Summary
많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.
Abstract
운동성은 많은 세균 종의 생존과 성공에 매우 중요합니다. 많은 방법론이 확산경로를 이해하고, 기조부품의 기능과 어셈블리를 해명하고, 움직임패턴을 조사하고 이해하기 위해 모틸성을 악용하기 위해 존재한다. 여기서 우리는 이러한 방법론의 세 가지 의 조합을 보여줍니다. 연한 한천의 운동성은 가장 오래된 것으로, 운동성 장애균의 기능 형 억제제 돌연변이를 격리하기 위한 강력한 선택을 제공하며, 여기서 운동성 조절은 두 번째 돌연변이를 통해 회복됩니다. 기체 모터의 회전 특성을 입증하기 위해 처음 채택된 셀 테더링 기술은 신호 이펙터가 모터 속도에 미치는 영향과 회전 방향을 전환하는 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. "국경 횡단"분석은 수영 박테리아가 무리로 집합적으로 이동으로 전환 할 준비가 될 수있는 최신입니다. 이 프로토콜은 함께 운동성 기계의 구성 요소를 식별하고 수영과 무리의 다양한 면에서 자신의 역할을 특성화하는 체계적이고 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 그(것)들은 그밖 세균성 종에 있는 운동성을 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.
Introduction
박테리아는 그들의 생태 틈새 시장1에서운동과 분산을 위해 많은 부속물을 사용합니다. Flagella 구동 운동성은 이들 중 가장 빠르며, 환경 신호에 대응하여 유리한 로케일의 식민지화를 촉진하고, 일부 종의 병원성 능력에 크게 기여하고있다2,3. 표기 박테리아는 벌크 액체에서 개별적으로 수영할 수 있으며, 반고체 표면4를통해 집단으로 떼지어질 수 있다. 세포외 기색은 멤브레인에 내장된 회전 모터에 의해 구동되며, 이온 그라데이션의 힘을 이용하여 회전1,2,4,5,6,7,8을유발하는 토크를 생성한다. 모터가 일정한 토크9에서실행되는 대장균에서모터 출력은 시계 반대 방향(CCW)과 시계 방향(CW) 방향으로 회전 속도 및 회전기의 전환 측면에서 분류될 수 있습니다. CCW 회전은 셀을 앞으로 추진하는 일관된 플래그엘라 번들의 형성을 촉진(run), 회전 방향(CW)의 일시적인 스위치는 번들이 부분적으로 또는 완전히10을분해하고, 셀은 수영 방향(tumble)을 재조정하도록 합니다. 대장균은 일반적으로 1초 동안 실행되고 10분의 1초 동안 공중제비합니다. 로터 또는 '텀블 바이어스'의 스위칭 주파수는 화학물질 신호 시스템에 의해 제어되며, 여기서 막 이상 화학 수용체는 외부 화학 신호를 감지하고 인포릴레이를 통해 기광모터로 전송하여 유인제에 대한 응답으로 실행을 확장하거나, 독성화학물질(11,12)에대응하여 이를 억제한다. 수영 운동성은 0.3% 부드러운 화창으로 분석됩니다.
무리하는 동안 박테리아는 조밀한 집단으로 반고체 표면을 탐색하며, 박테리아 팩은 연속 소용돌이 동작2,13,14,15로흐를 수 있습니다. 대장균 떼는 화학감각 생리학(낮은 텀블 바이어스), 더 높은 속도, 대량 액체16,17에서수영하는 세포에 대한 항균제에 대한 높은 내성을 나타낸다. Swarmers는 계면 활성제 생산, 과대 깃발 및 세포 연신2를포함하여 운동을 돕는 과다한 전략의 배치에 따라 다릅니다. S워밍업은 생태학적 및임상 설정18,19,20모두에서 박테리아에게 경쟁 우위를 제공합니다. swarmbacteria의 두 가지 범주가 있다: 온대 swarms, 0.5-0.8% 한천으로 고화 된 미디어에만 떼수, 그리고 강력한 swarms, 높은 한천 농도 를 통해 탐색할 수 있는21.
