Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersøker Flagella-drevet motilitet i Escherichia coli ved å bruke tre etablerte teknikker i en serie

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61364
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Summary

Mange bakterier bruker flagelladrevet motilitet for å navigere i miljøet og kolonisere gunstige omgivelser både individuelt og som kollektiv. Demonstrert her er bruk av tre etablerte metoder som utnytter motilitet som et utvalgsverktøy for å identifisere komponenter / veier som bidrar til svømming og swarming motility.

Abstract

Motilitet er avgjørende for overlevelse og suksess for mange bakterielle arter. Mange metoder eksisterer for å utnytte motilitet for å forstå signalveier, for å belyse funksjonen og monteringen av flagellardeler, og for å undersøke og forstå bevegelsesmønstre. Her demonstrerer vi en kombinasjon av tre av disse metodene. Motilitet i myk agar er den eldste, og tilbyr et sterkt utvalg for å isolere gain-of-function suppressor mutasjoner i motility-svekkede stammer, hvor motilitet gjenopprettes gjennom en annen mutasjon. Celle-tethering teknikken, først brukt til å demonstrere den roterende naturen til flagellarmotoren, kan brukes til å vurdere virkningen av signaleffektorer på motorhastigheten og dens evne til å bytte rotasjonsretning. Den "grenseoverskridende" analysen er nyere, hvor svømmebakterier kan primes til å gå over til å bevege seg kollektivt som en sværm. I kombinasjon representerer disse protokollene en systematisk og kraftig tilnærming til å identifisere komponenter i motilitetsmaskineriet, og å karakterisere deres rolle i forskjellige fasetter av svømming og swarming. De kan lett tilpasses for å studere motilitet i andre bakteriearter.

Introduction

Bakterier bruker mange vedlegg for bevegelse og spredning i sine økologiske nisjer1. Flagella-drevet motilitet er den raskeste av disse, fremmer koloniseringen av gunstige lokaliteter som svar på miljøsignaler, og bidrar betydelig til den patogene evnen til noen arter2,3. Flagelerte bakterier kan svømme individuelt i bulkvæske, eller sverme som et kollektiv over en halvfast overflate4. Ekstracellulær flagella festes til og drives av roterende motorer innebygd i membranen, som utnytter kraften til iongradienter for å generere dreiemoment som forårsaker rotasjon1,2,4,5,6,7,8. I E. coli, hvis motorer kjører med konstant dreiemoment9, kan motorutgangen kategoriseres når det gjelder rotasjonshastighet og veksling av rotoren mellom retninger mot klokken (CCW) og med klokken (CW). CCW-rotasjon fremmer dannelsen av en sammenhengende flagellarbunt som driver cellen fremover (kjør), mens en forbigående bryter i rotasjonsretning (CW) får bunten til å demontere enten delvis eller helt10, og cellen til å reorientere svømmeretningen (tumble). E. coli løper vanligvis et sekund og snubler i en tiendedel av et sekund. Koblingsfrekvensen til rotoren eller "tumble bias" styres av chemotaxis-signalsystemet, hvor transmembrane chemoreceptorer oppdager eksterne kjemiske signaler og overfører dem via fosforelegg til flagellarmotoren for å forlenge løp som svar på tiltrekningsmidler, eller undertrykke dem som svar på giftige kjemikalier11,12. Svømmemotilitet er analysert i 0,3% myk agar.

Under swarming navigerer bakterier på en halvfast overflate som et tett kollektiv, hvor pakker med bakterier strømmer i en kontinuerlig virvlende bevegelse2,13,14,15. E. coli svermer viser endret kjemosensorisk fysiologi (lavere tumble bias), høyere hastigheter, og høyere toleranse for antimikrobielle over celler som svømmer i bulkvæske16,17. Svermere varierer i utplasseringen av en mengde strategier som hjelper bevegelse, inkludert overflateaktiv produksjon, hyperflagellasjon og celleforlengelse2. Swarming tilbyr bakterier et konkurransefortrinn i både økologiske og kliniske omgivelser18,19,20. Det er to kategorier av swarming bakterier: tempererte svermere, som bare kan svømme på media størknet med 0,5-0,8% agar og robuste svermere, som kan navigere over høyere agarkonsentrasjoner21.

