens høyere belastninger representerer ikke-fysiologisk mekanisk stimulering.
Som enzymatisk fordøyelse kan påvirke uttrykket av brusk-spesifikke gener, er en ikke-zymatisk vev homogenisering beskrevet i denne protokollen. Under cDNA-syntese, i tillegg til instruksjonene, tilsettes RNA fra bakteriofage MS2 for stabiliseringsformål. Genuttrykksnivåer, men ikke proteiner, ble analysert for å oppdage tidlige endringer i biosyntetisk aktivitet av leddkondrocytter. I tillegg til histologiske seksjoner og metabolsk aktivitet gir disse analysene omfattende informasjon om effekten av mekanisk lasting på leddbrusk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. og den provinsielle regjeringen i Niederösterreich gjennom Life Science Calls (Prosjekt-ID: LSC15-019) og av den østerrikske COMET Program (Prosjekt K2 XTribology, Grant No. 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