다양한 소의가 수영 운동성과 그 규제를 심문하기 위해 존재합니다. 돌연변이 또는 환경 조건에 의해 손상될 때, 운동성 자체는 기능의 이득 억제기 돌연변이를 확인하기 위한 강한 선택을 제공합니다. 이러한 억제제는 두 번째 돌연변이가 기능을 복원하는 원래 돌연변이 또는 의사 복귀제의 정품 역구일 수 있다. 이러한 돌연변이는 전체 게놈 시퀀싱(WGS)에 의해 식별될 수 있다. 편견없는 억제제 선택에 대한 대안은 편향된 표적 돌연변이 발생 전략(예를 들어, PCR 돌연변이 발생)입니다. 이러한 방법론은 종종 운동성 장치의 기능 또는 환경 조절에 빛을 비추는다. 모터 기능을 연구하는 것이 목표라면, 부드러운 한천에서 측정된 야생형 운동성의 복원이 반드시 야생형 모터 출력의 복원을 나타내는 것은 아닐 수 있습니다. 세포 테더링 분석, 세포가 단일 깃발에 의해 유리 표면에 부착되고 세포 체체의 회전이 이후에 모니터링되는, 모터 거동을 평가하기위한 선택의 초기 분석이 될 수 있습니다. 이제 모터 특성을 모니터링할 수 있는 보다 정교한 방법론이 가능하지만 모션 분석을 위해 필요한 고속 카메라 설정 및 적용으로인해 22,23,24,25의광범위한 사용이 제한됩니다. 셀 테더링 분석법은 기색증을 분리하여 유리 슬라이드에 짧은 필라멘트의 부착을 허용한 다음 셀 바디의 회전을 비디오 녹화해야 합니다. 기록된 모터 속도는 셀 체가 깃음에 미치는 높은 부하 때문에 이 분석에서 낮지만, 그럼에도 불구하고 이 분석은 화학 반응26,27,28,29에대한 귀중한 통찰력에 기여했으며, 아래에서 설명한 바와 같이 유효한 조사 도구로 남아 있다.
모성도를 따뜻하게 하는 것은 연구자에게 다른 도전과제를 제기합니다. 기능의 이득 억제기의 선택은 풍부한 계면 활성제와 쉽게13을생산하는 swarms에서만 작동합니다. 대장균과 같은 계면활성제 비생산자는환경의한천, 미디어 구성 및 습도의 선택에 대하여 까다로운2,13,14,21. 번들 조건이 설정되면, 국경 횡단 분석17은 새로운 / 가혹한 조건을 탐색 하는 군단의 능력을 심문 하는 유용한 방법론. 아래에 제시된 프로토콜은 대장균과관련이 있지만 다른 종의 응용 프로그램에 쉽게 적응할 수 있습니다.
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Protocol
1. 운동성 결핍 균주에서 억제제 돌연변이의 격리
참고: 이 방법을 광범위한 '캐치-올'로 사용하여 운동성 결함의 일반적인 특성을 식별합니다.
- 소프트 마고 플레이트 준비
참고: 연골 또는 수영 용으로도 불리는 소프트 에이저는 화학 요법31,32를분석하는 데 오랫동안 사용되었던 낮은 비율의 한천(~0.2-0.35%w/v)입니다.- 바토-한천 3g(0.3% w/v)과 LB 20g을 2L 라운드 하단 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 ddH2O(이중 증류수) L 1L을 넣고 교반봉과 자기 교반 플레이트를 사용하여 서스펜션을 균일하게 혼합합니다.
- 121 °C에서 20 분 동안 오토 클레이브.
- 위와 같이 막대/접시를 사용하여 부드러운 교반으로 식힙니다. 온도가 약 50°C에 도달하면 멸균 페트리 접시(100mm x 15mm)에 25mL을 붓고, 16시간 이내에 사용하기 위해 용융 된 한천을 뚜껑으로 1 시간 이상 제자리에 놓아 두도록 하십시오.
- 억제제 돌연변이의 문화 준비, 접종 및 격리
참고: 부드러운 천으로 고화된 영양이 풍부한 매체의 중심에 접종된 대장균은 현지에서 영양소를 섭취하여 영양소그라데이션을 생성합니다. 그들은 바깥쪽으로 이동함에 따라, 정의된 '반지'가 나타나며(그림1A)는박테리아가 반응하는 특정 화학 요법과 관련이 있습니다. 치셀라 모터의 화학 요법 시스템 또는 구조 성분의 결함은 이 분석에서 성능을 저하시킬 수 있습니다. 종종, 운동성 이점을 가진 돌연변이는 스크리닝 중에 발생하며, 링 주변을 따라 단일 또는 여러 지점에서 나오는 것을 볼 수 있으며, 어디에서 '플레어'아웃(그림1C). 하나는 수영 전면의 가장 바깥쪽 가장자리가 식민지화되지 않은 처녀 부드러운 한천과 쉽게 대조되는 것을 알 수 있습니다.- 레녹스 브로스(LB; 10g/L 트라이프톤, 5g/L 효모 추출물, 5g/L, 재료테이블)의5mL에서 원하는 운동성 결핍 균주의 하룻밤 배양을 수평 흔들림(220 r.p.m)으로 성장시다. 다음 날, 신선한 LB의 하위 배양(1:100 희석)은 기하급수적 단계(OD600/0.6)와 같은 조건에서 성장한다.
