Veel bacteriën gebruiken flagella-gedreven beweeglijkheid om door hun omgeving te navigeren en gunstige omgevingen te koloniseren, zowel individueel als als collectief. Hier wordt het gebruik aangetoond van drie gevestigde methoden die motiliteit als selectietool gebruiken om componenten / paden te identificeren die bijdragen aan zwem- en zwermmotiliteit.
Beweeglijkheid is cruciaal voor het overleven en succes van veel bacteriesoorten. Er bestaan veel methoden om de beweeglijkheid te benutten om signaleringsroutes te begrijpen, om de functie en assemblage van flagellar-onderdelen op te helderen en om bewegingspatronen te onderzoeken en te begrijpen. Hier demonstreren we een combinatie van drie van deze methodieken. Motiliteit in zachte agar is de oudste en biedt een sterke selectie voor het isoleren van gain-of-function suppressor mutaties in motiliteit-aangetaste stammen, waar motiliteit wordt hersteld door een tweede mutatie. De cel-tethering techniek, eerst gebruikt om de roterende aard van de flagellar motor aan te tonen, kan worden gebruikt om de impact van signaleringseffectoren op de motorsnelheid en zijn vermogen om van draairichting te veranderen te beoordelen. De “grensovergang” test is recenter, waar zwemmende bacteriën kunnen worden klaargekmeld om over te schakelen naar collectief bewegen als een zwerm. In combinatie vertegenwoordigen deze protocollen een systematische en krachtige benadering van het identificeren van componenten van de motiliteitsmachines en het karakteriseren van hun rol in verschillende facetten van zwemmen en zwermen. Ze kunnen gemakkelijk worden aangepast om de beweeglijkheid bij andere bacteriesoorten te bestuderen.
Bacteriën gebruiken veel aanhangsels voor beweging en verspreiding in hun ecologischeniches 1. Flagella-gedreven beweeglijkheid is de snelste van deze, bevordert de kolonisatie van gunstige plaatsen als reactie op omgevingssignalen en draagt aanzienlijk bij aan het pathogene vermogen van sommige soorten2,3. Flagellated bacteriën kunnen individueel zwemmen in bulk vloeistof, of zwerm als een collectief over een semi-solide oppervlak4. Extracellulaire flagella hechten zich aan en worden aangedreven door roterende motoren ingebed in het membraan, die de kracht van ionengradiënten benutten om koppel te genereren dat rotatie1,2,4,5,6,7,8veroorzaakt. In E. coli, waarvan de motoren op een constant koppel9draaien, kan het motorvermogen worden gecategoriseerd in termen van rotatiesnelheid en schakelen van de rotor tussen de richting tegen de klok in (CCW) en de richting met de klok mee (CW). CCW-rotatie bevordert de vorming van een coherente flagellarbundel die de cel naar voren stuwt (lopen), terwijl een voorbijgaande schakelaar in rotatierichting (CW) ervoor zorgt dat de bundel gedeeltelijk of volledig wordt gedemonteerd10, en de cel zijn zwemrichting heroriënteert (tuimelen). E. coli loopt meestal een seconde en tuimelt voor een tiende van een seconde. De schakelfrequentie van de rotor of “tumble bias” wordt geregeld door het chemotaxis-signaleringssysteem, waarbij transmembrane chemoreceptoren externe chemische signalen detecteren en via fosforelay naar de flagellaire motor overbrengen om de runs uit te breiden als reactie op attractanten, of ze onderdrukken als reactie op giftige chemicaliën11,12. Zwemmotiliteit wordt uitgevoerd in 0,3% zachte agar.
Tijdens het zwermen navigeren bacteriën op een semi-vast oppervlak als een dicht collectief, waar groepen bacteriën in een continue wervelende beweging2,13,14,15stromen. E. coli zwermen vertonen veranderde chemosensorische fysiologie (lagere tumble bias), hogere snelheden en een hogere tolerantie voor antimicrobiële stoffen boven cellen zwemmen in bulk vloeistof16,17. Zwermers variëren in hun inzet van een overvloed aan strategieën die beweging helpen, waaronder oppervlakteactieve productie, hyperflagellatie en celverlenging2. Zwermen biedt bacteriën een concurrentievoordeel in zowel ecologische als klinische omgevingen18,19,20. Er zijn twee categorieën zwermbacteriën: gematigde zwermen, die alleen kunnen zwermen op media gestold met 0,5-0,8% agar, en robuuste zwermen, die over hogere agarconcentraties kunnen navigeren21.
Er bestaan verschillende testtesten om de zwemmotiliteit en de regelgeving ervan te ondervragen. Wanneer aangetast door mutaties of omgevingsomstandigheden, biedt de beweeglijkheid zelf een sterke selectie voor het identificeren van gain-of-function suppressor mutaties. Deze suppressors kunnen echte revertanten van de oorspronkelijke mutatie zijn, of pseudo-revertanten, waarbij een tweede mutatie de functionaliteit herstelt. Dergelijke mutanten kunnen worden geïdentificeerd door hele genoomsequencing (WGS). Een alternatief voor onbevooroordeelde suppressorselectie is een bevooroordeelde gerichte mutagenesestrategie (bijv. PCR mutagenese). Deze methoden werpen vaak licht op de functie of milieuregelgeving van het motiliteitsapparaat. Als het doel is om de motorische functie te bestuderen, dan is het herstel van wild-type motiliteit zoals gemeten in zachte agar mogelijk niet noodzakelijkerwijs wijzen op herstel van wild-type motor output. De cel-tethering assay, waarbij cellen door een enkel flagellum aan een glasoppervlak worden bevestigd en de rotatie van het cellichaam vervolgens wordt gecontroleerd, kan de eerste keuzetest zijn voor het beoordelen van motorisch gedrag. Hoewel er nu meer geavanceerde methodologieën beschikbaar zijn om motorische eigenschappen te monitoren , beperken de vereiste opstelling en toepassing van softwarepakketten voor bewegingsanalyse het wijdverbreide gebruik ervan22,23,24,25. De cel-tethering assay vereist alleen dat de flagella wordt geschoren, waardoor de korte filamenten aan een glazen dia kunnen worden gehecht, gevolgd door het filmen van de rotatie van het cellichaam. Hoewel de geregistreerde motorische snelheden laag zijn in deze test vanwege de hoge belasting die het cellichaam uitoefent op het flagellum, heeft deze test niettemin bijgedragen aan waardevolle inzichten in chemotactische reacties26,27,28,29, en blijft een geldig onderzoeksinstrument zoals hieronder besproken.
Zwermmotiliteit stelt onderzoekers voor een andere uitdaging. Selectie van gain-of-function suppressors werkt alleen in zwermen die overvloedige oppervlakteactieve stoffen produceren en gemakkelijkzwermen 13. Oppervlakteactieve niet-producenten zoals E. coli zijn kieskeurig met betrekking tot de keuze van agar, mediasamenstelling en vochtigheid van het milieu2,13,14,21. Zodra zwermcondities zijn vastgesteld, is de grensovergangstest17 een nuttige methodologie om het vermogen van een zwerm te ondervragen om door nieuwe / zware omstandigheden te navigeren. Hoewel de onderstaande protocollen betrekking hebben op E. coli, kunnen ze gemakkelijk worden aangepast voor toepassing bij andere soorten.
De isolatie en karakterisering van suppressormutaties hebben met succes bijgedragen tot het identificeren van belangrijke componenten van het chemotaxis-systeem35,36,37, evenals de motormachines zelf38,39,40. Tijdens het gebruik van Protocol 1 is het belangrijk om meerdere onafhankelijke replica’s op te nemen om de isolatie van een groo…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health grant GM118085 en gedeeltelijk door de Robert Welch Foundation (subsidie F-1811 aan R.M.H.).
Reagents | |||
Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
EDTA Disodium Salt, Dihydrate | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
Eiken agar | Eiken Chemical Co. Japan | E-MJ00 | Essential for E. coli swarming |
Glucose D (+) | Fisher Scientific | 410955000 | |
LB (Lennox) Broth | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
Materials and Equipment | |||
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) | Olympus | Or equivalent software for microscope used | |
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape | Fisher | 50-285-28 | |
Frosted microscope slides 3x1x1mm | Fisher | 12-550-343 | |
Olympus BX53 microscope | Olympus | BX53 | Any upright or inverted phase microscope can be used |
Petri dishes (100 mm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | For soft-agar assays |
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) | Perkin Elmer | 9908265 | |
Round Petri Dish with 2 Compartments | VWR | 89200-944 | For border-crossing assays |
Safety Hypodermic Needles (23G) | Fisher Scientific | 14-826A | |
Sterile Syringe – 1 mL | Fisher scientific | 14-955-450 | |
Task/Tissue wipes | Fisher scientific | 06-666 | Or equivalent single use tissue wipes |
VWR micro cover-glass 18x18mm | VWR | 48366205 | |
XM10 camera | Olympus | XM10 | Or equivalent microscope camera |