JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Undersøgelse Flagella-Driven Motility i Escherichia coli ved at anvende tre etablerede teknikker i en serie

Published: May 10, 2020
doi:
10.3791/61364
,
1Department of Molecular Biosciences,The University of Texas at Austin

Summary

Mange bakterier bruger flagella-drevet motilitet til at navigere i deres miljø og kolonisere gunstige omgivelser både individuelt og som et kollektiv. Demonstreret her er brugen af tre etablerede metoder, der udnytter motilitet som et udvælgelsesværktøj til at identificere komponenter / veje, der bidrager til svømning og sværmende motilitet.

Abstract

Motilitet er afgørende for overlevelse og succes for mange bakteriearter. Mange metoder findes for at udnytte motilitet til at forstå signalveje, for at belyse funktionen og samlingen af flagellare dele og for at undersøge og forstå bevægelsesmønstre. Her demonstrerer vi en kombination af tre af disse metoder. Motilitet i blød agar er den ældste, der tilbyder et stærkt udvalg til isolering af gain-of-function suppressor mutationer i motilitetshæmmede stammer, hvor motilitet genoprettes gennem en anden mutation. Celletrikningsteknikken, der først blev anvendt til at demonstrere flagellarmotorens roterende karakter, kan bruges til at vurdere signaleffekternes indvirkning på motorhastigheden og dens evne til at skifte rotationsretning. Den “grænseovergang” analyse er nyere, hvor svømning bakterier kan primes til overgangen til at bevæge sig kollektivt som en sværm. I kombination repræsenterer disse protokoller en systematisk og kraftfuld tilgang til at identificere komponenter i motilitetsmaskineriet og til at karakterisere deres rolle i forskellige facetter af svømning og sværm. De kan let tilpasses til at studere motilitet i andre bakteriearter.

Introduction

Bakterier anvender mange vedhæng til bevægelse og spredning i deres økologiske nicher1. Flagella-drevet motilitet er den hurtigste af disse, fremme koloniseringen af gunstige lokaliteter som reaktion på miljøsignaler og bidrage væsentligt til visse arters patogene evne2,3. Flagellerede bakterier kan svømme individuelt i bulk væske, eller sværme som et kollektiv over en halvfast overflade4. Ekstracellulær flagella fastgøres til og drives af roterende motorer indlejret i membranen, som udnytter iongradienternes kraft til at generere drejningsmoment, der forårsager rotation1,2,4,5,6,7,8. I E. coli, hvis motorer kører med konstant drejningsmoment9, kan motoreffekten kategoriseres i rotationshastighed og skift af rotoren mellem mod uret (CCW) og med uret (CW) retninger. CCW-rotation fremmer dannelsen af et sammenhængende flagellarbundt, der driver cellen fremad (løb), mens en forbigående kontakt i rotationsretning (CW) får bundtet til at adskille enten delvist eller fuldt10, og cellen til at omlægge sin svømmeretning (tumble). E. coli kører typisk et sekund og tumler i en tiendedel af et sekund. Koblingsfrekvensen for rotoren eller »tumble bias« styres af chemotaxis-signalsystemet, hvor transmembrane-systemerne registrerer eksterne kemiske signaler og sender dem via fosfor til flagellarmotoren for at udvide kørsler som reaktion på tiltraktrens eller undertrykke dem som reaktion på giftige kemikalier11,12. Svømning motilitet er analyseret i 0,3% blød agar.

Under sværmer, bakterier navigere på en halvfast overflade som en tæt kollektiv, hvor pakninger af bakterier strøm i en kontinuerlig hvirvlende bevægelse2,13,14,15. E. coli sværme udviser ændret kemosensorisk fysiologi (lavere tumble bias), højere hastigheder, og højere tolerance over for antimikrobielle stoffer over celler svømmer i bulk væske16,17. Sværme varierer i deres indsættelse af en overflod af strategier, støtte bevægelse, herunder overfladeaktiv produktion, hyperflagellation, og celle forlængelse2. Swarming giver bakterier en konkurrencemæssig fordel i både økologiske og kliniske indstillinger18,19,20. Der er to kategorier af sværmende bakterier: tempererede sværme, som kun kan sværme på medier størknet med 0,5-0,8% agar og robuste sværme, som kan navigere på tværs af højere agarkoncentrationer21.