Det finnes en rekke analyser for å forhøre svømmemotiliteten og reguleringen. Når det er svekket av mutasjoner eller miljøforhold, tilbyr motilitet i seg selv et sterkt utvalg for å identifisere gain-of-function suppressor mutasjoner. Disse undertrykkerne kan være ekte revertanter av den opprinnelige mutasjonen, eller pseudo-revertanter, der en annen mutasjon gjenoppretter funksjonaliteten. Slike mutanter kan identifiseres ved hele genomsekvensering (WGS). Et alternativ til objektivt valg av undertrykker er en partisk målrettet mutagenesestrategi (f.eks. PCR-mutagenese). Disse metodene kaster ofte lys over funksjonen eller miljøreguleringen av motilitetsapparatet. Hvis målet er å studere motorisk funksjon, kan restaurering av villtype motilitet målt i myk agar ikke nødvendigvis indikere restaurering av villmotorutgang. Celle-tethering analysen, der celler er festet til en glassoverflate med et enkelt flagellum og rotasjon av cellekroppen overvåkes senere, kan være den første analysen du velger for å vurdere motorisk oppførsel. Selv om mer avanserte metoder nå er tilgjengelige for å overvåke motoregenskaper, begrenser det nødvendige høyhastighetskameraoppsettet og anvendelsen av programvarepakker for bevegelsesanalyse deres utbredte bruk22,23,24,25. Den celle-tethering analysen krever bare at flagellaen skal skjæres, slik at vedlegg av de korte filamentene til et glasssklie, etterfulgt av videoopptak av rotasjonen av cellekroppen. Selv om de registrerte motorhastighetene er lave i denne analysen på grunn av den høye belastningen cellekroppen utøver på flagellumet, har denne analysen likevel bidratt til verdifull innsikt i kjemoaktiske responser26,27,28,29, og forblir et gyldig undersøkende verktøy som diskutert nedenfor.

Swarming motility utgjør et annet sett med utfordringer for forskere. Utvalg av gain-of-function suppressors fungerer bare i svermere som produserer store overflateaktive stoffer og sverm lett13. Overflateaktive ikke-produsenter som E. coli er begeistret med hensyn til valg av agar, mediesammensetning og fuktighet i miljøet2,13,14,21. Når svermende forhold er etablert, er grenseovergangsanalysen17 en nyttig metodikk for å forhøre en sværms evne til å navigere nye / tøffe forhold. Selv om protokollene som presenteres nedenfor er relatert til E. coli, kan de lett tilpasses for bruk i andre arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering av undertrykkermutanter i motilitetsmangel

MERK: Bruk denne metoden som en bred "catch-all" for å identifisere den generelle karakteren av motilitetsfeilen.

