Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61364
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Summary

Veel bacteriën gebruiken flagella-gedreven beweeglijkheid om door hun omgeving te navigeren en gunstige omgevingen te koloniseren, zowel individueel als als collectief. Hier wordt het gebruik aangetoond van drie gevestigde methoden die motiliteit als selectietool gebruiken om componenten / paden te identificeren die bijdragen aan zwem- en zwermmotiliteit.

Abstract

Beweeglijkheid is cruciaal voor het overleven en succes van veel bacteriesoorten. Er bestaan veel methoden om de beweeglijkheid te benutten om signaleringsroutes te begrijpen, om de functie en assemblage van flagellar-onderdelen op te helderen en om bewegingspatronen te onderzoeken en te begrijpen. Hier demonstreren we een combinatie van drie van deze methodieken. Motiliteit in zachte agar is de oudste en biedt een sterke selectie voor het isoleren van gain-of-function suppressor mutaties in motiliteit-aangetaste stammen, waar motiliteit wordt hersteld door een tweede mutatie. De cel-tethering techniek, eerst gebruikt om de roterende aard van de flagellar motor aan te tonen, kan worden gebruikt om de impact van signaleringseffectoren op de motorsnelheid en zijn vermogen om van draairichting te veranderen te beoordelen. De "grensovergang" test is recenter, waar zwemmende bacteriën kunnen worden klaargekmeld om over te schakelen naar collectief bewegen als een zwerm. In combinatie vertegenwoordigen deze protocollen een systematische en krachtige benadering van het identificeren van componenten van de motiliteitsmachines en het karakteriseren van hun rol in verschillende facetten van zwemmen en zwermen. Ze kunnen gemakkelijk worden aangepast om de beweeglijkheid bij andere bacteriesoorten te bestuderen.

Introduction

Bacteriën gebruiken veel aanhangsels voor beweging en verspreiding in hun ecologischeniches 1. Flagella-gedreven beweeglijkheid is de snelste van deze, bevordert de kolonisatie van gunstige plaatsen als reactie op omgevingssignalen en draagt aanzienlijk bij aan het pathogene vermogen van sommige soorten2,3. Flagellated bacteriën kunnen individueel zwemmen in bulk vloeistof, of zwerm als een collectief over een semi-solide oppervlak4. Extracellulaire flagella hechten zich aan en worden aangedreven door roterende motoren ingebed in het membraan, die de kracht van ionengradiënten benutten om koppel te genereren dat rotatie1,2,4,5,6,7,8veroorzaakt. In E. coli, waarvan de motoren op een constant koppel9draaien, kan het motorvermogen worden gecategoriseerd in termen van rotatiesnelheid en schakelen van de rotor tussen de richting tegen de klok in (CCW) en de richting met de klok mee (CW). CCW-rotatie bevordert de vorming van een coherente flagellarbundel die de cel naar voren stuwt (lopen), terwijl een voorbijgaande schakelaar in rotatierichting (CW) ervoor zorgt dat de bundel gedeeltelijk of volledig wordt gedemonteerd10, en de cel zijn zwemrichting heroriënteert (tuimelen). E. coli loopt meestal een seconde en tuimelt voor een tiende van een seconde. De schakelfrequentie van de rotor of "tumble bias" wordt geregeld door het chemotaxis-signaleringssysteem, waarbij transmembrane chemoreceptoren externe chemische signalen detecteren en via fosforelay naar de flagellaire motor overbrengen om de runs uit te breiden als reactie op attractanten, of ze onderdrukken als reactie op giftige chemicaliën11,12. Zwemmotiliteit wordt uitgevoerd in 0,3% zachte agar.

Tijdens het zwermen navigeren bacteriën op een semi-vast oppervlak als een dicht collectief, waar groepen bacteriën in een continue wervelende beweging2,13,14,15stromen. E. coli zwermen vertonen veranderde chemosensorische fysiologie (lagere tumble bias), hogere snelheden en een hogere tolerantie voor antimicrobiële stoffen boven cellen zwemmen in bulk vloeistof16,17. Zwermers variëren in hun inzet van een overvloed aan strategieën die beweging helpen, waaronder oppervlakteactieve productie, hyperflagellatie en celverlenging2. Zwermen biedt bacteriën een concurrentievoordeel in zowel ecologische als klinische omgevingen18,19,20. Er zijn twee categorieën zwermbacteriën: gematigde zwermen, die alleen kunnen zwermen op media gestold met 0,5-0,8% agar, en robuuste zwermen, die over hogere agarconcentraties kunnen navigeren21.