- 배양물의 6 μL을 파이펫을 사용하여 부드러운 천판(1.1)의 중심으로 접종하여 적재된 멸균 팁을 한천으로 밀어 넣고 내용물들을 부드럽게 추방합니다. 30°C로 이송하고 인큐베이션(도1B)으로옮겨가며, 운동성 '플레어'가 분명해질 때까지, 전형적으로 24-36h(도1C)에서접종지점 또는 운동성 고리의 주변에서 발산된다.
참고: 운동성 애서에서, 비교를 위해 돌연변이 분리와 함께 야생 형 변형을 접종하십시오. 이 야생형 균주는 특징적인 동심형 화학고리(도1A)를나타내고 8-10h 이내에 플레이트를 채웁니다. - 멸균 와이어 루프를 사용하여 '플레어' 영역에서 세포를 들어 올리고 줄무늬를 사용하여 단일 콜로니를 LB 하드 한천 플레이트에 정화합니다(위와 같이 준비된 LB, 15 g/L bacto-agar로 고화).
- 멸균 와이어 루프를 사용하여 줄무늬 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 단일 콜로니를 줄이면 다시 정화하여 '순수한' 식민지 분리를 보장합니다.
- 억제제 돌연변이의 확인 및 특성화
- 격리된 억제제 돌연변이가 운동성을 복원한지 확인합니다. 연한 천식판(1.1)과 관심있는 균주에 대한 문화(1.2.1)를 준비하여 야생형및 비교를 위한 시작 '운동성 결핍' 균주를 포함한다.
- 플레이트(1.2.2에서와 같이)를 접종하고 8-10h에 대해 30°C에서 배양한다.
- 가장 바깥쪽 링(원의 모서리)의 직경을 기록하고 어느 격리된 분리가 실질적으로 변성을 회복했는지 를 설정하는 것과 비교합니다.
참고: 실험 시간 과정 내내 플레이트를 촬영하는 것이 좋습니다. 최상의 결과를 얻으려면 디지털 카메라가 광원 위에 장착되어 수영 식민지의 직경을 측정하고 콜로니화되지 않은 천과 구별하는 "빛의 양동이"장치(30)를사용하십시오. - 피험자는 필요에 따라 WGS로 격리되어 야생 형 기능을 복원한 돌연변이를 긍정적으로 식별하기에 충분한 '서열 범위'를 허용합니다.
2. 셀 테더링을 통한 플래그텔라 모터 거동 정량화
참고: 정상적인 텀블 동작(화학 요법)이 손상된 것처럼 보이는 경우 이 메서드를 사용합니다.
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문화 준비 및 플래그젤라 전단
- 1.2.1 단계에서 설명된 바와 같이 관심있는 변형의 기하급수적 위상 배양을 준비한다.
- 10mL의 필터 멸균 운동완충(MB)에서 재중단하기 전에 3분 동안 2,000 x g에서 원심분리에 의한 세포의 펠릿 10mL; 10mM 칼륨 인산염 버퍼 [0.0935 M K2HPO4,0.0065 M KH2PO4,pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10mM NaCl, 75mM KCl).
참고 : MB는 운동성을지원하지만 세균 성장을 지원하지 않습니다 - MB의 1mL에서 최종 펠릿을 다시 중단하기 전에 2.1.2 단계를 두 번 더 반복하십시오.
- 셀 서스펜션을 1mL 주사기로 옮기고 23G 바늘을 끝까지 부착한다. 동일한 주사기/바늘 장치를 조립하고 각 바늘 끝에 단단히 피포링 된 6 인치 폴리에틸렌 튜브 (내경 0.58mm)를 통해 두 가지를 함께 부착하십시오.
- 10번의 패스마다 1분 동안 일시 정지하여 셀 서스펜션을 한 주사기에서 다른 50x로 부드럽게 전달하여 플래그젤라(쉽게 깨지기 쉽고 쉽게 파손)를 전단합니다.
- 3 분 동안 2,000 x g에서 전경 세포를 원심 분리하고 MB의 500 μL의 최종 부피로 다시 중단합니다.
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슬라이드 준비 및 셀 테더링
- 3인치 x 1인치 x 1mm 유리 현미경 슬라이드 위에 18mm x 18mm 커버슬립을 적층하여 양면테이프(도면 S1)로분리하여 셀 고정 챔버를 준비합니다.
- 챔버의 상단에 적용하여 0.01 % (w / v) 폴리 리신 용액으로 챔버를 플러시하십시오. 바닥 가장자리(현미경 슬라이드로 커버슬립 플러시)를 작업 와이퍼(tissue paper)에 기울여챔버(도 S1)를통해 용액을 끌어들이는 데 도움을 줍니다. 그런 다음 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 2.2.2 단계에 설명된 대로 MB의 40 μL로 챔버를 세 번 세척
- 시어드 셀 서스펜션(위 준비)의 40μL을 챔버 상단에 넣고 실온에서 10분 동안 배양하여 세포가 커버슬립에 부착할 수 있도록 합니다.
- 2.2.3에서와 같이 MB의 40 μL로 챔버를 부드럽게 플러시하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다.
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셀 회전 기록 및 정량화
- 테더드 셀로 로드된 현미경 슬라이드를 현미경 단계로 옮는다.
- 위상-대비 현미경 검사법과 100x 목표를 사용하여, 제자리에 고정된 셀의 인구를 스캔하고, 단일 축, 즉, 고정된 지점에서 매끄러운 회전을 하는 대신 초점이 안팎으로 이동하는 각도로 제시한다(비디오1).
- 상업용 현미경 및 관련 카메라를 사용합니다. 관련 소프트웨어를 열고 관심 있는 셀이 포커스에 있는지 확인하고 비디오 수집을 클릭하여 1분 동안 셀 회전을 기록합니다(초당 10프레임 이상).
- 비디오 재생에서 분당 전체 회전 수와 셀이 방향을 변경하는 횟수(스위칭 주파수)를 정량화합니다.
참고: 회전 속도 및 스위칭 주파수는 눈으로 측정하기에너무 빠를 수 있으므로 느리고 미세한 재생을 제공하는 비디오 소프트웨어를 사용하거나 회전패턴을정량화하기 위해 자동화된 소프트웨어 시스템을 채택하는 것이 좋습니다. 대안은 메틸 셀룰로오스 (또는 유사한 에이전트)를 사용하여 MB의 점도를 증가시켜 빠른 박테리아의 회전을 늦추고 해결하거나 프레임 레이트가 낮은 카메라가 사용중일 때 보상하는 것입니다. - 반복 단계 2.3.2 생물학적 복제와 관심의 인구의 표현을 컴파일합니다.
3. 국경을 넘은 분석에서 떼 준비
참고: 돌연변이 또는 상태의 영향을 그룹 운동성에 평가하는 이 방법을 사용합니다. 군단-한천은 보통 연한 한천보다 비율이 높은 한천을 말합니다. 부드러운 한천(0.3%)에서 세포는 한천 내부에서 개별적으로 수영합니다. 무리 한천 (0.5% 이상)에서 세포는 표면에 그룹으로 이동합니다. 군단 플레이트는 여기에 상세한 대로 사용해야 하지만, 수영 플레이트는 유통 기한이 길어지며 며칠 동안 사용할 수 있습니다. 우리의 개인적인 취향은 1-2 일에 사용하는 것입니다.
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무리 의 천의 준비
- 에이켄 한천 5g(0.5% w/v)과 LB 20g을 2L 라운드 하단 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 ddH2O 1L을 넣고 교반봉과 자기 교반 플레이트를 사용하여 서스펜션을 균일하게 혼합합니다.
- 121 °C에서 20 분 동안 오토 클레이브.
- 위와 같이 막대/플레이트를 사용하여 기포를 피하기 위해 부드러운 교반으로 식힙니다. 약 50°C의 경우, 0.5%의 최종 농도를 위해 필터 멸균 포도당을 첨가한다.
- 멸균 페트리 접시 (100mm x 15mm)에 25 mL을 붓고 적어도 14 시간 이상 20 시간 이하의 실온에서 설정할 수 있습니다. 나중에 사용할 수 있는 저장 하지 마십시오.
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떼 판의 접종 및 배양
- 중기 기하 급수 문화의 6 μL (1.2에서와 같이 준비)은 한천 위에 발견하여 접종합니다.
- 뚜껑을 5-10분 간 방치하고 접종이 천 표면으로 건조되면 교체하십시오.
- 8 시간 동안 30 °C에서 배양하십시오. 이것은 천의 건조에 기여하고 무리를 손상으로, 뚜껑을 제거하여 무리 진행을 검사하는 유혹을 피하십시오.
참고: 인큐베이션 시간은 변형 표현형에 따라 달라질 수 있습니다. 몇몇 고립된 돌연변이는 떼어내고 있는 능력을 방해할 수 있고 한천의 감소된 백분율 또는 잠복의 더 긴 기간을 요구할 것입니다.
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국경 횡단 분석 판의 준비
참고:이 분석은 플라스틱 분할(테두리)이하나(그림 2A)가아닌 두 개의 챔버를 생성하는 수정된 페트리 접시를 사용합니다. 각 챔버는 서로 독립적으로 준비할 수 있으며, 두 챔버를 '연결'하기 전에 서로 다른 조건을 제공합니다. 실험 설계에 따라, 제1 챔버(왼쪽 지정)는 박테리아가 국경을 넘어 강측으로 이동하여 포트 라고 +/- 필요한 보충제 또는 챌린지(예: 항생제)를 포함하는 오른쪽 챔버로 이동할 수 있는 수영 한천(0.3%w/v) 또는 군단 한천(0.5%w/v)으로 제조될 수 있습니다. 어느 한 천에 의이동은 일반적으로 접종의 원래 지점에서 세균 식민지 (가장자리에서 가장자리)의 가장 넓은 직경을 기록하여 측정 / 비교된다.- 필요한 경우 1.1에 설명된 대로 수영 한고를 준비하십시오.
- 3.1에 설명된 대로 무리 한천을 준비한다.
- -30mL의 떼 한천(필요한 경우 원하는 보충제)을 이중 구획 페트리 접시(100mm x 15mm)의 오른쪽 챔버에 부어 챔버 사이의 플라스틱 분배기로 수평이 되지만 왼쪽으로 넘쳐나지는않습니다(그림 2B).
- 한천이 경화된 후, 왼쪽 챔버를 ~30mL의 수영 또는 무리 한천으로 채우고, 플라스틱분할(도 2C)과의접촉 지점까지 다시 채우십시오. 설정하기 전에 멸균 파이펫 팁을 사용하여 원고를 테두리 위로 부드럽게 드래그하여 분할의 전체 길이에 걸쳐 있는 ~1mm 높이의 천교다리(도2D)와양면을 연결합니다.
- 접시가 실온(3.1)에서 건조되도록 합니다.
참고: 다리를 만드는 다른 방법은 왼쪽 챔버 한가르가 건조한 다음 플라스틱 칸막이를 따라 용융 된 군단 천자의 100 μL을 천천히 피펫하여 두 챔버 (3.4)를 교개할 수 있도록 합니다. 수영 (1.2.2) 또는 군단 (3.2) 천에 대해 위에 상세한 바와 같이 왼쪽 챔버의 플레이트를 접종하고, 12-16 h에 대한 30 °C에서 배양하기 전에, 또는 무리가 관심있는 균주 사이의 비교를 허용하기 위해 오른쪽 챔버를 통해 충분한 진전을 이루었다.
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Representative Results
그 운동성 신호 분자 c-di-GMP의 높은 수준에 의해 손상되는 대장균 긴장에서 의사 복귀제의 격리는, 우리의 실험실에서 최근 작업에서 상세히 되었다34. 이 균주(JP1442)는 ΔyhjH 및 ΔycgR의두 가지 돌연변이를 수용하였다. YhjH는 대장균에서c-di-GMP를 저하시키는 가장 활동적인 인포디세타이소입니다. YhjH의 부재는 상승 된 c-di-GMP 수준과 운동성의 억제로 이어집니다. YcgR은 c-di-GMP 이펙터입니다. c-di-GMP가 있는 복합체에서 YcgR은 플래그젤라 로터에 결합하여 먼저 CCW 모터 회전을 유도하고 모터 속도를 감소시킵니다. 세포 테더링 및 구단 애약은 모터 행동이 이중 돌연변이체에서 정상으로 돌아왔지만 부드러운 한천의 운동성은34가아니라는 것을 보여주었습니다. 따라서 이중 돌연변이체(도 1C)에서 의사 재생성 플레어를 격리하기 위해 프로토콜의정서 의1단계를배포했습니다. WGS(HiSeq 4000 플랫폼, PE 2 x 150 설정34)에의해 매핑된 돌연변이의 대부분은 일반적으로 ClpXP 프로테아즈를 대상으로 clpXP protease를 지시하는 반응 레귤레이터/어댑터단백질에 대한 코드인 rsSB에34를σ. 이러한 재생제 중 하나는 야생형(AW405, 그림 1A,D비교)에 가깝게 운동성을 표시하여 이중 돌연변이 부모(도 1B)와등생야생형 균주(그림1A)를모두 제어하는 프로토콜 섹션의 2단계 및 3단계에 대한 대표적인 결과를 생성하는 데 사용되었다.