  1. Myk agarplate forberedelse
    MERK: Soft-agar, også referert til som motility- eller swim-agar, er en lav prosentandel agar (~ 0,2-0,35% m / v), lenge brukt til å analyse chemotaxis31,32.
    1. Tilsett 3 g bacto-agar (0,3% m/v) og 20 g LB i en 2 L rund bunnflaske. Tilsett 1 L ddH2O (dobbeltdestillert vann) i kolben og bland suspensjonen jevnt med en rørestang og magnetisk røreplate.
    2. Autoklav i 20 min ved 121 °C.
    3. La det avkjøles med forsiktig omrøring ved hjelp av stangen/platen som ovenfor. Når temperaturen når ca. 50 °C, hell 25 ml i sterile Petri-retter (100 mm x 15 mm), og la den smeltede agaren sette med lokket på plass i minst 1 time, for bruk innen 16 timer.
  2. Kulturforberedelse, inokulasjon og isolering av undertrykkermutanter
    MERK: E. coli inokulert i midten av næringsrike medier størknet med myk agar forbruker næringsstoffer lokalt, og skaper en næringsgradient som de følger. Når de beveger seg utover, vises definerte "ringer" (Figur 1A), som er relatert til spesifikke kjemoattractants bakteriene reagerer på. Defekter i enten chemotaxis-systemet eller strukturelle komponenter i flagellamotoren kan kompromittere ytelsen i denne analysen. Mutanter med en bevegelighetsfordel oppstår ofte under screening, og kan ses komme fra enkelt eller fra flere punkter langs periferien av ringen, hvorfra de "blusser" ut (Figur 1C). Man vil legge merke til at den ytterste kanten av svømmefronten kontrasterer lett mot den ukkoloniserte jomfrumyke agaren.
    1. Vokse over natten kulturer av ønsket motility-mangelfull belastning i 5 ml Lennox Broth (LB; 10 g / L tryptone, 5 g / L gjær ekstrakt, og 5 g / L NaCl, Tabell over materialer) ved 30 °C med horisontal risting (220 r.p.m.). Neste dag vokser underkulturen (1:100 fortynning) i fersk LB, under samme forhold til eksponentiell fase (OD600 av 0,6).
    2. Inokuler 6 μL av kulturen inn i midten av en myk agarplate (1.1) ved hjelp av en pipette, og skyv den lastede sterile spissen inn i agaren for å forsiktig utvise innholdet. Overfør til 30 °C og inkuber (Figur 1B), til motilitetsblussene er tydelige, som kommer fra inokulasjonspunktet eller periferien av motilitetsringene, vanligvis i 24-36 timer (figur 1C).
      MERK: I motilitetsanalyser inokulerer du en vill-type belastning sammen med mutantisolasjoner for sammenligning. Denne villtypestammen vil vise de karakteristiske konsentriske kjemoaktiske ringene (figur 1A) og fylle platen innen 8-10 timer.
    3. Bruk en steril trådsløyfe til å løfte cellene fra "fakkel" -regionen og streken for å rense enkeltkolonier på en LB hard agarplate (LB fremstilt som ovenfor, størknet med 15 g / l bacto-agar).
    4. Velg enkeltkolonier fra strekplaten ved hjelp av en steril trådsløyfe og rens på nytt ved å strekke for enkeltkolonier for å sikre isolering av en "ren" koloniisolering.
  3. Bekreftelse og karakterisering av mutanter for undertrykkere
    1. Bekreft at de isolerte undertrykkermutantene har gjenopprettet motiliteten. Forbered myke agarplater (1,1) og kulturer for interessestammer (som i 1.2.1), inkludert villtype og den startende 'motility-mangelfulle' belastningen for sammenligning.
    2. Inokuler platene (som i 1.2.2) og inkuber ved 30 °C i 8-10 timer.
    3. Registrer diameteren på den ytterste ringen (kanten av sirkelen) og sammenlign med å fastslå hvilken av isolasjonene som har vesentlig restaurert motilitet.
      MERK: Det anbefales at plater fotograferes gjennom hele eksperimentets løpetid. For best resultat, bruk en "bøtte med lys" enhet30, der et digitalt kamera er montert over en lyskilde for bedre belysning for å måle diameteren på svømmekolonien og skille den fra ukkolonialisert agar.
    4. Emne bekreftet isolerer til WGS etter behov, noe som gjør det mulig for tilstrekkelig 'sekvensdekning' å identifisere mutasjonene som gjenopprettet wild-type-funksjonen positivt.

2. Kvantifiserende flagella motorisk oppførsel via celle tethering

MERK: Bruk denne metoden når normal kjøre-tumble oppførsel (chemotaxis) synes å være kompromittert.