Er bestaan verschillende testtesten om de zwemmotiliteit en de regelgeving ervan te ondervragen. Wanneer aangetast door mutaties of omgevingsomstandigheden, biedt de beweeglijkheid zelf een sterke selectie voor het identificeren van gain-of-function suppressor mutaties. Deze suppressors kunnen echte revertanten van de oorspronkelijke mutatie zijn, of pseudo-revertanten, waarbij een tweede mutatie de functionaliteit herstelt. Dergelijke mutanten kunnen worden geïdentificeerd door hele genoomsequencing (WGS). Een alternatief voor onbevooroordeelde suppressorselectie is een bevooroordeelde gerichte mutagenesestrategie (bijv. PCR mutagenese). Deze methoden werpen vaak licht op de functie of milieuregelgeving van het motiliteitsapparaat. Als het doel is om de motorische functie te bestuderen, dan is het herstel van wild-type motiliteit zoals gemeten in zachte agar mogelijk niet noodzakelijkerwijs wijzen op herstel van wild-type motor output. De cel-tethering assay, waarbij cellen door een enkel flagellum aan een glasoppervlak worden bevestigd en de rotatie van het cellichaam vervolgens wordt gecontroleerd, kan de eerste keuzetest zijn voor het beoordelen van motorisch gedrag. Hoewel er nu meer geavanceerde methodologieën beschikbaar zijn om motorische eigenschappen te monitoren , beperken de vereiste opstelling en toepassing van softwarepakketten voor bewegingsanalyse het wijdverbreide gebruik ervan22,23,24,25. De cel-tethering assay vereist alleen dat de flagella wordt geschoren, waardoor de korte filamenten aan een glazen dia kunnen worden gehecht, gevolgd door het filmen van de rotatie van het cellichaam. Hoewel de geregistreerde motorische snelheden laag zijn in deze test vanwege de hoge belasting die het cellichaam uitoefent op het flagellum, heeft deze test niettemin bijgedragen aan waardevolle inzichten in chemotactische reacties26,27,28,29, en blijft een geldig onderzoeksinstrument zoals hieronder besproken.

Zwermmotiliteit stelt onderzoekers voor een andere uitdaging. Selectie van gain-of-function suppressors werkt alleen in zwermen die overvloedige oppervlakteactieve stoffen produceren en gemakkelijkzwermen 13. Oppervlakteactieve niet-producenten zoals E. coli zijn kieskeurig met betrekking tot de keuze van agar, mediasamenstelling en vochtigheid van het milieu2,13,14,21. Zodra zwermcondities zijn vastgesteld, is de grensovergangstest17 een nuttige methodologie om het vermogen van een zwerm te ondervragen om door nieuwe / zware omstandigheden te navigeren. Hoewel de onderstaande protocollen betrekking hebben op E. coli, kunnen ze gemakkelijk worden aangepast voor toepassing bij andere soorten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolatie van suppressor mutanten in motiliteit-deficiënte stammen

OPMERKING: Gebruik deze methode als een brede 'catch-all' om de algemene aard van het motiliteitsdefect te identificeren.

