Mange bakterier bruker flagelladrevet motilitet for å navigere i miljøet og kolonisere gunstige omgivelser både individuelt og som kollektiv. Demonstrert her er bruk av tre etablerte metoder som utnytter motilitet som et utvalgsverktøy for å identifisere komponenter / veier som bidrar til svømming og swarming motility.
Motilitet er avgjørende for overlevelse og suksess for mange bakterielle arter. Mange metoder eksisterer for å utnytte motilitet for å forstå signalveier, for å belyse funksjonen og monteringen av flagellardeler, og for å undersøke og forstå bevegelsesmønstre. Her demonstrerer vi en kombinasjon av tre av disse metodene. Motilitet i myk agar er den eldste, og tilbyr et sterkt utvalg for å isolere gain-of-function suppressor mutasjoner i motility-svekkede stammer, hvor motilitet gjenopprettes gjennom en annen mutasjon. Celle-tethering teknikken, først brukt til å demonstrere den roterende naturen til flagellarmotoren, kan brukes til å vurdere virkningen av signaleffektorer på motorhastigheten og dens evne til å bytte rotasjonsretning. Den “grenseoverskridende” analysen er nyere, hvor svømmebakterier kan primes til å gå over til å bevege seg kollektivt som en sværm. I kombinasjon representerer disse protokollene en systematisk og kraftig tilnærming til å identifisere komponenter i motilitetsmaskineriet, og å karakterisere deres rolle i forskjellige fasetter av svømming og swarming. De kan lett tilpasses for å studere motilitet i andre bakteriearter.
Bakterier bruker mange vedlegg for bevegelse og spredning i sine økologiske nisjer1. Flagella-drevet motilitet er den raskeste av disse, fremmer koloniseringen av gunstige lokaliteter som svar på miljøsignaler, og bidrar betydelig til den patogene evnen til noen arter2,3. Flagelerte bakterier kan svømme individuelt i bulkvæske, eller sverme som et kollektiv over en halvfast overflate4. Ekstracellulær flagella festes til og drives av roterende motorer innebygd i membranen, som utnytter kraften til iongradienter for å generere dreiemoment som forårsaker rotasjon1,2,4,5,6,7,8. I E. coli, hvis motorer kjører med konstant dreiemoment9, kan motorutgangen kategoriseres når det gjelder rotasjonshastighet og veksling av rotoren mellom retninger mot klokken (CCW) og med klokken (CW). CCW-rotasjon fremmer dannelsen av en sammenhengende flagellarbunt som driver cellen fremover (kjør), mens en forbigående bryter i rotasjonsretning (CW) får bunten til å demontere enten delvis eller helt10, og cellen til å reorientere svømmeretningen (tumble). E. coli løper vanligvis et sekund og snubler i en tiendedel av et sekund. Koblingsfrekvensen til rotoren eller “tumble bias” styres av chemotaxis-signalsystemet, hvor transmembrane chemoreceptorer oppdager eksterne kjemiske signaler og overfører dem via fosforelegg til flagellarmotoren for å forlenge løp som svar på tiltrekningsmidler, eller undertrykke dem som svar på giftige kjemikalier11,12. Svømmemotilitet er analysert i 0,3% myk agar.
Under swarming navigerer bakterier på en halvfast overflate som et tett kollektiv, hvor pakker med bakterier strømmer i en kontinuerlig virvlende bevegelse2,13,14,15. E. coli svermer viser endret kjemosensorisk fysiologi (lavere tumble bias), høyere hastigheter, og høyere toleranse for antimikrobielle over celler som svømmer i bulkvæske16,17. Svermere varierer i utplasseringen av en mengde strategier som hjelper bevegelse, inkludert overflateaktiv produksjon, hyperflagellasjon og celleforlengelse2. Swarming tilbyr bakterier et konkurransefortrinn i både økologiske og kliniske omgivelser18,19,20. Det er to kategorier av swarming bakterier: tempererte svermere, som bare kan svømme på media størknet med 0,5-0,8% agar og robuste svermere, som kan navigere over høyere agarkonsentrasjoner21.