  1. Kulturforberedelse og flagellaskjæring
    1. Forbered en eksponentiell fasekultur av interessestammen som beskrevet i trinn 1.2.1.
    2. Pellet 10 ml celler ved sentrifugering ved 2000 x g i 3 minutter før resuspending i 10 ml filtersterilisert motilitetsbuffer (MB; 10 mM kaliumfosfatbuffer [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl).
      MERK: MB støtter motilitet, men støtter ikke bakterievekst
    3. Gjenta trinn 2.1.2 to ganger til før du bruker den endelige pelletsen på nytt i 1 ml MB.
    4. Overfør celleopphenget til en 1 ml sprøyte og fest en 23G nål til enden. Monter et identisk sprøyte-/nåleapparat og fest de to sammen via 6 tommer polyetylenrør (indre diameter på 0,58 mm) tett kledd over hver nålespiss.
    5. Skjær flagellaen (de er skjøre og brekk lett) ved å forsiktig passere celleopphenget frem og tilbake fra en sprøyte til den andre 50x, med 1 min pauser mellom hver 10 passerer.
    6. Sentrifuger de skjærede cellene ved 2000 x g i 3 minutter og resuspend i et sluttvolum på 500 μL MB.
  2. Klargjøring av lysbilder og cellekobling
    1. Forbered et cellefikseringskammer ved å stable en 18 mm x 18 mm deksleslip over en 3 x 1 tomme x 1 mm glassmikroskopsklie, atskilt med dobbeltsidig tape (Figur S1).
    2. Skyll kammeret med 0,01% (w/v) polylyinoppløsning ved å påføre toppen av kammeret. Vipp den nederste kanten (dekslene med mikroskopet skyv) på en oppgavevisker (vevspapir) for å hjelpe til med å tegne løsning gjennom kammeret (Figur S1). Deretter inkuberes ved romtemperatur i 10 min.
    3. Vask kammeret tre ganger med 40 μL MB ved bruk som beskrevet i trinn 2.2.2
    4. Tilsett 40 μL av den skjærede cellefjæringen (fremstilt ovenfor) til toppen av kammeret og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter for å la cellene feste seg til dekslene.
    5. Skyll kammeret forsiktig med 40 μL MB som i 2,2,3 for å fjerne ikke-tilknyttede celler.
  3. Registrering og kvantifisering av cellerotasjon
    1. Overfør mikroskopets lysbilde lastet med tethered celler til mikroskopstadiet.
    2. Bruk fasekontrastmikroskopi og et mål på 100x, skann populasjonen etter celler som er festet på plass, og roter på en enkelt akse, det vil si jevne rotasjoner på et fast punkt i stedet for å presentere i en vinkel der cellen beveger seg inn og ut av fokus (Video 1).
    3. Bruk et kommersielt mikroskop og tilhørende kamera. Åpne den tilknyttede programvaren, sørg for at celler av interesse er i fokus og klikk videooppkjøp for å registrere cellerotasjonen i ett minutt (med 10 bilder per sekund eller høyere).
    4. Fra videoavspilling kvantifiserer du antall fullstendige rotasjoner per minutt og antall ganger cellen endrer retning (koblingsfrekvens).
      MERK: Rotasjonshastigheter og koblingsfrekvens kan være for raske til å måle med øye, så det anbefales å bruke videoprogramvare som tilbyr langsom / fin avspilling, eller vedtar et automatisert programvaresystem for å kvantifisere rotasjonsmønstre33. Et alternativ ville være å øke viskositeten til MB ved hjelp av metylcellulose (eller lignende middel) for å bidra til å bremse og løse rotasjonen av raskere bakterier eller kompensere når kameraer med lave bildefrekvenser er i bruk.
    5. Gjenta trinn 2.3.2 med biologiske repliker for å kompilere en representasjon av interessepopulasjonen.

3. Forberedelse av sværmer i en grensekryssende analyse

MERK: Bruk denne metoden for å vurdere virkningen av en mutasjon eller tilstand på gruppemotilitet. Swarm-agar refererer til agar hvor prosentandelen vanligvis er høyere enn for myk agar. I myk agar (0,3 %)svømmer cellene individuelt inne i agaren. I swarm agar (0,5% og over) beveger cellene seg som en gruppe på overflaten. Mens svermplater må brukes som beskrevet her, har svømmeplater lengre holdbarhet, og kan brukes i flere dager. Vår personlige preferanse er å bruke om 1-2 dager.