  1. Zacht-agar plaatvoorbereiding
    OPMERKING: Soft-agar, ook wel motiliteit- of zwem-agar genoemd, is een laag percentage agar (~0,2-0,35% w/v), lang gebruikt om chemotaxis31,32te meten.
    1. Voeg 3 g bacto-agar (0,3% w/v) en 20 g LB toe aan een maatkolf met ronde bodem van 2 L. Voeg 1 L ddH2O (dubbel gedestilleerd water) toe aan de kolf en meng de suspensie gelijkmatig met behulp van een roerstaaf en een magneetroerplaat.
    2. Autoclaaf gedurende 20 min bij 121 °C.
    3. Laat afkoelen met zachte agitatie met behulp van de staaf/plaat zoals hierboven. Wanneer de temperatuur ongeveer 50 °C bereikt, giet dan 25 ml in steriele petrischalen (100 mm x 15 mm) en laat de gesmolten agar ten minste 1 uur op zijn plaats zetten met deksel, voor gebruik binnen 16 uur.
  2. Kweekvoorbereiding, inenting en isolatie van suppressormutanten
    OPMERKING: E. coli ingeënt in het centrum van voedingsrijke media gestold met zachte agar consumeren voedingsstoffen lokaal, waardoor een nutriëntengradiënt ontstaat die ze volgen. Als ze naar buiten bewegen, verschijnen gedefinieerde 'ringen' (figuur 1A), die gerelateerd zijn aan specifieke chemoattractanten waarop de bacteriën reageren. Defecten in het chemotaxis-systeem of structurele componenten van de flagellamotor kunnen de prestaties in deze test in gevaar brengen. Vaak ontstaan mutanten met een motiliteitsvoordeel tijdens de screening en kunnen ze worden gezien vanaf enkele of meerdere punten langs de rand van de ring, van waaruit ze 'uitfakkelen' (figuur 1C). Men zal merken dat de buitenste rand van het zwemfront gemakkelijk contrasteert met de ongekoloniseerde maagdelijke zachte agar.
    1. Kweek 's nachts culturen van de gewenste motiliteitsdeficiënte stam in 5 ml Lennox Bouillon (LB; 10 g/L tryptone, 5 g/L gistextract en 5 g/L NaCl, Tafel van Materialen) bij 30 °C met horizontaal schudden (220 r.p.m.). De volgende dag, subcultuur (1:100 verdunning) in verse LB, groeiend onder dezelfde omstandigheden tot exponentiële fase (OD600 van 0,6).
    2. Ent 6 μL van de cultuur in het midden van een zachtzwamplaat (1.1) met behulp van een pipet en duw de geladen steriele punt in de agar om de inhoud voorzichtig te verdrijven. Breng over naar 30 °C en incubeer (figuur 1B), totdat de beweeglijkheid "flares" zichtbaar is, afkomstig van het inentingspunt of de periferie van de motiliteitsringen, meestal in 24-36 uur (figuur 1C).
      OPMERKING: Bij motiliteitstesten moet een wilde stam naast de mutante isolaten worden ingeënt ter vergelijking. Deze wilde stam toont de karakteristieke concentrische chemotactische ringen(figuur 1A)en vult de plaat binnen 8-10 uur.
    3. Gebruik een steriele draadlus om de cellen uit het 'flare'-gebied te tillen en streep om enkele kolonies te zuiveren op een LB harde agarplaat (LB bereid zoals hierboven, gestold met 15 g/L bacto-agar).
    4. Pluk enkele kolonies uit de streepplaat met behulp van een steriele draadlus en zuiver opnieuw door strepen voor enkele kolonies om isolatie van een 'zuiver' kolonieisolaat te garanderen.
  3. Bevestiging en karakterisering van suppressor mutanten
    1. Bevestig dat de geïsoleerde suppressor mutant(en) de beweeglijkheid hebben hersteld. Bereid zachte agarplaten (1.1) en culturen voor op soorten van belang (zoals in 1.2.1), met inbegrip van wilde-type en de beginnende 'motility-deficiënte' stam ter vergelijking.
    2. Ent de platen (zoals in 1.2.2) en incubeer bij 30 °C gedurende 8-10 uur.
    3. Noteer de diameter van de buitenste ring (rand van de cirkel) en vergelijk om vast te stellen welke van de isolaten de beweeglijkheid aanzienlijk hebben hersteld.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om platen te fotograferen tijdens het verloop van het experiment. Gebruik voor het beste resultaat een "emmer licht" apparaat30, waarbij een digitale camera boven een lichtbron is gemonteerd voor een betere verlichting om de diameter van de zwemkolonie te meten en te onderscheiden van niet-colonized agar.
    4. Onderworpen geverifieerde isolaten naar WGS indien nodig, waardoor voldoende 'sequentiedekking' mogelijk is om de mutaties die de wild-type functie herstelden positief te identificeren.

2. Kwantificeren van flagella motorisch gedrag via celgebonden

OPMERKING: Gebruik deze methode wanneer normaal loopgedrag (chemotaxis) in gevaar blijkt te zijn.

