Muitas bactérias usam motilidade impulsionada por flagela para navegar em seu ambiente e colonizar ambientes favoráveis tanto individualmente quanto como coletivos. Demonstrado aqui é o uso de três métodos estabelecidos que exploram a motilidade como ferramenta de seleção para identificar componentes/caminhos que contribuem para a natação e a motilidade.
A motilidade é crucial para a sobrevivência e o sucesso de muitas espécies bacterianas. Existem muitas metodologias para explorar a motilidade para entender caminhos de sinalização, para elucidar a função e montagem de partes flageladoras, e para examinar e entender padrões de movimento. Aqui demonstramos uma combinação de três dessas metodologias. A motilidade no ágar macio é a mais antiga, oferecendo uma forte seleção para isolar mutações supressoras de ganho de função em cepas prejudicadas pela motilidade, onde a motilidade é restaurada através de uma segunda mutação. A técnica de amarração celular, primeiramente empregada para demonstrar a natureza rotativa do motor flagelador, pode ser usada para avaliar o impacto dos efeitos de sinalização na velocidade do motor e sua capacidade de alternar a direção rotacional. O ensaio de “travessia de fronteiras” é mais recente, onde bactérias nadando podem ser preparadas para a transição para se mover coletivamente como um enxame. Em combinação, esses protocolos representam uma abordagem sistemática e poderosa para identificar componentes da maquinaria de motilidade, e para caracterizar seu papel em diferentes facetas da natação e do enxame. Eles podem ser facilmente adaptados para estudar motilidade em outras espécies bacterianas.
As bactérias empregam muitos apêndices para movimentação e dispersão em seus nichos ecológicos1. A motilidade conduzida por Flagella é a mais rápida delas, promovendo a colonização de locais favoráveis em resposta aos sinais ambientais, contribuindo significativamente para a capacidade patogênica de algumas espécies2,3. Bactérias flageladas podem nadar individualmente em líquido a granel, ou enxame como um coletivo sobre uma superfície semissólida4. A flagela extracelular se prende e é conduzida por motores rotativos embutidos na membrana, que aproveitam a potência dos gradientes de íons para gerar torque que causa rotação1,2,4,5,6,7,8. Em E. coli, cujos motores funcionam em um torque constante9, a saída do motor pode ser categorizada em termos de velocidade rotacional e comutação do rotor entre as direções no sentido anti-horário (CCW) e sentido horário (CW). A rotação CCW promove a formação de um feixe de flagelar coerente que impulsiona a célula para a frente (corrida), enquanto um interruptor transitório na direção rotacional (CW) faz com que o feixe se desmonte parcial ou totalmente10, e a célula reoriente sua direção de natação (tombo). E. coli normalmente corre por um segundo e cai por um décimo de segundo. A frequência de comutação do rotor ou do “viés de queda” é controlada pelo sistema de sinalização de quimiotaxis, onde os quimoreceptores transmembrano detectam sinais químicos externos e transmitem-nos via fosfora ao motor flagelador para estender as corridas em resposta aos atrativos, ou suprimi-los em resposta a produtos químicos tóxicos11,12. A motilidade da natação é avaliada em 0,3% de ágar macio.
Durante o enxame, as bactérias navegam em uma superfície semissólida como um coletivo denso, onde pacotes de bactérias fluem em um movimento contínuo de redemoinho2,13,14,15. Os enxames de E. coli apresentam fisiologia quimioensory alterada (viés de queda mais baixo), maiores velocidades e maior tolerância a antimicrobianos sobre células que nadam em líquido a granel16,17. Os enxames variam em sua implantação de uma infinidade de estratégias que auxiliam o movimento, incluindo produção surfactante, hiperflagellação e alongamento celular2. O swarming oferece às bactérias uma vantagem competitiva nos ambientes ecológicos e clínicos18,19,20. Existem duas categorias de bactérias em enxame: enxames temperados, que só podem enxamear na mídia solidificada com 0,5-0,8% de ágar, e enxames robustos, que podem navegar através de concentrações de ágar mais altas21.
Existem uma variedade de ensaios para interrogar a motilidade da natação e sua regulamentação. Quando prejudicada por mutações ou condições ambientais, a própria motilidade oferece uma forte seleção para identificar mutações supressoras de ganho de função. Esses supressores podem ser revertentes genuínos da mutação original, ou pseudo-revertentes, onde uma segunda mutação restaura a funcionalidade. Tais mutantes podem ser identificados por sequenciamento de genomas inteiros (WGS). Uma alternativa à seleção de supressores imparcial é uma estratégia de mutagênese direcionada tendenciosa (por exemplo, mutagênese PCR). Essas metodologias muitas vezes lançam luz sobre a função ou regulação ambiental do aparelho de motilidade. Se o objetivo é estudar a função motora, então a restauração da motilidade do tipo selvagem medida em ágar macio pode não necessariamente indicar a restauração da saída do motor do tipo selvagem. O ensaio de amarração celular, no qual as células são anexadas a uma superfície de vidro por um único flagellum e a rotação do corpo celular é posteriormente monitorada, pode ser o ensaio inicial de escolha para avaliar o comportamento motor. Embora metodologias mais sofisticadas estejam agora disponíveis para monitorar as propriedades do motor, a configuração necessária da câmera de alta velocidade e a aplicação de pacotes de software para análise de movimento limitam seu uso generalizado22,23,24,25. O ensaio de amarração da célula requer apenas que a flagela seja amarrada, permitindo a fixação dos filamentos curtos a um slide de vidro, seguido de filmagem da rotação do corpo celular. Embora as velocidades motoras registradas sejam baixas neste ensaio devido à alta carga que o corpo celular exerce sobre o flagelo, este ensaio contribuiu, no entanto, para insights valiosos sobre as respostas chemotactic26,27,28,29, e continua sendo uma ferramenta investigativa válida como discutido abaixo.
A motilidade repleta representa um conjunto diferente de desafios para os pesquisadores. A seleção de supressores de ganho de função só funciona em enxames que produzem surfactantes abundantes e enxames prontamente13. Não-produtores surfactantes como o E. coli são exigentes com relação à escolha do ágar, composição da mídia e umidade do ambiente2,13,14,21. Uma vez estabelecidas as condições de enxame, o ensaio de travessia de fronteiras17 é uma metodologia útil para interrogar a capacidade de um enxame de navegar em novas/condições duras. Embora os protocolos apresentados abaixo se relacionem com E. coli,eles podem ser prontamente adaptados para aplicação em outras espécies.
O isolamento e a caracterização das mutações supressoras contribuíram com sucesso para identificar componentes-chave do sistema de quimioterapia35,36,37, bem como da própria máquina motora38,39,40. Ao usar o Protocolo 1, é importante incluir múltiplas réplicas independentes para garantir o isolamento de um grande espectro de p…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde de subvenção GM118085 e em parte pela Fundação Robert Welch (conceder F-1811 a R.M.H.).
Reagents | |||
Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
EDTA Disodium Salt, Dihydrate | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
Eiken agar | Eiken Chemical Co. Japan | E-MJ00 | Essential for E. coli swarming |
Glucose D (+) | Fisher Scientific | 410955000 | |
LB (Lennox) Broth | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
Materials and Equipment | |||
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) | Olympus | Or equivalent software for microscope used | |
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape | Fisher | 50-285-28 | |
Frosted microscope slides 3x1x1mm | Fisher | 12-550-343 | |
Olympus BX53 microscope | Olympus | BX53 | Any upright or inverted phase microscope can be used |
Petri dishes (100 mm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | For soft-agar assays |
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) | Perkin Elmer | 9908265 | |
Round Petri Dish with 2 Compartments | VWR | 89200-944 | For border-crossing assays |
Safety Hypodermic Needles (23G) | Fisher Scientific | 14-826A | |
Sterile Syringe – 1 mL | Fisher scientific | 14-955-450 | |
Task/Tissue wipes | Fisher scientific | 06-666 | Or equivalent single use tissue wipes |
VWR micro cover-glass 18x18mm | VWR | 48366205 | |
XM10 camera | Olympus | XM10 | Or equivalent microscope camera |