  1. Forberedelse av sværm agar
    1. Tilsett 5 g Eiken agar (0,5% m/v) og 20 g LB i en 2 L rund bunnflaske. Tilsett 1 L ddH2O i kolben og bland suspensjonen jevnt ved hjelp av en rørestang og magnetisk røreplate.
    2. Autoklav i 20 min ved 121 °C.
    3. La det avkjøles med forsiktig omrøring for å unngå luftbobler ved hjelp av stangen/platen som ovenfor. Når ca. 50 °C tilsett filtersterilisert glukose for en endelig konsentrasjon på 0,5 %.
    4. Hell 25 ml i sterile Petri-retter (100 mm x 15 mm) og la det stilles inn ved romtemperatur i minst 14 timer og ikke mer enn 20 timer. Må ikke oppbevars for fremtidig bruk.
  2. Inokulering og inkubasjon av svermplater
    1. Inokuler 6 μL av en midteksponentiell kultur (tilberedt som i 1,2) ved å se på toppen av agaren.
    2. La lokket stå av i 5-10 min og skift ut når inokulumet har tørket inn i agaroverflaten.
    3. Inkuber ved 30 °C i 8 timer. Unngå fristelsen til å inspisere sværmfremdriften ved å fjerne lokket, da dette vil bidra til tørking av agaren og svekke swarming.
      MERK: Inkubasjonstiden kan variere avhengig av stammefenotypen. Noen isolerte mutasjoner kan hemme swarming evne og vil kreve en redusert prosentandel av agar eller en mer langvarig periode med inkubasjon.
  3. Utarbeidelse av grensekryssende analyseplater
    MERK: Denne analysen benytter en modifisert Petri-tallerken, der et plastskille (kant) skaper to kamre, i stedet for ett (figur 2A). Hvert kammer kan tilberedes uavhengig av det andre, og tilbyr forskjellige forhold for swarming, før du "kobler" de to. Avhengig av eksperimentell design, kan det første kammeret (utpekt til venstre) tilberedes med enten svømmeagar (0,3% m / v) eller svermagar (0,5% m / v) hvorfra bakteriene kan migrere over grensen til høyre kammer som inneholder svermagar +/- ethvert nødvendig supplement eller utfordring (f.eks. antibiotika). Migrasjon på en av agarene måles vanligvis/sammenlignes ved å registrere den bredeste diameteren av bakteriell kolonisering (kant til kant) fra det opprinnelige inokulasjonspunktet.
    1. Forbered svømmeagaren som beskrevet i 1.1 om nødvendig.
    2. Forbered sværm agar som beskrevet i 3.1.
    3. Hell ~30 ml svermagar (med ønsket tilskudd om nødvendig) inn i høyre kammer på en Petri-tallerken med to rom (100 mm x 15 mm), til det punktet hvor den er i vater med plastskilleren mellom kamrene, men ikke overløp til venstre (Figur 2B).
    4. Etter at agaren er herdet, fyll venstre kammer med ~ 30 ml svømme eller sverm agar, igjen til kontaktpunktet med plastskillet (Figur 2C). Før den setter, bruk en steril pipettespiss til forsiktig å dra agaren over kanten for å koble de to sidene til en ~ 1 mm høy agarbro som strekker seg over hele lengden av skillet (Figur 2D).
    5. La platen tørke ved romtemperatur (3.1).
      MERK: En alternativ metode for å lage bro er å la venstre kammeragar tørke og deretter sakte pipette ~ 100 μL smeltet sværm agar langs plastdeleren for å bygge bro over de to kamrene (3,4). Inokuler platene på venstre kammer som beskrevet ovenfor for svømming (1.2.2) eller sverm (3.2) agar, før du inkuberer ved 30 °C i 12-16 timer, eller til sværmer har gjort tilstrekkelig fremgang over høyre kammer for å tillate sammenligninger mellom interessestammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av pseudo-revertanter i en E. coli-stamme hvis motilitet er svekket av høye nivåer av signalmolekylet c-di-GMP, ble detaljert i nyere arbeid fra laboratoriet vårt34. Denne stammen (JP1442) inneholdt to mutasjoner: ΔyhjH og ΔycgR. YhjH er den mest aktive fosfodiesterase som forringer c-di-GMP i E. coli. Fravær av YhjH fører til forhøyede c-di-GMP nivåer og hemming av motilitet. YcgR er en c-di-GMP-effektor. I kompleks med c-di-GMP binder YcgR seg til flagellarrotoren for først å indusere CCW-motorrotasjon og deretter redusere motorhastigheten. Celle tethering og perle analyser viste at motorisk oppførsel returnerte til normal i dobbelt mutant, men motilitet i myk agar gjorde ikke34. Så vi distribuerte trinn 1 av protokollen for å isolere pseudo-revertantbluss i dobbeltmutanten (figur 1C). De fleste mutasjonene som er kartlagt av WGS (HiSeq 4000-plattformen, PE 2 x 150-oppsett34) til rssB, hvilke koder for en responsregulator/ adapterprotein som normalt leder ClpXP-protease til mål σS for nedbrytning34. En av disse revertantene, som viste motilitet nær wild-type (AW405, sammenlign figur 1A,D), ble brukt til å generere representative resultater for trinn 2 og 3 i protokolldelen, ved hjelp av som kontroller både den doble mutantforelderen (figur 1B) og isogene villtypestamme (figur 1A).