  1. Cultuurvoorbereiding en flagella scheren
    1. Bereid een exponentiële fasecultuur voor van de interessestam zoals beschreven in stap 1.2.1.
    2. Pellet 10 ml cellen door centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 3 minuten voordat u deze in 10 ml met filter gesteriliseerde motiliteitsbuffer (MB; 10 mM kaliumfosfaatbuffer [0,0935 M K2HPO 4 , 0,0065 M KH 2 PO 4 , pH 7,0], 0,1 m MH [0,0935 M K 2 HPO4,0,0065 M KH2PO4, pH 7,0]
      OPMERKING: MB ondersteunt beweeglijkheid, maar ondersteunt geen bacteriële groei
    3. Herhaal stap 2.1.2 nog twee keer voordat u de uiteindelijke pellet in 1 ml MB opnieuw opgeeft.
    4. Breng de celsuspensie over in een spuit van 1 ml en bevestig een 23G-naald aan het uiteinde. Monteer een identiek spuit-/naaldapparaat en bevestig de twee aan elkaar via 6 inch polyethyleen buizen (binnendiameter van 0,58 mm) strak omhuld over elke naaldpunt.
    5. Scheer de flagella (ze zijn breekbaar en breken gemakkelijk) door de celsuspensie voorzichtig 50x heen en weer van de ene spuit naar de andere te brengen, met 1 minuut pauzes tussen elke 10 passen.
    6. Centrifugeer de geschoren cellen gedurende 3 minuten op 2.000 x g en resuspend in een eindvolume van 500 μL MB.
  2. Diavoorbereiding en celgebonden
    1. Bereid een celfixatiekamer voor door een afdeklip van 18 mm x 18 mm over een glazen microscoopschuif van 3 inch x 1 inch x 1 mm te stapelen, gescheiden door dubbelzijdige tape (afbeelding S1).
    2. Spoel de kamer door met 0,01% (m/v) polylysineoplossing door op de bovenkant van de kamer aan te brengen. Kantel de onderrand (de afdeklip vlak met de microscoopschuif) op een taakwisser (tissuepapier) om de oplossing door de kamer te trekken (afbeelding S1). Incubeer vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur.
    3. Was de kamer driemaal met 40 μL MB met behulp van zoals beschreven in stap 2.2.2
    4. Voeg 40 μL van de geschoren celsuspensie (hierboven voorbereid) toe aan de bovenkant van de kamer en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om cellen aan de afdeklip te laten hechten.
    5. Spoel de kamer voorzichtig door met 40 μL MB zoals in 2.2.3 om niet-vastgemaakte cellen te verwijderen.
  3. Celrotatieregistratie en kwantificering
    1. Breng de microscoopschuif geladen met vastgebonden cellen over naar het microscoopstadium.
    2. Scan met behulp van fasecontrastmicroscopie en een 100x-doelstelling de populatie op cellen die op hun plaats zijn bevestigd en roteren op een enkele as, d.w.z. vloeiende rotaties op een vast punt in plaats van te presenteren onder een hoek waarin de cel in en uit focus beweegt (Video 1).
    3. Gebruik een commerciële microscoop en bijbehorende camera. Open de bijbehorende software, zorg ervoor dat cellen van belang scherp zijn en klik op video-acquisitie om de celrotatie gedurende één minuut op te nemen (met 10 frames per seconde of hoger).
    4. Kwantificeer bij het afspelen van video het aantal volledige rotaties per minuut en het aantal keren dat de cel van richting verandert (schakelfrequentie).
      OPMERKING: Rotatiesnelheden en schakelfrequentie kunnen te snel zijn om met het oog te meten, dus het wordt aanbevolen om videosoftware te gebruiken die langzame / fijne weergave biedt, of een geautomatiseerd softwaresysteem gebruikt om rotatiepatronen te kwantificeren33. Een alternatief zou zijn om de viscositeit van de MB te verhogen met behulp van methylcellulose (of een soortgelijk middel) om de rotatie van snellere bacteriën te vertragen en op te lossen of te compenseren wanneer camera's met lage framerates in gebruik zijn.
    5. Herhaal stap 2.3.2 met biologische replica's om een weergave van de populatie van belang samen te stellen.

3. Voorbereiding van zwermen in een grensoverschrijdingstest

OPMERKING: Gebruik deze methode om de impact van een mutatie of aandoening op de beweeglijkheid van de groep te beoordelen. Zwerm-agar verwijst naar agar waar het percentage meestal hoger is dan dat van soft-agar. In zachte agar (0,3 %) zwemmen cellen individueel in de agar. In zwermzwam (0,5% en hoger) bewegen cellen als een groep op het oppervlak. Hoewel zwermplaten hier moeten worden gebruikt, hebben zwemplaten een langere houdbaarheid en kunnen ze meerdere dagen worden gebruikt. Onze persoonlijke voorkeur is om te gebruiken in 1-2 dagen.