프로토콜 섹션의 2단계의 경우 비디오 캡처를 분석하여 분당 회전(각 360° 완전 회전), CW바이어스(CW 방향으로 회전하는 시간 모터 또는 텀블 바이어스)를 계산했습니다. ΔyhjH는 예상대로 야생형에 비해 분당 회전횟수가 적고 CW 편향이 낮아보였다(그림 3). ΔyhjH ΔycgR 이중 돌연변이체와 그 억제기 모두 야생형과 유사한 모터 동작을 보였으며, 이전작업(34)에서상기 도입에 상세히 설명된 고해상도 '비드' 분석을 사용하여 이전 분석에 의해 지원되는 관측.
의정서 섹션의 3단계의 경우, 국경 횡단 분석법(도2)은야생형 및 억제제 분리의 능력을 비교한 다음, 먼저 무리를 지어, 국경을 넘어 가나미신으로 보충된 한천에 무리를 지어 이동하였다. 결과에 따르면 두 균주가 동일한 접종 지점에서 비슷한 무리 비율을 나타내는 유사한 시간(표시되지 않은 데이터)에서 국경에 도달한 것으로 나타났습니다. 그러나, 무리의 오른쪽(항생제) 챔버의 크로스오버는 20 μg/mL 카나마이신(도4)에서억제제보다 야생형에 대해 소폭, 그러나 일관되게 더 컸다. 두 균주의 차이는 40 μg/mL 카나마이신에서 더 두드러졌다. 이 데이터는 함께 연한 천판(도1D)에대한 운동성을 회복한 rssB의 돌연변이가 무리 시 억제제 균주의 항생제 내성에 부정적인 영향을 미친다는 것을 시사한다(도4).
그림 1: 부드러운 천감 성 연골 검사 및 억제기 플레어의 출현.
플레이트에는 0.3%w/v 한천으로 고화된 LB가 포함되어 있습니다. 대장균균은 각 플레이트의 중앙에 접종되어 16h.(A) 야생형 대장균(AW405)을 위해 배양된 C를 제외한 8h에 30°C로 배양하였다. (B)운동성 결핍 변종 ∆yhjH ∆ ycgR(JP1442). (C)B에서와 같이, 더 긴 잠복기를 제외하고. 화살표는 확장 수영 식민지의 주변 고리에서 나오는 빠르게 움직이는 '플레어'를 가리킵니다. (D)C.의 플레어에서 분리된 서프레서는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 국경 횡단 판 분석체를 설정하기 위한 회로도.
(A)플라스틱 칸막이가 있는 수평까지 분할 된 페트리 접시의 오른쪽 챔버에 군단 한천 (원하는 항생제)의 ~ 30 mL을 부어 뚜껑을 닫고 설정할 수 있습니다. (B)왼쪽 챔버를 수영 또는 무리 한고로 채우는 것은 플라스틱 칸막이의 상단과 접촉하는 지점으로. (C)멸균 파이펫 팁을 사용하여 용융 된 떼 천을 테두리 위로 부드럽게 드래그하여 양면을 ~ 1mm 높이의 천교로 연결하고 뚜껑을 닫고 놓습니다. (D)플레이트가 원하는 변형으로 왼쪽 챔버를 접종하기 전에 밤새 실온에서 더 건조할 수 있도록 하고, 30°C에서 배양하십시오.
도 3: 세포 테더링 기술에 의해 측정된 다양한 균주의 모터 특성.
와일드 타입(AW405), ∆ yhjH(VN133), ∆ y ∆hjH(JP1442), 그리고 그 억제제(JP1836)는 LB에서 30°C에서 중간 지수상으로 성장하였다. (A)분당 회전(360° 회전 완료),(B)CW바이어스(시간 모터의 분수는 CW 방향으로 회전). 평균 (±)의 표준 편차. 20테더드된 세포는 각 변형에서 60초 동안 관찰되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 국경 횡단 에세이.