For trinn 2 i protokolldelen ble videoopptak analysert for å beregne rotasjoner per minutt (hver 360° fullstendig rotasjon) og CWBias (brøkdelen av tidsmotorer roterer i en CW-retning eller tommelskjevhet). ΔyhjH viste færre rotasjoner per minutt og en lavere faktisk vekt-bias sammenlignet med den ville typen, som forventet (figur 3). Både ΔyhjH ΔycgR dobbeltmutant og dens undertrykker viste motorisk oppførsel som ligner på villtype, observasjoner støttet av en tidligere analyse ved hjelp av den høyere oppløsningen 'perle' analyse beskrevet i introduksjonen ovenfor i tidligere arbeid34.

For trinn 3 i protokolldelen ble grenseoverskridende analyse (figur 2) brukt til å sammenligne evnene til den ville typen og undertrykkeren isolere, først å sverme, og deretter å bevege seg over grensen og sverme på agar supplert med kanamycin. Resultatene viser at begge stammene nådde grensen på et lignende tidspunkt (data ikke vist) noe som indikerer lignende grad av swarming fra et identisk inokulasjonspunkt. Imidlertid var krysset av sværmen til høyre (antibiotika) kammer marginalt, men konsekvent større for wild-typen enn undertrykkeren ved 20 μg / ml kanamycin (Figur 4). Forskjellen mellom de to stammene var mer uttalt ved 40 μg/ml kanamycin. Sammen antyder disse dataene at mutasjonene i rssB som gjenopprettet motilitet på myke agarplater (Figur 1D), negativt påvirker antibiotikaresistensen til undertrykkerstammen under swarming (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Myke agarmotilitetsanalyser og fremveksten av undertrykkerbluss.
Platene inneholder LB størknet med 0,3 % m/v agar. E. coli stammer ble inokulert i midten av hver plate og inkubert ved 30°C i 8 h, bortsett fra C, som ble inkubert i 16 h. (A) Wild-type E. coli (AW405). (B) Motility-mangelfull variant ∆yhjH ∆ycgR (JP1442). (C) Som i B, unntatt lengre inkubasjonstider. Piler peker på raskere bevegelige "bluss" som dukker opp ved den perifere ringen til den ekspanderende svømmekolonien. (D) En undertrykker isolert fra et bluss i C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk for å sette opp en grenseoverskridende plateanalyse.
(A) Hell ~30 ml svermagar (med ønsket antibiotika) inn i høyre kammer på en delt petriskål til den er på nivå med plastdeleren og la den stilles inn med lokket lukket. (B) Fyll venstre kammer med ~30 ml svømming eller sverm agar til kontaktpunktet med toppen av plastskilleren. (C) Bruk en steril pipettespiss til forsiktig å dra den smeltede svermagaren over grensen, og koble dermed de to sidene til en ~1 mm høy agarbro og la den stilles inn med lokket lukket. (D) La platen tørke ytterligere ved romtemperatur over natten før du inokulerer venstre kammer med ønsket belastning, og inkuberer ved 30 °C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Motoregenskaper for ulike stammer målt ved celle-tethering-teknikken.
Wild-type (AW405), ∆yhjH (VN133), ∆ycgR ∆yhjH (JP1442), og dens undertrykker (JP1836) ble dyrket i LB ved 30 °C til midteksponentiell fase før tethering. (A) Rotasjoner per minutt (fullførte 360° svinger), og (B)CW-bias (brøkdel av tidsmotorer roterer i en faktisk vekt-retning). Standardavvik for gjennomsnittet (±). 20 tethered celler ble observert i 60 sek i hver stamme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Grensekryssende analyser.