  1. Voorbereiding van zwermzwam
    1. Voeg 5 g Eiken agar (0,5% w/v) en 20 g LB toe aan een ronde bodemkolf van 2 L. Voeg 1 L ddH2O toe aan de kolf en meng de suspensie gelijkmatig met behulp van een roerstaaf en een magneetroerplaat.
    2. Autoclaaf gedurende 20 min bij 121 °C.
    3. Laat afkoelen met zachte agitatie om luchtbellen te voorkomen met behulp van de staaf / plaat zoals hierboven. Voeg bij ongeveer 50 °C met filtersterilisatie gesteriliseerde glucose toe voor een eindconcentratie van 0,5 %.
    4. Giet 25 ml in steriele petrischalen (100 mm x 15 mm) en laat het op kamertemperatuur gedurende ten minste 14 uur en niet meer dan 20 uur instellen. Niet bewaren voor toekomstig gebruik.
  2. Inenting en incubatie van zwermplaten
    1. Ent 6 μL van een mid-exponentiële cultuur (bereid zoals in 1.2) door bovenop de agar te spotten.
    2. Laat het deksel 5-10 minuten staan en vervang wanneer het entmateriaal in het agaroppervlak is opgedroogd.
    3. Incubeer bij 30 °C gedurende 8 uur. Vermijd de verleiding om de zwermvoortgang te inspecteren door het deksel te verwijderen, omdat dit zal bijdragen aan het drogen van de agar en zwermen zal verminderen.
      OPMERKING: De incubatietijd kan variëren afhankelijk van het fenotype van de stam. Sommige geïsoleerde mutaties kunnen het zwermvermogen belemmeren en vereisen een verminderd percentage agar of een langere incubatieperiode.
  3. Voorbereiding van grensoverschrijdende testplaten
    OPMERKING: Deze test maakt gebruik van een gemodificeerde petrischaal, waarbij een plastic scheiding (rand) twee kamers creëert in plaats van één (figuur 2A). Elke kamer kan onafhankelijk van de andere worden voorbereid en biedt verschillende voorwaarden voor zwermen, voordat de twee worden 'verbonden'. Afhankelijk van het experimentele ontwerp kan de eerste kamer (links aangeduid) worden bereid met zwemagar (0,3% w/v) of zwermagar (0,5% w/v) van waaruit de bacteriën over de grens kunnen migreren naar de rechterkamer met zwermagar +/- elk vereist supplement of uitdaging (bijv. antibiotica). Migratie op een van beide agars wordt meestal gemeten / vergeleken door de breedste diameter van bacteriële kolonisatie (van rand tot rand) vanaf het oorspronkelijke punt van inenting vast te houden.
    1. Bereid zwem agar voor zoals beschreven in 1.1 indien nodig.
    2. Bereid zwermzwam voor zoals beschreven in 3.1.
    3. Giet ~30 ml zwermzwam (eventueel met de gewenste suppletie) in de rechterkamer van een petrischaal met twee compartimenten (100 mm x 15 mm), tot het punt waar het waterpas staat met de plastic scheidingswand tussen de kamers, maar niet naar links overloopt (Afbeelding 2B).
    4. Nadat de agar is uitgehard, vult u de linkerkamer met ~30 ml zwem- of zwermagar, opnieuw tot het contactpunt met de plastic scheiding (figuur 2C). Voordat de agar wordt ingesteld, gebruikt u een steriele pipetpunt om de agar voorzichtig over de rand te slepen om de twee zijden te verbinden met een ~ 1 mm hoge agarbrug die de hele lengte van de scheiding overspant (Afbeelding 2D).
    5. Laat de plaat drogen bij kamertemperatuur (3.1).
      OPMERKING: Een alternatieve methode voor het maken van een brug is om de linkerkameragar te laten drogen en vervolgens langzaam ~ 100 μL gesmolten zwermzwam langs de plastic verdeler te pipetten om de twee kamers te overbruggen (3.4). Ent de platen op de linkerkamer zoals hierboven beschreven voor zwemmen (1.2.2) of zwerm (3.2) agar, voordat u gedurende 12-16 uur op 30 °C broedt, of totdat zwermen voldoende vooruitgang hebben geboekt boven de rechterkamer om vergelijkingen tussen interessestammen mogelijk te maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De isolatie van pseudo-revertanten in een E. coli stam waarvan de beweeglijkheid wordt aangetast door hoge niveaus van het signaalmolecuul c-di-GMP, werd gedetailleerd beschreven in recent werk van ons lab34. Deze stam (JP1442) had twee mutaties: ΔyhjH en ΔycgR. YhjH is het meest actieve fosfodiësterase dat c-di-GMP in E. coliafbreekt. Afwezigheid van YhjH leidt tot verhoogde c-di-GMP niveaus en remming van de beweeglijkheid. YcgR is een c-di-GMP effector. In complex met c-di-GMP bindt YcgR zich aan de flagellarrotor om eerst ccw-motorrotatie te induceren en vervolgens de motorsnelheid te verlagen. Celgebonden en kralentesten toonden aan dat motorisch gedrag weer normaal werd in de dubbele mutant, maar de beweeglijkheid in zachte agar niet34. Dus hebben we stap 1 van het protocol ingezet om pseudo-revertante flares in de dubbele mutant te isoleren (Figuur 1C). De meeste mutaties die door WGS (HiSeq 4000 platform, PE 2 x 150 setup34) in kaart zijn gebracht naar rssB, welke codes voor een respons regulator/adapter eiwit dat normaal gesproken ClpXP protease naar doel σS voor afbraak34. Een van deze revertanten, die een beweeglijkheid vertoonde die dicht bij het wildtype lag (AW405, vergelijk figuur 1A,D), werd gebruikt om representatieve resultaten te genereren voor stap 2 en 3 van de protocolsectie, waarbij zowel de dubbelgemuteerde ouder (figuur 1B) als de isogene wilde stam (figuur 1A) werden gebruikt.