야생형 대장균(AW405)과 억제제 돌연변이(JP1836)의 중간 기하급수체 배양은 군단 을 포함하는 분할판의 좌측 구획에서 표시위치(*)에서 접종되었고, 30°C에서 배양하였다. 그들은 비슷한 시기에 국경에 도달했습니다. 플레이트는 6시간 더 배양되었고, 그 동안 무리가 오른쪽 챔버로 넘어갔고, 그 동안 미디어는 카나마이신으로 보충되었다(칸; 숫자는 μg/mL을 나타낸다). 플레이트는 삼중판기에서 각각 수행된 3개의 생물학적 복제를 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 셀 테더링을 위한 챔버 슬라이드 준비. (A)면도날을 사용하여 양면 테이프2개를 내려놓고 과잉을 다듬는다. (C)상단 층을 벗겨 전에 접착제를 노출(D)커버 슬립을 부착하고 부드럽게 위치로 눌러 (에 의해 표시 [ 표시), 모든 공기가 아래 의 커버 슬립과 테이프 사이의 인터페이스에서 밀려 보장. (E)적재 샘플(DNA 로딩 염료(30% v/v 글리세롤, 0.25% w/v 브로모페놀 블루, 0.25% w/v 자일렌 시안올] 생성 된 채널의 상단에 추가 된 (화살표) 깨끗한, 조직 작업 닦아 는 동안 (F) 깨끗한, 조직 작업 닦아 는 것을 통해 용액을 끌어당기도록 돕는 동안(E)및 조직 작업 닦아 는 것을 유도하여 액상 채널을 통해 용액을 끌어들이는 데 도움을 줍니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 테더드 대장균 세포의 회전. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 60배율 배율로 촬영된 활성 대장균 떼가 움직이는 앞가장자리 뒤에서 특징적인 소용돌이 동작을 보여줍니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
억제제 돌연변이의 격리 및 특성화는화학기관시스템(35,36,37)의주요 성분을 식별하는 데 성공적으로 기여했으며, 모터기계자체(38,39,40)를확인하였다. 프로토콜 1을 사용하는 동안, 운동성의 손실을 보상 할 수있는 가능한 돌연변이의 큰 스펙트럼의 격리를 보장하기 위해 여러 독립적 인 복제를 포함하는 것이 중요합니다. 스팟이 아닌 선로로 배양을 줄임으로써 박테리아의 수를 늘리면,억제제(41)를생성할 확률을 향상시킬 수 있다. 동일한 돌연변이의 격리 (DNA 염기서열에 의해 결정된 대로) 여러 번 그 진위여부에 대한 자신감을 증가시킵니다. WGS는 항상 게놈에 있는 그밖 돌연변이의 존재를 밝힐 것입니다. 따라서 식별된 돌연변이를 원래 운동성 결핍 배경으로 다시 변환하여 결과를 확인하는 것이 중요합니다. 억제제 돌연변이 접근법은 이차 돌연변이를 통해 기능을 복원하는 데 뿌리를 두고 있으므로 이 방법의 한계는 중요한 구조 유전자가 삭제되는 경우, 즉 전체 경로 또는 구조를 뒷받침하는 것이 보상 범위가 없을 수 있다는 것입니다. 오래된 방법임에도 불구하고, 우리의 최근 작업34세균성 운동성에 기여하는 새로운 통로의 명분에 있는 그것의 지속적인 유틸리티를 보여줍니다.
모터 출력의 정량화를 위해, 세포 테더링 접근은 카메라 부착을 가진 현미경만을 요구하는 보편적으로 접근가능한 공구로 남아 있습니다. 세포 테더링은 이미 살모넬라(42), 슈도모나스(43), 연쇄상구균(44)및 로도박터(33)를포함한 다양한 세균종에 사용되고 있다. 프로토콜의 성공은 주로 적절한 전단과 세포의 부착에 달려 있습니다. 너무 공격적으로 전단 또는 가위 (2.1.5) 사이의 일시 정지를 생략하는 것은 비 운동성 세포 또는 세포가 꼬인 축에 묶여있는 결과로 필라멘트의 일관되지 않거나 불완전한 전단을 촉진하는 경향이 있습니다. 이 프로토콜의 지속적인 관련성은 많은 연구 그룹 (당사 포함)에 의해 고해상도 구슬 분석의 채택에도 불구하고 남아있다. 비드 분석의 주요 제한은 관심있는 박테리아의 필라멘트를 고수하는 구드의 필요성에서 비롯됩니다. 이 기술은 '끈적끈적한' 플래그렐린 알레를 확인한 대장균 의 연구에서 크게 혜택을 받아45를준수합니다. 끈적끈적한 변종은 세포 테더링 분석에서도 우수합니다. 이러한 변이체는 아직 표기 박테리아의 대부분에 사용할 수 없습니다. 상황은 다중 플래그렐린 단백질을 소유하는 일부 유기체(46)와 Vibrio sp., 또한 membranous 칼집을 소유하는 더 복잡하다47. 세포 테더링은 또한 엔지니어링 된 에피토프 태그에 종 특정 안티 플래그렐린 항체 또는 항체를 사용하여 수행 될 수있다.