Midteksponentielle fasekulturer av wild-type E. coli (AW405) og undertrykkermutanten (JP1836) ble inokulert i den angitte posisjonen (*) i venstre rom på den delte platen som inneholder sværmmedier, og inkubert ved 30 °C. De nådde grensen til sammenlignbare tider. Platene ble inkubert i ytterligere 6 timer, hvor sværmen krysset over til høyre kammer, der media ble supplert med kanamycin (Kan; tall indikerer μg / ml). Plater er representative for tre biologiske repliker som hver utføres i triplikat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Klargjøring av et kammersklie for cellekobling. (A) Legg ned to stykker dobbeltsidig tape før (B) ved hjelp av et barberblad for å trimme bort overskuddet. (C) Fjern det øverste laget for å eksponere limet før (D) fester en deksleslip og trykk det forsiktig på plass (angitt av [ ), og sørg for at all luft skyves ut av grensesnittet mellom dekslene og båndet nedenfor. (E) Lastprøve (vist her med DNA-lastfargestoff [30% v/v glyserol, 0,25% m / v bromofenol blå, og 0,25% m / v xylen cyanol] lagt til for å hjelpe visualisering) inn i toppen av den opprettede kanalen (pilen) mens (F) vinker på ren, vev oppgave tørk for å hjelpe tegne løsningen gjennom kammeret som vevet absorberer væsken (pilen) i kanalen og trekker den gjennom. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Video 1: Rotasjon av tethered E. coli-celler. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: En aktiv E. coli-sverm filmet under 60x forstørrelse, og demonstrerer sin karakteristiske virvlende bevegelse bak kanten av den bevegelige fronten. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Isolasjon og karakterisering av undertrykkermutasjoner har med hell bidratt til å identifisere nøkkelkomponenter i chemotaxis-systemet35,36,37, samt selve motormaskineriet38,39,40. Når du bruker protokoll 1, er det viktig å inkludere flere uavhengige repliker for å sikre isolering av et stort spekter av mulige mutasjoner som kan kompensere for tap av motilitet. Å øke antall bakterier ved å strekke kulturen i en linje i stedet for et sted, kan forbedre oddsen for å generere undertrykkere41. Isolering av samme mutasjon (som bestemt av DNA-sekvensering) flere ganger øker tilliten til ektheten. WGS vil alltid avsløre tilstedeværelsen av andre mutasjoner i genomet. Det er derfor viktig å verifisere resultatene ved å transdusere (der det er mulig) den identifiserte mutasjonen tilbake til den opprinnelige motilitetsmangelbakgrunnen. Undertrykkeren mutant tilnærming er forankret i å gjenopprette funksjonen gjennom en sekundær mutasjon, så en begrensning av denne metoden er at hvis et kritisk strukturelt gen slettes, det vil si en som underbygger hele banen eller strukturen, kan det ikke være rom for kompensasjon. Til tross for å være en gammel metode, viser vårt nylige arbeid34 sitt fortsatte nytte i belysning av nye veier som bidrar til bakteriell bevegelighet.

For kvantifisering av motorutgangen forblir celle-tethering-tilnærmingen et universelt tilgjengelig verktøy som bare krever et mikroskop med kamerafeste. Celletetring har allerede blitt brukt i et mangfoldig antall bakteriearter, inkludert Salmonella42, Pseudomonas43, Streptococcus44og Rhodobacter33. Suksessen til protokollen er i stor grad betinget av riktig skjæring og vedlegg av celler. Skråstilling for aggressivt eller utelate pausen mellom saks (2.1.5) har en tendens til å fremme inkonsekvent eller ufullstendig skjæring av filamenter, noe som resulterer i ikke-motile celler eller celler bundet på en skjev akse. Den varige relevansen av denne protokollen forblir, til tross for vedtakelsen av den høyere oppløsningen perleanalyse av mange forskningsgrupper (inkludert vår). Den primære begrensningen av perleanalysen kommer fra behovet for at perlen holder seg til filamentet av bakteriene av interesse. Denne teknikken har hatt stor nytte av studier i E. coli som identifiserte en "klebrig" flagellin allele, noe som letter overholdelse45. Den klebrige varianten er også overlegen i celle-tethering analysen. En slik variant er ennå ikke tilgjengelig for de fleste flagelerte bakterier. Situasjonen er komplisert videre med noen organismer som har flere flagellinproteiner46, og når det gjelder Vibrio sp., har også en membranøs kappe47. Celle-tethering kan også utføres ved hjelp av et artsspesifikt anti-flagellin antistoff eller et antistoff mot en konstruert epitop tag.