Voor stap 2 van de protocolsectie werden video-opnamen geanalyseerd om rotaties per minuut te berekenen (elke 360° volledige rotatie) en CWBias (de fractie van tijdmotoren roteren in een CW-richting of tumble bias). De ΔyhjH vertoonde minder rotaties per minuut en een lagere CW bias in vergelijking met het wild-type, zoals verwacht (Figuur 3). Zowel de ΔyhjH ΔycgR dubbelmutant als de suppressor vertoonden motorisch gedrag vergelijkbaar met wild-type, observaties ondersteund door een eerdere analyse met behulp van de hogere resolutie 'kraal' assay beschreven in de inleiding hierboven in eerder werk34.

Voor stap 3 van de protocolsectie werd de grensoverschrijdende assay (figuur 2) gebruikt om de capaciteiten van het wildtype en het suppressorisolaat te vergelijken, eerst om te zwermen en vervolgens om over de grens te bewegen en zwerm op agar aangevuld met kanamycine. De resultaten tonen aan dat beide stammen op een vergelijkbaar tijdstip de grens bereikten (gegevens niet weergegeven) wat wijst op vergelijkbare zwermsnelheden vanaf een identiek inentingspunt. De kruising van de zwerm naar de rechterkamer (antibioticum) was echter marginaal, maar consistent groter voor het wilde type dan de suppressor bij 20 μg/ml kanamycine (figuur 4). Het verschil tussen de twee stammen was meer uitgesproken bij 40 μg/ml kanamycine. Samen suggereren deze gegevens dat de mutaties in rssB die de beweeglijkheid op zachte agarplaten herstelden (figuur 1D), een negatieve invloed hebben op de antibioticaresistentie van de suppressorstam tijdens het zwermen (figuur 4).

Figure 1
Figuur 1: Soft-agar motility assays en opkomst van suppressor flares.
De platen bevatten LB gestold met 0,3 % w/v agar. E. coli stammen werden geïnensuleerd in het midden van elke plaat en geïncubeerd bij 30°C gedurende 8 uur, met uitzondering van C, die werd geïncubeerd gedurende 16 uur. (A) Wild-type E. coli (AW405). (B) Motility-deficiënte variant ∆yhjH ∆ycgR (JP1442). (C) Zoals in B, behalve langere incubatietijden. Pijlen wijzen op sneller bewegende 'fakkels' die opduiken bij de perifere ring van de uitdijende zwemkolonie. (D) Een suppressor geïsoleerd van een flare in C. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schematisch voor het instellen van een grensdoorlaatplaattest.
(A) Giet ~30 ml zwerm agar (met gewenst antibioticum) in de rechterkamer van een verdeelde petrischaal tot het niveau met de plastic verdeler en laat het met gesloten deksel. (B) Vul de linkerkamer met ~30 ml zwem- of zwermzwam tot het contactpunt met de bovenkant van de kunststof scheidingswand. (C) Gebruik een steriele pipetpunt om de gesmolten zwermzwam voorzichtig over de rand te slepen, waardoor de twee zijden met een ~1 mm hoge agarbrug worden verbonden en met gesloten deksel kunnen worden ingesteld. (D) Laat de plaat 's nachts verder drogen bij kamertemperatuur voordat u de linkerkamer inent met de gewenste stam en broedt bij 30 °C. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Motorische eigenschappen van verschillende stammen zoals gemeten door de cel-tethering techniek.
Wild-type (AW405), ∆yhjH (VN133), ∆ycgR ∆yhjH (JP1442), en zijn suppressor (JP1836) werden gekweekt in LB bij 30 °C tot mid-exponentiële fase voorafgaand aan tethering. (A) Rotaties per minuut (voltooid 360° omwentelingen) en (B) CWbias (fractie van de tijdmotoren draaien in een CW-richting). Standaarddeviatie van het gemiddelde (±). 20 vastgebonden cellen werden gedurende 60 seconden in elke stam waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Grensoverschrijdende assays.
Mid-exponentiële faseculturen van wild-type E. coli (AW405) en de suppressor mutant (JP1836) werden geïnensuleerd op de aangegeven positie (*) in het linkercompartiment van de verdeelde plaat met zwermmedia, en geïncubeerd bij 30 °C. Ze bereikten de grens op vergelijkbare tijdstippen. De platen werden nog eens 6 uur geïncubeerd, waarbij de zwerm overstak naar de rechterkamer, waarin de media werden aangevuld met kanamycine (Kan; getallen geven μg/ml aan). Platen zijn representatief voor drie biologische replica's die elk in drievoud worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Voorbereiding van een kamerschuif voor celgebonden. (A) Leg twee stukken dubbelzijdige tape neer voordat u (B) met een scheermesje het overtollige wegknipt. (C) Verwijder de bovenste laag om de lijm bloot te leggen voordat (D) een afdeklip aanbrengt en deze voorzichtig in positie drukt (aangegeven door [ ), zodat alle lucht uit de interface tussen de afdeklip en de tape eronder wordt geduwd. (E) Belastingsmonster (hier weergegeven met DNA-ladingskleurstof [30% v/v glycerol, 0,25% w/v bromophenolblauw en 0,25% w/v xyleencyaanol] toegevoegd aan de visualisatie) in de bovenkant van het gecreëerde kanaal (pijl) terwijl (F) hengelt op schoon, weefseltaakveeg om de oplossing door de kamer te trekken terwijl het weefsel de vloeistof (pijl) in het kanaal absorbeert en trekt. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.

Video 1: Rotatie van vastgebonden E. coli cellen. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Een actieve E. coli zwerm gefilmd onder 60x vergroting, die zijn karakteristieke wervelende beweging achter de rand van het bewegende front demonstreert. Klik hier om deze video te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De isolatie en karakterisering van suppressormutaties hebben met succes bijgedragen tot het identificeren van belangrijke componenten van het chemotaxis-systeem35,36,37, evenals de motormachines zelf38,39,40. Tijdens het gebruik van Protocol 1 is het belangrijk om meerdere onafhankelijke replica's op te nemen om de isolatie van een groot spectrum van mogelijke mutaties te garanderen die het verlies van beweeglijkheid kunnen compenseren. Het verhogen van het aantal bacteriën door de cultuur in een lijn te strepen in plaats van een plek, kan de kans op het genereren van suppressoren verbeteren41. Isolatie van dezelfde mutatie (zoals bepaald door DNA-sequencing) verhoogt meerdere keren het vertrouwen in de authenticiteit ervan. WGS zal steevast de aanwezigheid van andere mutaties in het genoom onthullen. Het is daarom belangrijk om de resultaten te verifiëren door (waar mogelijk) de geïdentificeerde mutatie terug te brengen naar de oorspronkelijke motiliteitsdeficiënte achtergrond. De suppressor mutant benadering is geworteld in het herstellen van de functie door middel van een secundaire mutatie, dus een beperking van deze methode is dat als een kritisch structureel gen wordt verwijderd, d.w.z. een gen dat de hele route of structuur ondersteunt, er mogelijk geen ruimte is voor compensatie. Ondanks het feit dat het een oude methode is, toont ons recente werk34 aan dat het nog steeds nut heeft bij het ophelderen van nieuwe paden die bijdragen aan bacteriële beweeglijkheid.

Voor de kwantificering van de motorische output blijft de cel-tethering-benadering een universeel toegankelijk hulpmiddel waarvoor alleen een microscoop met een camerabevestiging nodig is. Celgebonden is al gebruikt in een divers aantal bacteriesoorten, waaronder Salmonella42, Pseudomonas43, Streptococcus44en Rhodobacter33. Het succes van het protocol is grotendeels afhankelijk van het goed scheren en vasthechten van cellen. Te agressief scheren of het weglaten van de pauze tussen scharen (2.1.5) heeft de neiging inconsistente of onvolledige afschuiving van filamenten te bevorderen, wat resulteert in niet-beweeglijke cellen of cellen die op een scheve as zijn vastgebonden. De blijvende relevantie van dit protocol blijft bestaan, ondanks de goedkeuring van de kraaltest met een hogere resolutie door veel onderzoeksgroepen (waaronder de onze). De primaire beperking van de kraaltest komt voort uit de noodzaak dat de kraal zich hecht aan de gloeidraad van de bacteriën van belang. Deze techniek heeft veel geprofiteerd van studies bij E. coli die een 'kleverig' flagellin allel identificeerden, wat de hechtingvergemakkelijkt 45. De kleverige variant is ook superieur in de cel-tethering assay. Een dergelijke variant is nog niet beschikbaar voor de meerderheid van de flagellated bacteriën. De situatie is verder gecompliceerd met sommige organismen die veelvoudige flagellinproteïnen46bezitten, en in het geval van Vibrio sp., die ook een vliezenschede47bezit . Celversteiging kan ook worden uitgevoerd met behulp van een soortspecifiek antivlagellin-antilichaam of een antilichaam tegen een ontworpen epitooptag.