Det finnes en rekke analyser for å forhøre svømmemotiliteten og reguleringen. Når det er svekket av mutasjoner eller miljøforhold, tilbyr motilitet i seg selv et sterkt utvalg for å identifisere gain-of-function suppressor mutasjoner. Disse undertrykkerne kan være ekte revertanter av den opprinnelige mutasjonen, eller pseudo-revertanter, der en annen mutasjon gjenoppretter funksjonaliteten. Slike mutanter kan identifiseres ved hele genomsekvensering (WGS). Et alternativ til objektivt valg av undertrykker er en partisk målrettet mutagenesestrategi (f.eks. PCR-mutagenese). Disse metodene kaster ofte lys over funksjonen eller miljøreguleringen av motilitetsapparatet. Hvis målet er å studere motorisk funksjon, kan restaurering av villtype motilitet målt i myk agar ikke nødvendigvis indikere restaurering av villmotorutgang. Celle-tethering analysen, der celler er festet til en glassoverflate med et enkelt flagellum og rotasjon av cellekroppen overvåkes senere, kan være den første analysen du velger for å vurdere motorisk oppførsel. Selv om mer avanserte metoder nå er tilgjengelige for å overvåke motoregenskaper, begrenser det nødvendige høyhastighetskameraoppsettet og anvendelsen av programvarepakker for bevegelsesanalyse deres utbredte bruk22,23,24,25. Den celle-tethering analysen krever bare at flagellaen skal skjæres, slik at vedlegg av de korte filamentene til et glasssklie, etterfulgt av videoopptak av rotasjonen av cellekroppen. Selv om de registrerte motorhastighetene er lave i denne analysen på grunn av den høye belastningen cellekroppen utøver på flagellumet, har denne analysen likevel bidratt til verdifull innsikt i kjemoaktiske responser26,27,28,29, og forblir et gyldig undersøkende verktøy som diskutert nedenfor.
Swarming motility utgjør et annet sett med utfordringer for forskere. Utvalg av gain-of-function suppressors fungerer bare i svermere som produserer store overflateaktive stoffer og sverm lett13. Overflateaktive ikke-produsenter som E. coli er begeistret med hensyn til valg av agar, mediesammensetning og fuktighet i miljøet2,13,14,21. Når svermende forhold er etablert, er grenseovergangsanalysen17 en nyttig metodikk for å forhøre en sværms evne til å navigere nye / tøffe forhold. Selv om protokollene som presenteres nedenfor er relatert til E. coli, kan de lett tilpasses for bruk i andre arter.
Isolasjon og karakterisering av undertrykkermutasjoner har med hell bidratt til å identifisere nøkkelkomponenter i chemotaxis-systemet35,36,37, samt selve motormaskineriet38,39,40. Når du bruker protokoll 1, er det viktig å inkludere flere uavhengige repliker for å sikre isolering av et stort spekter av mulige mutasjoner som kan ko…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant GM118085 og delvis av Robert Welch Foundation (grant F-1811 til R.M.H.).
Reagents | |||
Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
EDTA Disodium Salt, Dihydrate | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
Eiken agar | Eiken Chemical Co. Japan | E-MJ00 | Essential for E. coli swarming |
Glucose D (+) | Fisher Scientific | 410955000 | |
LB (Lennox) Broth | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
Materials and Equipment | |||
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) | Olympus | Or equivalent software for microscope used | |
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape | Fisher | 50-285-28 | |
Frosted microscope slides 3x1x1mm | Fisher | 12-550-343 | |
Olympus BX53 microscope | Olympus | BX53 | Any upright or inverted phase microscope can be used |
Petri dishes (100 mm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | For soft-agar assays |
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) | Perkin Elmer | 9908265 | |
Round Petri Dish with 2 Compartments | VWR | 89200-944 | For border-crossing assays |
Safety Hypodermic Needles (23G) | Fisher Scientific | 14-826A | |
Sterile Syringe – 1 mL | Fisher scientific | 14-955-450 | |
Task/Tissue wipes | Fisher scientific | 06-666 | Or equivalent single use tissue wipes |
VWR micro cover-glass 18x18mm | VWR | 48366205 | |
XM10 camera | Olympus | XM10 | Or equivalent microscope camera |