박테리아는 액체 매체로 소개하는 즉시 수영할 수 있지만, 이것은 세포가 먼저 무리 상태로 준비되어야하는 무리의 사실이 아닙니다. 표면 접촉은 세포가48,49,50,51을시작하도록 요구되는 생리적 변화를 유발하여 지연 단계와 높은 세포 밀도의 축적을 초래합니다. 생리학적 변화로는 대장균(16)에서화학요법 시스템의 리모델링, 다른박테리아13,14,21에대한 세포 신장 및/또는 과대열과 같은 적응등이 포함된다. 무리를 시작하는 데 필요한 생리적 변화를 감안할 때, 우리는 단순히 밀도를 높이기 위해 판자 세포 배양을 집중시키고 세포 분부52,53을억제하는 항생제를 사용하여 세포 신장을 유도하는 것으로- 고밀도 또는 증가 된 세포 길이와 같은 무리의 선택 면을 모방하려고 시도한 연구에 대한 주의 사항을 공격합니다. 세포 신장을 마커로 사용하는 경우, 우리는 또한 판자 세포에 비해, 살모넬라 또는 대장균(54)에서스워워셀 세포의 평균 길이가 미미한 증가만 주의한다. 군단의 에세이는 수영 에세이보다 확립하기가 더 어렵습니다. 변수는 미디어를 고화화하는 데 사용되는 한천의 상업적 공급원을 포함합니다 (특수 에이켄 한천은 대장균에서떼어다니는 데 필수적이며, 더 표준적인 Difco 한청은 다른 모든 박테리아에 대한 무리를 지원합니다), 최소한의 매체(대장균과 살모넬라의 사용은 포도당 보충제가 필요함), 가장 비판적인 주변 습도2,13,14,21. 이 중 최적의 습도를 유지하는 것이 가장 실망스러울 수 있습니다. [선택유기체(슈도모나스 아에루기노사)에서떼어짐에 대한 우수하고 체계적이며 최적화된 모랄레스소토와 동료55.] 군단 매체는 무리한 무리를 촉진하기 위해 충분히 습해야하지만 수동 확산 / 슬라이딩을 허용하기 위해 너무 촉촉하지 않아야하며, 이는 쉽게 활성 무리56로착각 할 수 있습니다. 따라서 이러한 집단 운동성과 관련된 뚜렷한 움직임 패턴을 확인하기 위해 현미경으로 군단을 확인하는 것이중요하다(비디오 2). 온도는 또한 무리 분석 최적화를위한 중요한 고려 사항입니다. 예를 들어 37°C의 높은 온도는 30°C보다 빨리 플레이트를 건조시다. 습도 제어(~70-80%)가 있는 인큐베이터를 사용하면 내부 건물 온도와 습도에 영향을 줄 수 있는 계절적 변화를 포함하여 이러한 문제를 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일단 성공적으로 설치되면, 프로토콜 3은 s무리 박테리아의 가장 흥미로운 측면 중 하나를 조사하는 강력한 방법을 제공합니다, 항생제에 높은 저항17. 여기에 설명된 모든 프로토콜은 새로운 유기체에 적용되어 플래그텔라 매개 운동성을 지정하고 제어하는 경로를 식별할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 보조금 GM118085의 국가 학회에 의해 지원되었고 부분적으로 로버트 웰치 재단 (R.M.H.에 F-1811을 부여)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
| EDTA Disodium Salt, Dihydrate | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
| Eiken agar | Eiken Chemical Co. Japan | E-MJ00 | Essential for E. coli swarming |
| Glucose D (+) | Fisher Scientific | 410955000 | |
| LB (Lennox) Broth | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
| Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Materials and Equipment | |||
| CellSense microscope imaging software (V. 1.6) | Olympus | Or equivalent software for microscope used | |
| Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape | Fisher | 50-285-28 | |
| Frosted microscope slides 3x1x1mm | Fisher | 12-550-343 | |
| Olympus BX53 microscope | Olympus | BX53 | Any upright or inverted phase microscope can be used |
| Petri dishes (100 mm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | For soft-agar assays |
| Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) | Perkin Elmer | 9908265 | |
| Round Petri Dish with 2 Compartments | VWR | 89200-944 | For border-crossing assays |
| Safety Hypodermic Needles (23G) | Fisher Scientific | 14-826A | |
| Sterile Syringe - 1 mL | Fisher scientific | 14-955-450 | |
| Task/Tissue wipes | Fisher scientific | 06-666 | Or equivalent single use tissue wipes |
| VWR micro cover-glass 18x18mm | VWR | 48366205 | |
| XM10 camera | Olympus | XM10 | Or equivalent microscope camera |
References
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