En række assays findes for at afhøre svømning motilitet og dens regulering. Når den er svækket af mutationer eller miljøforhold, tilbyder motiliteten i sig selv et stærkt udvalg til at identificere forstærkning af funktionsundertrykkermutationer. Disse undertrykkere kan være ægte revertants af den oprindelige mutation, eller pseudo-revertants, hvor en anden mutation genopretter funktionalitet. Sådanne mutanter kan identificeres ved hele genomsekvensering (WGS). Et alternativ til upartisk suppressor udvælgelse er en forudindtaget målrettet mutagenesis strategi (f.eks PCR mutagenesis). Disse metoder kaster ofte lys over motilitetsapparatets funktion eller miljøregulering. Hvis målet er at studere motorisk funktion, så restaurering af vilde-type motilitet målt i blød agar kan ikke nødvendigvis angive restaurering af vilde-type motoriske output. Celle-tøjring assay, hvor cellerne er knyttet til en glasoverflade af en enkelt flagellum og rotation af cellekroppen er efterfølgende overvåges, kan være den oprindelige analyse af valg til vurdering af motorisk adfærd. Selv om mere avancerede metoder er nu tilgængelige til at overvåge motoriske egenskaber, den nødvendige højhastighedskamera set-up og anvendelse af softwarepakker til bevægelse analyse begrænse deres udbredte brug22,23,24,25. Den celle-tøjring assay kræver kun, at flagella skal klippes, så fastgørelse af de korte filamenter til et glas dias, efterfulgt af videooptagelse rotation af cellehuset. Selv om de registrerede motorhastigheder er lave i denne analyse på grund af den høje belastning, som cellekroppen udøver på flagellum, har denne analyse ikke desto mindre bidraget til værdifuld indsigt i kemotaktiske reaktioner26,27,28,29, og forbliver et gyldigt efterforskningsværktøj som beskrevet nedenfor.

Sværmende motilitet udgør et andet sæt udfordringer for forskere. Udvælgelse af gain-of-funktion undertrykkere virker kun i sværme, der producerer rigelige overfladeaktive stoffer og sværm let13. Overfladeaktive ikke-producenter som E. coli er kræsne med hensyn til valget af agar , mediesammensætning og fugtighed i miljøet2,13,14,21. Når sværmende forhold er etableret, grænseovergangen assay17 er en nyttig metode til at afhøre muligheden for en sværm til at navigere nye / barske forhold. Selv om nedenstående protokoller vedrører E. coli, kan de let tilpasses til anvendelse i andre arter.

Protocol

1. Isolering af suppressor mutanter i motilitet-mangelfulde stammer BEMÆRK: Brug denne metode som en bred ‘catch-all’ til at identificere den generelle karakter af motilitetsdefekten. Forberedelse af soft-agar pladeBEMÆRK: Soft-agar, også kaldet motilitet- eller svømme-agar, er en lav procentdel agar (~ 0,2-0,35% w / v), længe brugt til at analysere chemotaxis31,32. Der tilsættes 3 g bacto-a…

Representative Results

Isoleringen af pseudo-revertanter i en E. coli stamme, hvis motilitet er svækket af høje niveauer af signalmolekylet c-di-GMP, blev beskrevet i det seneste arbejde fra vores laboratorium34. Denne stamme (JP1442) husede to mutationer: ΔyhjH og ΔycgR. YhjH er den mest aktive phosphodiesterase, der nedbryder c-di-GMP i E. coli. Fravær af YhjH fører til forhøjede c-di-GMP niveauer og hæmning af motilitet. YcgR er en c-di-GMP-effektor. I komplekset med c-di-G…

Discussion

Isolation og karakterisering af suppressormutationer har med succes bidraget til at identificere nøglekomponenter i chemotaxis-systemet35,36,37, samt selve motormaskineriet38,39,40. Mens du bruger protokol 1, er det vigtigt at inkludere flere uafhængige replikater for at sikre isolering af et stort spektrum af mulige mutationer, der k…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud GM118085 og dels af Robert Welch Foundation (tilskud F-1811 til R.M.H.).

Materials

Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe – 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. . E. coli in Motion. 1 edn. , (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A “bucket of light” for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a “backstop brake” mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a “run-reverse-turn” mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).

Tags

Escherichia ColiFlagellaMotilitySwarm PlatesSoft AgarHard AgarSuppressor MutantsMotility BufferCentrifugationMicroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image