Hoewel bacteriën onmiddellijk bij introductie in een vloeibaar medium kunnen zwemmen, geldt dit niet voor zwermen, waar cellen eerst in een zwermtoestand moeten worden geprimed. Oppervlaktecontact activeert een fysiologische verandering die nodig is voor cellen om zwermen48,49,50,51te initiëren, wat resulteert in een vertragingsfase en een opbouw van hoge celdichtheid. Fysiologische veranderingen omvatten de remodellering van het chemotaxis-systeem in E. coli16, en aanpassingen zoals celverlenging en/of hyperflagellatie voor andere bacteriën13,14,21. Gezien de fysiologische veranderingen die nodig zijn om zwermen te initiëren, slaan we een waarschuwing over studies die hebben geprobeerd bepaalde facetten van zwermen na te bootsen - zoals hoge dichtheid of verhoogde cellengte - simpelweg door planktonische celculturen te concentreren om de dichtheid te verhogen en / of celverlenging op te wekken door het gebruik van antibiotica die celdelingremmen 52,53. Als we celverlenging als marker gebruiken, waarschuwen we ook dat in vergelijking met planktonische cellen, er slechts een marginale toename is van de gemiddelde lengte van zwermcellen in Salmonella of E. coli54. Zwermtesten zijn moeilijker vast te stellen dan zwemtesten. Variabelen zijn onder meer de commerciële bron van de agar die wordt gebruikt om de media te stollen (de speciale Eiken-agar is essentieel voor zwermen in E. coli, terwijl de meer standaard Difco-agar zwermen voor alle andere bacteriën ondersteunt), gebruik van rijke versus minimale media(E. coli en Salmonella vereisen glucosesuppletie) en het meest kritisch omgevingsvochtigheid2,13,14,21. Hiervan kan het handhaven van een optimale luchtvochtigheid het meest frustrerend zijn. [Morales-Soto en collega's55hebben aangetoond dat ze uitstekend, methodisch en geoptimaliseerd zijn voor zwermen in een organisme naar keuze (Pseudomonas aeruginosa). Zwermmedia moeten voldoende vochtig zijn om zwermen te bevorderen, maar niet zo vochtig dat passieve verspreiding/glijden mogelijk is, wat gemakkelijk kan worden verward met actieve zwermen56. Het is daarom van cruciaal belang dat zwermen onder een microscoop worden gecontroleerd om de verschillende bewegingspatronen te bevestigen die verband houden met deze collectieve beweeglijkheid (Video 2). Temperatuur is ook een belangrijke overweging voor het optimaliseren van de zwermtest. Hogere temperaturen, bijvoorbeeld 37 °C, drogen de platen eerder uit dan bij 30 °C. Het gebruik van een incubator met vochtigheidsregeling (~ 70-80%) kan helpen deze problemen te verminderen, inclusief seizoensgebonden veranderingen die de interne bouwtemperaturen en vochtigheid kunnen beïnvloeden. Eenmaal met succes vastgesteld, biedt protocol 3 een krachtige manier om een van de meest interessante aspecten van zwermende bacteriën te onderzoeken, verhoogde resistentie tegen antibiotica17. Alle protocollen die hier worden beschreven, kunnen worden toegepast op nieuwe organismen om paden te identificeren die door flagella gemedieerde beweeglijkheid specificeren en beheersen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health grant GM118085 en gedeeltelijk door de Robert Welch Foundation (subsidie F-1811 aan R.M.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe - 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. E. coli in Motion. 1 edn. , Springer-Verlag. New York. (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).

Tags

Biologie bacteriën chemotaxis Escherichia coli flagella roterende motor beweeglijkheid zwemmen zwermen oppervlaktedetectie oppervlaktemotiliteit
Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in <em>Escherichia coli</em> door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Partridge, J. D., Harshey, R. M.… More

Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter