Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie
Summary
Viele Bakterien verwenden Flagellen-getriebene Motilität, um ihre Umgebung zu navigieren und eine günstige Umgebung sowohl einzeln als auch als Kollektiv zu besiedeln. Demonstriert wird hier die Verwendung von drei etablierten Methoden, die Die Motilität als Selektionswerkzeug nutzen, um Komponenten / Pfade zu identifizieren, die zur Schwimm- und Schwarmmotilität beitragen.
Abstract
Die Motilität ist entscheidend für das Überleben und den Erfolg vieler Bakterienarten. Es gibt viele Methoden, um die Motilität zu nutzen, um Signalwege zu verstehen, die Funktion und den Aufbau von Flagellenteilen aufzuklären und Bewegungsmuster zu untersuchen und zu verstehen. Hier demonstrieren wir eine Kombination von drei dieser Methoden. Die Motilität in weichem Agar ist die älteste und bietet eine starke Auswahl für die Isolierung von Gain-of-Function-Suppressor-Mutationen in motilitätseingeschränkten Stämmen, bei denen die Motilität durch eine zweite Mutation wiederhergestellt wird. Die Zellanbindetechnik, die zuerst verwendet wurde, um die rotierende Natur des Flagellenmotors zu demonstrieren, kann verwendet werden, um den Einfluss von Signaleffektoren auf die Motordrehzahl und ihre Fähigkeit, die Drehrichtung zu wechseln, zu bewerten. Der “Grenzübertritts”-Assay ist neuer, bei dem schwimmende Bakterien darauf vorbereitet werden können, sich kollektiv als Schwarm zu bewegen. In Kombination stellen diese Protokolle einen systematischen und leistungsfähigen Ansatz dar, um Komponenten der Motilitätsmaschinerie zu identifizieren und ihre Rolle in verschiedenen Facetten des Schwimmens und Schwärmens zu charakterisieren. Sie können leicht angepasst werden, um die Motilität bei anderen Bakterienarten zu untersuchen.
Introduction
Bakterien verwenden viele Anhängsel zur Bewegung und Ausbreitung in ihren ökologischenNischen 1. Flagellengetriebene Motilität ist die schnellste von diesen, fördert die Besiedlung günstiger Orte als Reaktion auf Umweltsignale und trägt wesentlich zur pathogenen Fähigkeit einiger Artenbei 2,3. Gegeißelte Bakterien können einzeln in flüssiger Schüttung schwimmen oder als Kollektiv über eine halbfeste Oberflächeschwärmen 4. Extrazelluläre Flagellen haften an und werden von in die Membran eingebetteten Rotationsmotoren angetrieben, die die Kraft der Ionengradienten nutzen, um ein Drehmoment zu erzeugen, das eine Rotation1,2,4,5,6,7,8verursacht . Bei E. coli, deren Motoren mit einem konstanten Drehmoment9laufen , kann die Motorleistung in Bezug auf Drehzahl und Umschaltung des Rotors zwischen gegen den Uhrzeigersinn (CCW) und im Uhrzeigersinn (CW) kategorisiert werden. Die CCW-Rotation fördert die Bildung eines kohärenten Flagellenbündels, das die Zelle vorwärts treibt (Run), während ein transienter Schalter in Rotationsrichtung (CW) dazu führt, dass sich das Bündel entweder teilweise oder vollständig10zerlegt und die Zelle ihre Schwimmrichtung neu ausspricht (Tumble). E. coli laufen typischerweise für eine Sekunde und taumeln für eine Zehntelsekunde. Die Schaltfrequenz des Rotors oder “Tumble Bias” wird durch das Chemotaxis-Signalsystem gesteuert, wobei Transmembran-Chemorezeptoren externe chemische Signale erkennen und über Phosphorelay an den Flagellenmotor übertragen, um Läufe als Reaktion auf Lockstoffe zu verlängern oder sie als Reaktion auf toxische Chemikalien zu unterdrücken11,12. Die Schwimmmotilität wird in 0,3% weichem Agar untersucht.
Während des Schwärmens navigieren Bakterien auf einer halbfesten Oberfläche als dichtes Kollektiv, wo Bakterienpackungen in einer kontinuierlichen Wirbelbewegungströmen 2,13,14,15. E. coli-Schwärme zeigen eine veränderte chemosensorische Physiologie (niedrigere Tumble-Bias), höhere Geschwindigkeiten und eine höhere Toleranz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen über Zellen, die in flüssiger Schüttung schwimmen16,17. Schwärme unterscheiden sich in der Anwendung einer Vielzahl von Strategien, die die Bewegung unterstützen, einschließlich Tensidproduktion, Hyperflagellation und Zelldehnung2. Schwärmen bietet Bakterien einen Wettbewerbsvorteil sowohl im ökologischen als auch im klinischen Umfeld18,19,20. Es gibt zwei Kategorien von Schwarmbakterien: gemäßigte Schwärme, die nur auf Medien schwärmen können, die mit 0,5-0,8% Agar erstarrt sind, und robuste Schwärmer, die über höhere Agarkonzentrationen navigieren können21.
Es gibt eine Vielzahl von Assays, um die Schwimmmotilität und ihre Regulierung zu untersuchen. Wenn sie durch Mutationen oder Umweltbedingungen beeinträchtigt wird, bietet die Motilität selbst eine starke Auswahl für die Identifizierung von Gain-of-Function-Suppressor-Mutationen. Diese Suppressoren können echte Revertanten der ursprünglichen Mutation oder Pseudo-Revertanten sein, bei denen eine zweite Mutation die Funktionalität wiederherstellt. Solche Mutanten können durch Whole Genome Sequencing (WGS) identifiziert werden. Eine Alternative zur unvoreingenommenen Suppressorauswahl ist eine verzerrte gezielte Mutagenesestrategie (z. B. PCR-Mutagenese). Diese Methoden beleuchten oft die Funktion oder Umweltregulation des Motilitätsapparates. Wenn das Ziel darin besteht, die motorische Funktion zu untersuchen, bedeutet die Wiederherstellung der Wildtyp-Motilität, wie sie in weichem Agar gemessen wird, nicht unbedingt auf die Wiederherstellung der Wildtyp-Motorleistung. Der Cell-Tethering-Assay, bei dem Zellen durch ein einzelnes Flagellum an einer Glasoberfläche befestigt werden und anschließend die Rotation des Zellkörpers überwacht wird, kann der erste Assay der Wahl zur Beurteilung des motorischen Verhaltens sein. Obwohl heute ausgefeiltere Methoden zur Überwachung der Motoreigenschaften zur Verfügung stehen, begrenzen die erforderliche Einrichtung von Hochgeschwindigkeitskameras und die Anwendung von Softwarepaketen für die Bewegungsanalyse ihre weit verbreitete Verwendung22,23,24,25. Der Zell-Tethering-Assay erfordert nur, dass die Flagellen geschert werden, so dass die kurzen Filamente an einem Glasobjektträger anhaften, gefolgt von einer Videoaufzeichnung der Rotation des Zellkörpers. Obwohl die aufgezeichneten Motordrehzahlen in diesem Assay aufgrund der hohen Belastung, die der Zellkörper auf das Flagellum ausübt, niedrig sind, hat dieser Assay dennoch zu wertvollen Erkenntnissen über chemotaktische Reaktionen26,27,28,29beigetragen und bleibt ein gültiges Untersuchungsinstrument, wie unten beschrieben.
Die Schwarmmotilität stellt Forscher vor andere Herausforderungen. Die Auswahl von Gain-of-Function-Suppressoren funktioniert nur in Schwärmen, die reichlich Tenside produzieren und leichtschwärmen 13. Tensid-Nichtproduzenten wie E. coli sind anspruchsvoll in Bezug auf die Wahl des Agars, die Medienzusammensetzung und die Feuchtigkeit der Umgebung2,13,14,21. Sobald die Schwarmbedingungen festgelegt sind, ist der Grenzübergangsassay17 eine nützliche Methode, um die Fähigkeit eines Schwarms zu untersuchen, sich unter neuen/rauen Bedingungen zurechtzufinden. Obwohl sich die unten vorgestellten Protokolle auf E. colibeziehen, können sie leicht für die Anwendung bei anderen Arten angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Isolierung und Charakterisierung von Suppressormutationen hat erfolgreich dazu beigetragen, Schlüsselkomponenten des Chemotaxis-Systems35,36,37sowie der Motormaschinen selbst zu identifizieren38,39,40. Bei der Verwendung von Protokoll 1 ist es wichtig, mehrere unabhängige Replikate einzubeziehen, um die Isolierung eines großen Sp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health Grant GM118085 und teilweise durch die Robert Welch Foundation (Grant F-1811 an R.M.H.) unterstützt.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
| EDTA Disodium Salt, Dihydrate | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
| Eiken agar | Eiken Chemical Co. Japan | E-MJ00 | Essential for E. coli swarming |
| Glucose D (+) | Fisher Scientific | 410955000 | |
| LB (Lennox) Broth | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
| Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Materials and Equipment | |||
| CellSense microscope imaging software (V. 1.6) | Olympus | Or equivalent software for microscope used | |
| Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape | Fisher | 50-285-28 | |
| Frosted microscope slides 3x1x1mm | Fisher | 12-550-343 | |
| Olympus BX53 microscope | Olympus | BX53 | Any upright or inverted phase microscope can be used |
| Petri dishes (100 mm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | For soft-agar assays |
| Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) | Perkin Elmer | 9908265 | |
| Round Petri Dish with 2 Compartments | VWR | 89200-944 | For border-crossing assays |
| Safety Hypodermic Needles (23G) | Fisher Scientific | 14-826A | |
| Sterile Syringe – 1 mL | Fisher scientific | 14-955-450 | |
| Task/Tissue wipes | Fisher scientific | 06-666 | Or equivalent single use tissue wipes |
| VWR micro cover-glass 18x18mm | VWR | 48366205 | |
| XM10 camera | Olympus | XM10 | Or equivalent microscope camera |
References
- Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
- Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
- Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
- Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
- Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
- Berg, H. C. . E. coli in Motion. 1 edn. , (2004).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
- Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
- Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
- Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
- Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
- Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
- Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
- Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
- Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
- Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Parkinson, J. S. A “bucket of light” for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
- Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
- Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
- Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
- Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
- Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
- Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
- Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
- Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
- Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
- Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
- Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a “backstop brake” mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
- Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a “run-reverse-turn” mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
- Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
- Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
- Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
- Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
- McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
- Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
- Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
- Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
- Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
- Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).