Mens bakterier kan svømme umiddelbart etter introduksjon til et flytende medium, gjelder dette ikke for swarming, hvor celler først må primes i en swarming tilstand. Overflatekontakt utløser en fysiologisk endring som kreves for at celler skal starte sverming48,49,50,51, noe som resulterer i en forsinkelsesfase og en opphopning av høy celletetthet. Fysiologiske endringer inkluderer ombygging av kjemoaksesystemet i E. coli16, og tilpasninger som celleforlengelse og/eller hyperflagellasjon for andre bakterier13,14,21. Gitt de fysiologiske endringene som kreves for å initiere swarming, slår vi et forsiktighetsnotat om studier som har forsøkt å etterligne utvalgte fasetter av swarming - for eksempel høy tetthet eller økt cellelengde - ganske enkelt ved å konsentrere planktoniske cellekulturer for å øke tettheten, og / eller indusere celleforlengelse ved bruk av antibiotika som hemmer celledeling52,53. Hvis du bruker celleforlengelse som markør, advarer vi også om at sammenlignet med planktoniske celler, er det bare en marginal økning i gjennomsnittlig lengde på swarmerceller i Salmonella eller E. coli54. Svermanalyser er vanskeligere å etablere enn svømmeanalyser. Variabler inkluderer den kommersielle kilden til agaren som brukes til å størkne media (den spesielle Eiken agar er viktig for swarming i E. coli, mens den mer standard Difco agar støtter swarming for alle andre bakterier), bruk av rike versus minimale medier (E. coli og Salmonella krever glukosetilskudd), og mest kritisk omgivende fuktighet2,13,14,21. Av disse kan det være mest frustrerende å opprettholde optimal fuktighet. [En utmerket, metodisk, optimalisering for swarming i en organisme av valg (Pseudomonas aeruginosa) har blitt demonstrert av Morales-Soto og medarbeidere55.] Swarm media må være tilstrekkelig fuktig til å fremme swarming, men ikke så fuktig som å tillate passiv spredning / glidning, som lett kan forveksles med aktiv swarming56. Det er derfor kritisk at svermer kontrolleres under et mikroskop for å bekrefte de distinkte bevegelsesmønstrene knyttet til denne kollektive motiliteten (Video 2). Temperatur er også et viktig hensyn for å optimalisere den svermende analysen. Høyere temperaturer, for eksempel 37 °C, vil tørke ut platene tidligere enn ved 30 °C. Bruk av en inkubator med fuktighetskontroll (~70-80%) kan bidra til å redusere disse problemene, inkludert sesongmessige endringer som kan påvirke indre bygningstemperaturer og fuktighet. Når det er vellykket etablert, gir protokoll 3 en kraftig måte å undersøke en av de mest interessante aspektene ved swarming bakterier, forhøyet motstand mot antibiotika17. Alle protokoller beskrevet her kan brukes på nye organismer for å identifisere veier som spesifiserer og kontrollerer flagella mediert motilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant GM118085 og delvis av Robert Welch Foundation (grant F-1811 til R.M.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe - 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. E. coli in Motion. 1 edn. , Springer-Verlag. New York. (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).

Tags

Biologi Utgave 159 bakterier chemotaxis Escherichia coli flagella roterende motor motilitet svømming swarming overflatesensor overflatemotilitet
Undersøker Flagella-drevet motilitet i <em>Escherichia coli</em> ved å bruke tre etablerte teknikker i en serie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Partridge, J. D., Harshey, R. M.… More

Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter